Metaloproteinazy w raku krtani* The matrix metalloproteinase in larynx cancer

Postepy Hig Med Dosw (online), 2016; 70: 1190 1197 e ISSN 1732 2693 www.phmd.pl Review Received: 2015.10.14 Accepted: 2016.09.15 Published: 2016.12.08 Metaloproteinazy w raku krtani* The matrix metalloproteinase in larynx cancer Weronika Lucas Grzelczyk 1, Janusz Szemraj 2, Magdalena Józefowicz Korczyńska 1 1 I Katedra Otolaryngologii Uniwersytetu Medycznego w Łodzi 2 Zakładu Biochemii Medycznej Uniwersytetu Medycznego w Łodzi Streszczenie Rak krtani to najczęstszy nowotwór złośliwy głowy i szyi. Mimo postępu w medycynie rokowanie u chorych na ten nowotwór w dalszym ciągu jest niezadowalające. W ostatnich latach duże zainteresowanie wzbudzają, odgrywające istotną rolę w procesie nowotworzenia, metaloproteinazy macierzy zewnątrzkomórkowej MMPs oraz ich tkankowe inhibitory TIMPs, szczególnie MMP 2 i MMP 9. Wydaje się, że ich udział, spośród innych metaloproteinaz, w procesie powstawania i rozwoju raka krtani jest najbardziej znaczący. MMPs to grupa enzymów proteolitycznych zależnych od cynku i wapnia. Ich główną funkcją jest trawienie składników macierzy zewnątrzkomórkowej oraz błony podstawnej naczyń, ułatwiając wzrost guza, migrację komórek oraz inwazję nowotworu. Nasilają ponadto tworzenie przerzutów i angiogenezę wewnątrz guza. Zauważono wyraźną tendencję wzrostu poziomu ekspresji badanych metaloproteinaz i ich inhibitorów w raku krtani w stosunku do tkanek zdrowych. Stwierdzono, w ostatnio prowadzonych badaniach, że wzmożona ekspresja genu MMP 2 w tkance tego nowotworu koreluje ze stopniem zaawansowania klinicznego, stopniem zróżnicowania histopatologicznego, występowaniem przerzutów, występowaniem wznowy oraz z czasem przeżycia. Wielu autorów wykazało zwiększoną ekspresję MMP 2 jako potencjalnego markera inwazyjności guza oraz gorszego rokowania u pacjentów z rakiem krtani. Związki ekspresji genu MMP 9 z cechami kliniczno patologicznymi raka krtani oraz czasem przeżycia chorych są niejednoznaczne, choć liczne prace wskazują na obecność takich zależności. Podobne korelacje daje się zauważyć w przypadku TMPs, choć temat ten jest poruszany jedynie w nielicznych, dostępnych w piśmiennictwie artykułach. Słowa kluczowe: rak krtani metaloproteinazy Summary 1190 One of the most common carcinoma occurring in the head and neck is laryngeal cancer. Despite the rapid scientific advances in medicine the prognosis for patients with such type of disease is not satisfying. In the last few years matrix metalloproteinases MMPs and their tissue inhibitors TIMPs, mostly MMP 2 and MMP 9, arouses a great interest, especially in the process of carcinogenesis. It seems that their impact in the formation and development of laryngeal cancer is significant. MMPs a group of zinc and calcium dependent endopeptidases play crucial role extracellular matrix collagen degradation. That are enzymes, that degrade and the basement membrane by facilitating tumor growth, cell migration and tumor invasion. They are implicated in metastasis and angiogenesis potentiate within the tumor. Clear tendency was observed towards the higher MMPs and TIMPs expression in larynx cancer than in the stroma. Recent studies show correlations between increased MMP 2 gene expression in the tumor tissue and clinical status, histopathological grading and metastases * Praca wykonana w ramach grantu Uniwersytetu Medycznego w Łodzi, nr 503/2 036 02/503 21 002. Postepy Hig Med Dosw (online), 2016; 70

