Ćwiczenie 12 Krew - środowisko wewnętrzne ustroju. Transport gazów oddechowych. Zagadnienia teoretyczne 1. Połączenia hemoglobiny z tlenem. Dysocjacja hemoglobiny: 1.1. Różnica między dysocjacją oksyhemoglobiny w wodzie destylowanej i w warunkach ustrojowych. 1.2. Maksymalne wysycenie hemoglobiny tlenem. 1.3. Prawo Bohra. 1.4. Wpływ zakwaszenia i temperatury na dysocjację oksyhemoglobiny. 1.5. Znaczenie biologiczne powinowactwa hemoglobiny do tlenu w krzywej Barcrofta (krzywa dysocjacji hemoglobiny). 2. Transport dwutlenku węgla we krwi: 2.1. Krzywa Haldane a. 2.2. Frakcje w jakich CO2 jest transportowany. 2.3. Rola anhydrazy węglanowej i wymiana Hamburgera (przesunięcie chlorkowe). 3. Filogeneza układów wydajnego transportu tlenu i ontogeneza hemoglobiny. 4. Połączenia hemoglobiny z tlenkiem węgla i innymi związkami widma hemoglobiny. 5. Metabolizm hemoglobiny i gospodarka żelazem: 5.1. Tworzenie barwników żółciowych. 5.2. Wydalanie metabolitów hemoglobiny. 5.3. Białka biorące udział w transporcie i magazynowaniu żelaza. Ćwiczenia praktyczne 1. Liczenie erytrocytów (RBC) i retikulocytów (Ret). 2. Pomiar objętości krwinek i osocza wskaźnik hematokrytowy (HCT). 3. Obliczanie objętości krwinki czerwonej (MCV). 4. Ilościowe oznaczanie hemoglobiny (HGB) (metoda Drabkina). 5. Obliczanie wskaźnika barwnego krwi (MCHC) (indeks hemoglobiny). 6. Obliczanie bezwzględnej ilości hemoglobiny w jednej krwince czerwonej (MCH).
Transport gazów we krwi Pojemność tlenowa krwi (przy pełnym wysyceniu hemoglobiny tlenem) = 100 ml krwi może związać ok. 20 ml tlenu Pojemność krwi dla CO 2 = 100 ml krwi może związać 52-56 ml CO 2 Kanały transportowe dla tlenu (O 2 ): - hemoglobina (w erytrocytach) 97% całego transportu tlenu przez krew - osocze (tlen rozpuszczony w osoczu) 2-3% Kanały transportowe dla dwutlenku węgla (CO 2 ): - wodorowęglany w osoczu (NaHCO 3 ) i erytrocytach (KHCO 3 ) 70-90% - karbaminiany związki CO 2 z hemoglobiną i białkami osocza 10-20% - fizycznie rozpuszczony w osoczu 5-10%
Dlaczego transport tlenu do tkanek wymaga udziału przenośnika? Ciśnienie parcjalne tlenu (po 2 ) [miara jego dostępności] w: - wdychanym powietrzu -> 158mmHg - pęcherzykach płucnych -> 100mmHg - kapilarach płucnych -> 90mmHg Wolny hem (Fe 2+ ) wiąże O 2, jednak może reagować z inną wolną cząsteczką hemu, co prowadzi do powstawania agregatów; ponadto wolny hem wykazuje wyższe powinowactwo do innych niż tlen ligandów, np. CO W temperaturze 38, w 100 ml osocza rozpuszcza się zaledwie 0,284 ml tlenu Tlen jest wiązany (odwracalnie) przez kompleksy metali Fe(II), Cu(I) Hemoproteiny = mioglobina, hemoglobina Żelazoporfiryna - hem
Cel: Wyzwanie: jak transportować O 2? wychwycić tlen tam, gdzie jest go dużo (płuca -> po 2 = 100mmHg), uwolnić tlen tam, gdzie jest go mało (tkanki -> po 2 = 30mmHg) Transporter musi wykazywać zmienne powinowactwo do tlenu Cząsteczka posiadająca kilka centrów wiążących tlen (wiązanie O 2 w jednym centrum wpływa na wiązanie O 2 w innym centrum)
Hemoglobina (Hb) budowa - 4 centra hemowe zawierające żelazo (Fe2+) - 4 łańcuchy polipeptydowe (wiele modyfikacji): - 2α i 2β 98% u dorosłych (Hb A 1 ) - 2α i 2δ ok. 2% u dorosłych (Hb A 2 ) - 2α i 2ε Hb Gowera 2 = embrionalna do 3 miesiąca życia płodowego (Hb E) - 2α i 2γ Hb F = płodowa (od 3 miesiąca życia płodowego), w 4 miesiącu po urodzeniu stanowi 10% (zastępowana przez Hb A), w 6 miesiącu po urodzeniu stanowi 0,5% i taki odsetek Hb F utrzymuje się przez całe życie HbF i Hb Gowera 2 zwiększone powinowactwo do tlenu Hemoglobina normy zawartości: kobiety 12-16 g/dl; mężczyźni 14-18 g/dl