Lucas-Grzelczyk W. i wsp. Metaloproteinazy w raku krtani occurrence. The similar MMP2 over expression dependence were found on tumor recurrence and survival. Many authors pointed out, significant higher MMP 2 expression as a potential marker of tumor invasiveness and worse prognosis in patients with larynx cancer. However, association of MMP 9 gene expression with laryngeal cancer clinicopathological features and survival of patients are ambiguous. Although, numerous researches show that this relationship does exists. Similar correlations could be found in TIMPs, but further studies are necessary because of small amount of literature. Key words: laryngeal cancer matrix metalloproteinases Full text PDF: Word count: Tables: Figures: References: http://www.phmd.pl/fulltxt.php?icid=1225952 2849 61 Adres autorki: prof. dr hab. n. med. Magdalena Józefowicz Korczyńska, I Katedra Otolaryngologii UM w Łodzi, ul. Kopcińskiego 22, Łódź; e mail: magdalena.jozefowicz korczynska@umed.lodz.pl Mimo rozwoju metod diagnostycznych i leczniczych, pięcioletnie przeżycia u chorych na raka krtani pozostają nadal niewielkie. Jest to jeden z najczęstszych nowotworów złośliwych głowy i szyi, rocznie na świecie stwierdza się około 600 000 nowych zachorowań [37]. W Polsce rak krtani jest siódmym pod względem częstości występowania nowotworem złośliwym u mężczyzn po raku płuca, gruczołu krokowego, jelita grubego, pęcherza moczowego, żołądka i nerki [26]. Stanowi 4% wszystkich nowotworów u mężczyzn i 0,5% u kobiet. Ryzyko zachorowania na raka krtani jest prawie 8 krotnie wyższe u mężczyzn niż u kobiet. Wzrasta wraz z wiekiem i osiąga najwyższe wskaźniki zachorowalności oraz umieralności między 45 a 69 rokiem życia. Szczyt zachorowań przypada na 6 i 7 dekadę życia. Zachorowalność u mężczyzn na nowotwory złośliwe krtani w grupach wiekowych jest podobna jak w populacji ogólnej. U mężczyzn w średnim i starszym wieku, do połowy lat 90 ub.w. następował wzrost zachorowalności, jednak obecnie obserwuje się jego spadek. U kobiet do początku XXI w. następował powolny wzrost zachorowalności, ale obecnie utrzymuje się na stałym poziomie [26]. W 2010 r. w Polsce częstość zachorowań oraz umieralność na nowotwory krtani była wyższa niż średnia dla krajów Unii Europejskiej zarówno u mężczyzn jak i kobiet [26]. Zgony z powodu raka krtani stanowią 2 3% wszystkich zgonów w Polsce dla obu płci [3]. Obserwuje się częstsze występowanie raka krtani w populacji miejskiej w stosunku do wiejskiej, a współczynnik miasto/wieś wynosi 1,32 dla mężczyzn oraz 1,67 dla kobiet [26]. Udowodniono, że zachorowanie na raka krtani uwarunkowane jest wieloma czynnikami. Palenie tytoniu, spożywanie alkoholu, promieniowanie UV, niektóre substancje chemiczne, a zwłaszcza infekcje wirusowe, takie jak wirusem brodawczaka ludzkiego (HPV, Human Papilloma Virus), szczególnie typem HPV 16 i 18, towarzyszą wzrostowi liczby przypadków raka głowy i szyi w tym raka krtani na świecie [17, 21,22]. Wśród czynników ryzyka wystąpienia raka krtani nadal na pierwszym miejscu pozostaje palenie tytoniu, przy czym przewlekłe spożywanie alkoholu łącznie z paleniem tytoniu znacznie zwiększa to ryzyko o około 330 razy [16,45,54]. Najczęstszym typem histologicznym nowotworu złośliwego krtani jest rak płaskonabłonkowy (ponad 95% nowotworów krtani). Pozostałe 5% to najczęściej gruczolakorak i rak brodawkowy (adenocarcinoma, carcinoma verrucosum) [20]. Najczęstszą lokalizacją raka krtani jest głośnia (ponad 45%) i okolica z piętra nadgłośniowego (około 40%), a najrzadsze umiejscowienie to okolica podgłośniowa (2,3%) [45]. W ostatnich 50 latach zaobserwowano trwałą tendencję do zmiany umiejscowienia pierwotnej raka krtani. Stopniowo wzrasta liczba nowotworów wywodzących się z piętra nagłośniowego, a spada mimo dominacji liczba na głośni [43]. W Polsce, w chwili rozpoznania ponad 60% przypadków raka krtani to guzy o zaawansowaniu klinicznym T3 i T4 według klasyfikacji TNM. U ponad 45% chorych stwierdza się przerzuty do regionalnych węzłów chłonnych. Analiza epidemiologiczna raka krtani i gardła dolnego przeprowadzona przez Bienia i wsp. [3] wykazała, że u około 2% chorych są obecne przerzuty odległe. Rokowanie u pacjentów z rakiem krtani jest ściśle związane z wielkością guza, umiejscowieniem, stopniem złośliwości histologicznej, wiekiem pacjenta oraz z obecnością przerzutów do regionalnych węzłów chłonnych szyi. Wystąpienie przerzutów odległych powoduje, że przeżycie pacjentów spada do 50% [48]. Metaloproteinazy macierzy zewnątrzkomórkowej (MMPs) to grupa enzymów proteolitycznych zależnych od cynku i wapnia. Ich główną funkcją jest trawienie składników macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) (extracellular matrix), takich jak: składniki błon podstawnych, kolagen typu IV, laminina, elastyna, fibronektyna, entakyna, proteoglikany oraz liczne białka, które nie są jej typowymi składnikami [30,50,56]. Metaloproteinazy odpowiadają za 1191

Postepy Hig Med Dosw (online), 2016; tom 70: 1190-1197 ciągły proces przebudowy struktury macierzy zewnątrzkomórkowej i za jej prawidłowy skład [25]. Enzymy te zostały wykryte w 1962 r., pierwsza poznana metaloproteina, kolagenaza 1 (MMP 1), opisana była u płazów [15]. Obecnie wykrytych zostało 28 metaloproteinaz, w tym 22 z nich u człowieka [14]. Wyodrębniono cztery duże grupy metaloproteinaz wystepujących w świecie zwierząt oraz u ludzi są to: serralizyny, astacyny, reprolizyny (inaczej adamalizyny lub dezintegryny) oraz matriksyny (metaloproteinazy macierzy zewnątrzkomórkowej) [51]. Metaloproteinazy występujące u ludzi zostały podzielone na pięć podgrup, ze względu na budowę domen oraz typy trawionych przez nie substratów są to: matrylizyny, kolagenazy, żelatynazy, stromelizyny, metaloproteinazy błonowe oraz metaloproteinazy gdzie indziej niesklasyfikowane. Do dodatkowo stworzonej podgrupy szóstej zalicza się wszystkie pozostałe MMPs nieuwzględnione w pięciu głównych podgrupach [31,56]. U człowieka metaloproteinazy kodują różne geny zlokalizowane na chromosomach 11 i 16 [12]. Metaloproteinazy mają wiele wspólnych cech dotyczących zarówno pełnionej funkcji jak i struktury. W budowie MMPs występuje: propeptyd i stanowiący jego część peptyd sygnałowy, który kieruje MMPs do miejsca docelowego. Wszystkie MMPs zawierają również domenę katalityczną [31,56]. Powstają jako nieczynny zymogen, którego aktywacja jest niezbędna do powstania czynnej postaci enzymu. Metaloproteinazy o najprostszej strukturze (MMP 7, MMP 28) są zbudowane tylko z wymienionych wcześniej elementów, pozostałe zawierają dodatkowo domenę, która jest zakończoną grupą karboksylową zbliżoną w budowie do hemopeksyny (globuliny wiążącej hem i jego pochodne). Funkcją liczącej około 210 aminokwasów domeny jest wiązanie białek macierzy zewnątrzkomórkowej oraz udział w mechanizmie aktywacji i inhibicji metaloproteinazy [53]. Oprócz omówionej budowy ogólnej, każda z podgrup metaloproteinaz ma również elementy tylko dla niej charakterystyczne. Metaloproteinazy błonowe mają dodatkowo domenę