Nieprawidłowa hemoglobina Hb S Hemoglobinopatie choroby genetyczne, których podłożem są mutacje w łańcuchach polipeptydowych β hemoglobiny (defekt struktury) Anemia sierpowata (niedokrwistość sierpowatokrwinkowa) obecność nieprawidłowej hemoglobiny sierpowatokrwinkowej (HbS) (mutacja punktowa), która agregując zmienia kształt krwinki Erytrocyt prawidłowy żyje 120 dni, a sierpowaty ok. 20 dni. HbS ma niższe powinowactwo do tlenu niż HbA
Anemia sierpowata Zmutowany allel HbS występuje bardzo często w niektórych rejonach świata Afryka równikowa: 1 na 25 urodzeń USA: 1 na 400 urodzeń Homozygoty (2 recesywne allele HbS) -> poważne upośledzenie transportu tlenu Heterozygoty (allel HbS i prawidłowy allel HbA) -> transport tlenu nie jest poważnie zaburzony, a nosiciele wykazują zwiększoną oporność na infekcję pierwotniaka z rodzaju Plasmodium pasożyta wywołującego malarię Plasmodium spędza większość cyklu rozwojowego w erytrocycie; zakażone krwinki HbS ulegają rozpadowi zanim pasożyt dojrzeje
Rodzaje hemoglobiny ze względu na typ liganda Oksyhemoglobina natlenowana hemoglobina; Fe 2+ łączy się z tlenem w sposób nietrwały (nie zmienia swojej wartościowości) Karbaminohemoglobina hemoglobina w sposób nietrwały połączona z CO 2 Methemoglobina hemoglobina niezdolna do przyłączania tlenu; np. pod wpływem cyjanku potasu następuje trwałe utlenienie żelaza w hemie(fe 2+ -> Fe 3+ ) śmierć przez uduszenie Karboksyhemoglobina hemoglobina trwale połączona z tlenkiem węgla (CO) wiązanie 250-300x trwalsze niż z tlenem, reakcja 200x szybsza; przy 20% HbCO zatrucie, przy 60% HbCO śmierć Sulfhemoglobina hemoglobina trwale połączona z siarkowodorem (H 2 S wiąże się trwale z hemem, ale w miejscu odległym od żelaza) na skutek rzadkich powikłań polekowych
Hemoglobina - efekt allosteryczny Cząsteczka hemoglobiny ulega modyfikacjom przestrzennym pod wpływem tlenu. Przyłączenie pierwszej cząsteczki tlenu skraca długość wiązań pomiędzy pozostałymi atomami żelaza. Druga cząsteczka tlenu przyłącza się łatwiej, trzecia i czwarta jeszcze łatwiej.
Krzywa dysocjacji hemoglobiny i efekt Bohra Stopień wysycenia hemoglobiny tlenem zależy przede wszystkim od odczynu ph, temperatury i stężenia CO 2 W tkankach - środowisku bardziej kwaśnym (ph=6,8) powinowactwo Hb do tlenu jest niższe, zatem łatwiej oddaje ona tlen Christian Bohr opisał tę zależność = przesunięcie krzywej dysocjacji w prawo jest równoznaczne ze spadkiem powinowactwa Hb do O 2 W pęcherzykach płucnych (małe stężenie CO 2, bardziej zasadowe ph), Hb wykazuje duże powinowactwo do tlenu (którego jest tu dużo) i łatwo się z nim wiąże
Transport CO 2 1. W pęcherzykach płucnych ciśnienie parcjalne tlenu jest W tkankach, CO 2 dyfunduje do tak wysokie, że przyłącza się krwi, przedostaje się do on do hemoglobiny. erytrocytów, gdzie w wyniku 2. HCO - działalności 3 wnika do anhydrazy krwinki (dla wyrównania węglanowej ładunku, zostaje do osocza przekształcony przenika Cl - ), w który jon przy udziale wodorowęglanowy anhydrazy węglanowej (HCO 3- ) jest przekształcany do CO HCO - 3 dyfunduje do osocza, 2 i a jonu hydroksylowego (OH jon chlorkowy (Cl - ) wnika do - ). 3. CO erytrocytu, 2 dyfunduje by zachować do osocza, a stamtąd równowagę do światła ładunku pęcherzyka płucnego. 4. Jon OH - i uwolniony przez hemoglobinę proton (H + ) tworzą cząsteczkę wody. Przesunięcie chlorkowe = wymiana Hamburgera
Metabolizm hemoglobiny i gospodarka żelazem Rozkład hemoglobiny w warunkach fizjologicznych zachodzi w układzie siateczkowośródbłonkowym śledziony i wątroby Produkty końcowe to: bilirubina i biliwerdyna (barwią żółć), urobilina (barwi mocz), sterkobilina (barwi masy kałowe) Żelazo w postaci ferrytyny magazynowane jest w wątrobie (białko apoferrytyna + Fe 2+ ) Łączne zasoby żelaza: u kobiet 45 mmoli; u mężczyzn 60 mmoli, z czego: 60-70% jest związane z hemoglobiną ok. 30-15% stanowi żelazo zapasowe (ferrytyna, hemosyderyna) ok. 12% stanowi żelazo funkcjonalne związane z mioglobiną i enzymami