przezbłonową, która kotwiczy je w błonie komórkowej. Żelatynazy (MMP 2 i 9) zawierają w domenie katalitycznej trzy powtórzone sekwencje, które wiążą żelatynę. Natomiast w strukturze metaloproteinaz typu błonowego, a także stromelizyny obecna jest sekwencja rozpoznawana przez furyny, która umożliwia ich aktywację niezależną od innych enzymów z tej kategorii [44]. Metaloproteinazy odgrywają istotną rolę w różnych procesach fizjologicznych, natomiast procesy zapalne i nowotworowe przebiegają z podwyższoną aktywnością MMPs [10,18,42]. O tym jak bardzo istotna jest ich rola świadczy to, że geny metaloproteinaz podlegają ekspresji w niemal wszystkich komórkach, typu stacjonarnego, tj. makrofagach, fibroblastach, keratynocytach, komórkach dendrytycznych Langerhansa, miocytach, komórkach endotelialnych, komórkach mikrogleju czy neuronach, jak i w komórkach występujących w nacieku zapalnym, tj. leukocytach, monocytach i limfocytach T [10]. Poziom aktywności systemu metaloproteinaz w danej tkance jest ściśle regulowany. Wysoki występujący w wielu jednostkach chorobowych powoduje nadmierną proteolizę białek macierzy zewnątrzkomórkowej, natomiast niski hamuje degradację białek ECM, co prowadzi do procesu włóknienia [11]. Kontrola aktywności metaloproteinaz odbywa się na dwóch głównych poziomach, transkrypcji genu (MMPs indukcyjne) oraz poziomie potranskrypcyjnym (MMPs konstytutywne). Transkrypcja genów MMPs jest zmieniana przez regulujące ten poziom aktywności liczne cytokiny i czynniki wzrostu. Natomiast potranskrypcyjna regulacja aktywności MMPs odbywa sie pod wpływem kilku mechanizmów, takich jak: stabilizacja mrna, modyfikacja potranslacyjna, regulacja sekrecji enzymu, aktywacja proteolityczna proenzymu (zymogenu), inhibicja aktywnego enzymu (rola endogennych inhibitorów metaloproteinaz TIMP) i wreszcie przez katabolizm enzymów, czyli degradację MMPs. Mechanizm związany ze stabilnością mrna może wydłużać okres półtrwania mrna takim czynnikiem wydłużającym okres półtrwania jest np. TGF beta1 (transforming growth factor beta 1). Ważny mechanizm regulacji aktywności MMPs przez kontrolę aktywacji proteolitycznej wynika z tego, że niemal wszystkie metaloproteinazy powstają w postaci zymogenu, do zaktywowania którego jest konieczne odcięcie prodomeny. Ryc. 1. Schemat budowy metaloproteinaz 1192

Lucas-Grzelczyk W. i wsp. Metaloproteinazy w raku krtani Wydaje się, że MMPs syntetyzowane w komórkach, jako wydzielnicze lub błonowe proenzymy (zymogeny) są aktywowane przez usunięcie propeptydu z N końca cząsteczki, przez odpowiednie osoczowe lub tkankowe proteazy. Usunięty propeptyd utrzymywał enzym w postaci nieaktywnej (latencji) przez interakcję z aktywnym miejscem metaloproteinazy [57]. Taka aktywacja może wystąpić zewnątrzkomórkowo w macierzy pozakomórkowej lub w środowisku wewnątrzkomórkowym. Jednak większość enzymów proteolitycznych jest aktywowana na zewnątrz komórki. Podsumowując, zmiany aktywności układu metaloproteinaz zachodzą pod wpływem swoistych aktywatorów oraz inhibitorów (cytokin, hormonów, czynników wzrostu) działających na poziomie m.in.: ekspresji genów, stabilizacji mrna, aktywacji pro MMP, a także przez udział swoistych i nieswoistych inhibitorów zaktywowanych metaloproteinaz. Udowodniono, że niskie ph oraz podwyższona temperatura także prowadzą do aktywacji MMPs [31]. Należy podkreślić szczególną rolę jaką w regulacji ekspresji metaloproteinaz odgrywają specyficzne tkankowe i nieswoiste osoczowe inhibitory MMPs. I tak poziom aktywności MMPs w tkankach jest kontrolowany przez cztery tkankowe inhibitory metaloproteinaz (TIMP 1 do TIMP 4), które są zdolne do hamowania aktywności metaloproteinaz ze wszystkich podgrup. Inhibitory te działają poprzez dwa mechanizmy: hamowanie aktywacji proenzymu, inaktywacja enzymu już aktywnego przez utworzenie kompleksu TIMP MMP. Natomiast głównymi nieswoistymi osoczowymi inhibitorami MMPs są alfa2 makroglobulina, alfa1 antyproteaza oraz inne nieswoiste proteazy [30]. Liczne badania nad procesami nowotworowymi w ciągu ostatnich 20 lat wykazały, że metaloproteinazy macierzy odgrywają kluczową rolę w skomplikowanym mechanizmie progresji nowotworu [60]. Za główny etap w rozwoju wielu raków nabłonkowych uważa się niszczenie błony podstawnej i naciekanie leżącej poniżej tkanki łącznej przez komórki nowotworowe. Dzięki inwazji do podścieliska jest możliwy wzrost guza, naciekanie miąższu, ścian narządów, a także przyległych struktur organizmu. W tym okresie nowotwór przekracza błonę podstawną naczyń krwionośnych, co umożliwia powstawanie odległych przerzutów [19,30]. Uważa się, że niszczenie tych barier przyspieszają enzymy proteolityczne, głównie metaloproteinazy, uwalniane przez guzy nowotworowe, a także ich zmienione inhibitory. W procesach inwazji guza nowotworowego udział bierze wiele rożnych proteaz w tym katepsyny, urokinaza oraz metaloproteinazy macierzy pozakomórkowej [9]. W nowotworach piersi, nerki, stercza, płuc, jelita grubego udowodniono zależność między ekspresją genów na poziomie białka metaloproteinaz i ich inhibitorów a określonymi cechami guzów, w tym przede wszystkim stopniem zaawansowania klinicznego i zróżnicowania histopatologicznego, występowaniem przerzutów, wznowy oraz czasem przeżycia. Wielokrotnie podejmowano również próby określenia wartości prognostycznej ekspresji wymienionych enzymów u pacjentów z chorobą nowotworową. Wydaje się bardzo możliwe, że podobne zależności mogą występować w raku krtani tak, jak przedstawiają to opisane niżej badania. Rola metaloproteinaz i ich tkankowych inhibitorów u chorych na raka krtani Udowodniono, że procesy wzrostu oraz inwazji guza nowotworowego wiążą się z zaburzeniem równowagi między czynnikami, które wpływają na degradację i tymi, które warunkują podtrzymanie fizjologicznych procesów okolicznych tkanek. Za degradację macierzy pozakomórkowej odpowiadają enzymy proteolityczne, w tym metaloprateinazy, których rola zasługuje na szczególną uwagę. W licznych badaniach wykazano, że metaloproteinazy występują w większych ilościach w tkankach nowotworowych niż w prawidłowych [1,6,49]. Ponadto zauważono, że ich ekspresja jest wyższa w guzach złośliwych, zwłaszcza na inwazyjnym froncie guza w porównaniu z nowotworami niezłośliwymi [2,40,49]. W raku krtani najwięcej artykułów dotyczy badań nad ekspresją genów metaloproteinaz MMP 2 i MMP 9. Mniej uwagi poświęcano matryksynom MMP 1, MMP 3, MMP 7, MMP 10, MMP 13, MMP 14, MMP 15, MMP 16 oraz MMP 20 [13,23,28,62]. Tylko w nielicznych pracach natomiast oceniano ekspresję genów pozostałych metaloproteinaz np. MMP 11, MMP 12 [8,24,33,52]. Najczęściej oceniane MMP 2 oraz MMP 9 to enzymy odpowiadajace za degradację w pierwszej kolejności kolagenu IV głównego budulca struktury błon podstawnych [41]. Przez rozkładanie błony podstawnej i macierzy zewnątrzkomórkowej są czynnikami mającymi zasadnicze znaczenie w procesie inwazji guza. Pojedyncze prace dotyczące tkankowych inhibitorów metaloproteinaz w raku krtani omawiały ekspresję genów TIMP 1 oraz TIMP 2. Ekspresję