Krzepnięcie krwi
Płytki krwi (trombocyty, PLT) - powstają na drodze trombopoezy w linii mieloidalnej (wspólnej dla erytrocytów i granulocytów) - żyją około 10 (5-20) dni, są degradowane w śledzionie - norma: 150-400 tys. w 1 ml krwi nadpłytkowość (powyżej 500tys./ml) jedna z przyczyn procesów zakrzepowo-zatorowych małopłytkowość (poniżej 150 tys./ml) może powodować skazę krwotoczną (możliwe objawy: krwawienie z nosa, dziąseł; wybroczyny) HEMOSTAZA = zespół czynników osoczowych i tkankowych utrzymujących krew w stanie płynnym w łożysku naczyniowym oraz zespół procesów tworzenia skrzepu (jeśli dojdzie do przerwania ciągłości naczyniowej) Udział trombocytów w hemostazie: - syntetyzują i uwalniają substancje chemiczne (np. angiotensynogen, serotonina) obkurczające naczynia krwionośne - odpowiedzialne za tworzenie czopów hemostatycznych (zapobiega to wynaczynieniu krwi w obrębie uszkodzenia)
Czynniki krzepnięcia Tkankowe czynniki krzepnięcia: III tromboplastyna tkankowa i IV jony wapnia (Ca 2+ ) Osoczowe czynniki krzepnięcia (białka osocza) dzieli się na 3 grupy: 1) czynniki zespołu protrombiny powstają w wątrobie (niezbędna witamina K): II protrombina, VII prokonwertyna, IX tromboplastyczny składnik osocza PTC (czynnik Christmasa, czynnik antyhemofilowy B), X czynnik Stewarta-Prowera (aktywny czynnik X Xa = trombinaza jest niezbędny do przekształcenia protrombiny w trombinę) 2) czynniki wrażliwe na trombinę: I fibrynogen, V proakceleryna, VIII globulina antyhemofilowa A (czynnik antyhemofilowy A), XIII czynnik stabilizujący fibrynę 3) czynniki kontaktu: XI prekursor tromboplastyny osoczowej (czynnik antyhemofilowy C), XII czynnik Hagemana
ETAPY KRZEPNIĘCIA KRWI hemostaza naczyniowa hemostaza płytkowa hemostaza ostateczna (wtórna) hemostaza pierwotna
Mechanizm zewnątrzpochodny: tromboplastyna Mechanizm (uwolniona wewnątrzpochodny: z uszkodzonych tkanek) aktywacja w kompleksie z aktywnym czynnikiem VII w obecności Ca czynnika 2+ aktywuje XII, w kaskadowo wyniku kontaktu kolejne z czynniki obcymi krzepnięcia, w wyniku czego, dochodzi powierzchniami do (in vivo ściana powstania trombiny, a następnie uszkodzonego fibryny. naczynia krwionośnego zawierającego włókna kolagenowe), powoduje kaskadową aktywację kolejnych czynników prowadzącą do przemiany fibrynogenu w fibrynę. Proces ten jest możliwy dzięki wcześniejszemu powstaniu trombiny. Uraz tkanek powoduje uruchomienie obu mechanizmów aktywacji czynnika X, jednak mechanizm zewnątrzpochodny przebiega znacznie szybciej
M.in.: - heparyna - hirudyna Czynniki zapobiegające krzepnięciu krwi - antykoagulanty - dwukumarol (wchodzi w skład Żubrówki ) - kwas acetylosalicylowy (aspiryna wykazuje właściwości przeciwzakrzepowe przy długotrwałym stosowaniu) Niska temperatura spowalnia procesy krzepnięcia krwi, ale ich nie hamuje Wskaźniki związane z czasem krzepnięcia krwi - czas protrombinowy (norma: 13-17 s) czas krzepnięcia inicjowany przez mechanizm zewnątrzpochodny; zależy od stężenia w osoczu czynników II, V, VII, X i I - czas kaolinowo-kefalinowy (norma: 37-46 s) czas krzepnięcia inicjowany przez mechanizm wewnątrzpochodny; zależy od stosowanych odczynników - czas krwawienia (norma: 3-8 min) oznaczenie czasu upływającego od momentu uszkodzenia naczynia krwionośnego (nacięcie skóry przedramienia) do wytworzenia czopu płytkowego (ustanie krwawienia); zależy od liczby trombocytów i ich właściwości (prawidłowa adhezja, agregacja)