genów metaloproteinaz oraz tkankowych inhibitorów metaloproteinaz w raku krtani oceniano z wykorzystaniem głównie dwóch metod laboratoryjnych. Dominującą techniką było immunohistochemiczne barwienie wykorzystujące przeciwciała przeciwko wybranym MMPs i TIMPs [4,34,38,55,59,62]. W metodzie tej porównywano intensywność zabarwienia oraz liczbę komórek nowotworowych, które uległy zabarwieniu w preparacie raka krtani w stosunku do nieobjętej procesem nowotworowym otaczającej tkanki, jako kontrola u tego samego pacjenta. Druga technika to odwrotna transkrypcja RT PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) oceniająca ekspresję genów MMP i TIMP na poziomie mrna [13,23,34,38,55,59,62]. Udowodniono, że metaloproteinazami wykazującymi większą ekspresję w nowotworowo zmienionej tkance krtani są: MMP 1, MMP 2, MMP 3, MMP 7, MMP 9, MMP 14, MMP 15, MMP 16, przy czym najwięcej artykułów dotyczyło ekspresji MMP 2 i MMP 9 [4,23,32,38,55,59,62]. Wyniki badań Zhanga i wsp. [62] wykazały, że zarówno ekspresja genu na poziomie mrna, jak i białka MMP 14, 15 i 16 były zwiększone w tkance raków nadgłośniowych w porównaniu do ekspresji otaczających tkankach nienowotworowych. Zaobserwowano ponadto istotnie statystycznie zmienioną ekspresję genu MMP 14 zarówno na poziomie białka, jak i mrna w tkankach raków 1193

Postepy Hig Med Dosw (online), 2016; tom 70: 1190-1197 Liu i wsp. [34] nie stwierdzili istotnego związku między ekspresją metaloproteinaz MMP 2 oraz MMP 9 a cechami kliniczno patologicznymi u chorych z rakiem płaskonabłonkowym krtani. Wykazano natomiast znaczącą różnicę w 5 letnich całkowitych przeżyciach między pacjentami z pozytywną i negatywną ekspresją genu MMP 2, gdzie znacząco niższy wskaźnik przeżycia występował w grupie ze zwiększoną ekspresją MMP 2. W badaniu dotyczącym MMP 2 w raku głośni opublikowanym przez Mallisa i wsp. [39] podano podobne wyniki wskazując na różnicę w całkowitych 5 letnich przeżyciach wśród pacjentów z pozytywną i negatywną ekspresją genu MMP 2. Stwierdzono obniżone wskaźniki przeżycia w pozytywnej ekspresji MMP 2, ale nie wykazało związku ekspresji genu MMP 2 z kliniczno patologicznymi cechami guza. Jednak w obu przytoczonych wyżej pracach autorzy zauwanadgłośniowych w stadium T3 lub z przerzutami do węzłów chłonnych szyi w porównaniu z tkankami raków nadgłośniowych w stadiach T1 2 lub bez przerzutów. Tak więc ekspresja genu MMP 14 na poziomie mrna oraz białka była wyższa w guzach u pacjentów w stadiach zaawansowania klinicznego III IV niż w stadiach I II. Wykazano, że wysoki poziom ekspresji genu MMP 14 na etapie białka wiązał sie z gorszym rokowaniem pacjentów. Minqiang Xie i wsp. [59] porównanali ekspresję genów MMP 1, MMP 2, MMP 7, MMP 8,MMP 9 i MMP 10 na etapie transkrypcji i translacji w raku krtani. Stwierdzili, że ekspresja genu na poziomie mrna oraz białek dla trzech metaloproteinaz MMP 2, MMP 7 i MMP 9 w tkance raka krtani była zwiększona w porównaniu z tkanką zdrową, w ponad 63% przypadków. Podwyższona ekspresja tych metaloproteinaz istotnie korelowała z powstawaniem przerzutów do wezłów chłonnych szyi. Autorzy sugerują, że określanie ekspresji metaloproteinaz może być przydatne do prognozowania wystąpienia przerzutów do węzłów chłonnych, jednak zastrzegają, że do potwierdzenia tej hipotezy jest niezbędna większa liczba badań. Podobnie Tang i wsp. [55] zaobserwowali, że poziom mrna oraz stężenie białek metaloproteinaz MMP 2 i MMP 9 w raku krtani był znacząco wyższy niż w zdrowych tkankach. Wysoki poziom ekspresji białek MMP 2 oraz MMP 9 był ściśle związany z wielkością guza pierwotnego, stopniem zaawansowania klinicznego, a także z przerzutowaniem do węzłów chłonnych. Ogólny wskaźnik przeżycia był również niższy u pacjentów z podwyższoną ekspresją genu MMP 9. Autorzy wnioskują, że metaloproteinazy MMP 2 oraz MMP 9 odgrywają rolę w inwazji guza oraz przerzutowaniu. Liu i wsp [32] przeprowadzili metaanalizę, która potwierdziła tezę o występowaniu znacznie zwiększonego stężenia białka MMP 2 w raku krtani. Przeszukali dostępne bazy danych różnych krajów i przeanalizowali 86 prac (48 w języku angielskim i 38 chińskich). Do metaanalizy włączono 7 prac spełniających wszystkie założone kryteria. Analiza dotyczyła 529 pacjentów. Wykazano, że ekspresja genu MMP 2 na poziomie białka była wyższa w wysoko zróżnicowanych rakach krtani w porównaniu do tych o średnim oraz niskim zróżnicowaniu. Potwierdzono znacznie podwyższone stężenie białka MMP 2 w rakach krtani z przerzutami do wezłów chłonnych w porównaniu z rakami krtani, w których przerzuty do węzłów chłonnych były nieobecne. Autorzy podkreślają, że wysoka ekspresja genu na poziomie białka MMP 2 może odgrywać ważną rolę w powstawaniu, rozwoju oraz w rokowaniu raka krtani. Gorogh i wsp. [13] oceniali ekspresję genów metaloproteinaz MMP 1, MMP 2, MMP 9 i MMP 10 w płaskonabłonkowym raku krtani i wykazali korelację między ekspresją genu MMP 2 zarówno na poziomie białka, jak i mrna w raku krtani a obecnością przerzutów do węzłów chłonnych. Nie wykazali natomiast korelacji między ekspresją MMP 1, MMP 9 i MMP 10 a wielkością guza i obecnością przerzutów. Badacze sugerują, że ekspresja genu MMP 2 zwiększa zdolność do tworzenia przerzutów raka płaskonabłonkowego krtani. Kręcicki i wsp. [27] oceniali stężenie białka MMP 2 w nowotworach krtani, nie stwierdzili korelacji między ekspresją genu na poziomie białka MMP 2, a parametrami kliniczno patologicznymi nowotworu, natomiast korelacja stężenia białka MMP 2 oraz obecności przerzutów w węzłach była na pograniczu błędu statystycznego. Tabela 1. Ekpresja genów kodujących metaloproteinazy i ich inhibitory w LSCC Ekspresja MMP lub TIMP w LSCC MMP Krótszy czas przeżycia Większy rozmiar guza nowotworowego Większa skłonność do tworzenia przerzutów do węzłów chłonnych Większa skłonność do tworzenia przerzutów odległych Wyższy stopień zaawansowania choroby 1194 korelacja Brak korelacji Korelacja Brak korelacji Korelacja Brak korelacji Korelacja Brak korelacji Korelacja MMP-2 [7,39] [32] [27] [13,32,55,59]] [27] [4,55] MMP-9 [5.55] [5,46,55] [13,34,58] [5,46,55] [13,34,58] [5,46] [13] [4,5,46] [34] Brak korelacji

Lucas-Grzelczyk W. i wsp. Metaloproteinazy w raku krtani żają, że ekspresja genu MMP 2 może być potencjalnym markerem gorszego rokowania. Wyniki badań oceniających zależności między ekspresją genów metaloproteinaz (głównie MMP 2 i MMP 9), a cechami kliniczno patologicznymi raka krtani, takimi jak: wielkość guza, przerzuty do węzłów chłonnych, stopnie zaawansowania nowotworu czy czas przeżycia, są niejednoznaczne. Wiele wyników dotyczących analiz oceny ekspresji genów metaloproteinaz, przede wszystkim MMP 2 i MMP 9, jest niepewnych i niejednoznacznych. Może to wynikać ze zróżnicowania doboru badanego materiału, zbyt małej liczby ocenianych, innego umiejscowienia nowotworu, stadium zaawansowanego choroby, zastosowania odmiennych metod laboratoryjnych i różnic w ocenie statystycznej. presją TIMP 2, a wielkością guza. Analizy przeżywalności nie wykazały istotnej różnicy pomiędzy czasem przeżycia u chorych w grupach o wysokiej i niskiej ekspresji genu TIMP 2. Podsumowanie Wyniki wielu badań dowodzą, że wszystkie geny MMP oraz TIMP wykazują ekspresję w zdrowej tkance krtani. Przy czym nie budzi wątpliwości to, że komórki nowotworowe wykazują podwyższoną ekspresję genów MMP w stosunku do komórek zdrowych. O raku krtani najwięcej artykułów dotyczy badań nad ekspresją metaloproteinaz MMP 2 i MMP 9. Istnieją rozbieżności wyników oceniających związek ekspresji ich genu z cechami kliniczno patologicznymi guza, co może wynikać z odmiennego doboru badanego materiału, liczebności próby, metod badawczych czy oceny statystycznej. Warto podkreślić, że wykryto pewne powiązania. Wzmożona ekspresja genu MMP 2 w raku krtani koreluje ze stopniem zaawansowania klinicznego, stopniem zróżnicowania histopatologicznego, występowaniem przerzutów, wznowy oraz z czasem przeżycia. O związku ekspresji genu metaloproteinazy 9 z cechami kliniczno patologicznymi raka krtani oraz czasem przeżycia chorych wnioski wynikajace z badań są niejednoznaczne, choć liczne prace wskazują na istnienie takich zależności. Wielu autorów wykazało zwiększoną ekspresję genu MMP 2 jako potencjalnego markera inwazyjności guza oraz gorszego rokowania u pacjentów z rakiem krtani. Podkreślają, że mimo iż na obecnym etapie wyniki różnych badań są niejednoznaczne, to można je uznać za zachęcające do dalszych prac na większym materiale z wykorzystaniem standaryzowanych metod badawczych [4,7,13,32,39,55,59]. Dotyczy to również tkankowych inhibitorów metaloproteinaz, chociażby ze względu na nieliczne artykuły dostępne w piśmiennictwie na ten temat. Piśmiennictwo [1] Bachmeier B.E., Iancu C.M., Jochum M., Nerlich A.G.: Matrix metalloproteinases in cancer: comparison of known and novel aspects of their inhibition as a therapeutic approach. Expert Rev. Anticancer Ther., 2005; 5: 149 163 [2] Baker E.A., Bergin F.G., Leaper D.J.: Matrix metalloproteinases, their tissue inhibitors and colorectal cancer staging. Br. J. Surg., 2000; 87: 1215 1221 [3] Bień S.: Epidemiologia i klasyfikacja raka krtani. Pol. Merk. Lek., 2005; 19: 464 466 [4] Christopoulos T.A., Papageorgakopoulou N., Ravazoula P., Mastronikolis N.S., Papadas T.A., Theocharis D.A., Vynios D.H.: Expression of metalloproteinases and their tissue inhibitors in squamous cell laryngeal carcinoma. Oncol. Rep., 2007; 18: 855 860 [5] Colović Z., Pesutić Pisac V., Poljak N.K., Racić G., Cikojević D, Kontić M.: Expression of matrix metalloproteinase 9 in patients with squamous cell carcinoma of the larynx. Coll. Antropol., 2013; 37: 151 155 [6] Danilewicz M., Sikorska B., Wagrowska Danilewicz M.: Prognostic Badania dotyczące zależności między ekspresją genów tkankowych inhibitorów MMP (głównie TIMP 1 i TIMP 2), a cechami kliniczno patologicznymi raka krtani są nieliczne. Warto podkreślić, iż mimo że Wittekindt i wsp. [58] stwierdzili brak korelacji między zwiększoną ekspresją genu MMP 9, a wzrostem guza, przerzutami do węzłów oraz wznową, to zaobserwowali zależność między pozytywną ekspresją genu MMP 9, a stopniem zróznicowania nowotworu. Pozytywna ekspresja genu MMP 9 była częściej obecna w rakach krtani o średnim oraz niskim stopniu zróżnicowania. Christopoulos i wsp. [4] oceniając ekspresję MMP 9 zaobserwowali, że zwiększona ekspresja genu MMP 9 wzrasta wraz ze wzrostem stopnia zaawansowania nowotworu. W tkankowych inhibitorach metaloproteinaz opisywano wzrost poziomu ekspresji genów TIMP 1 i TIMP 2 następujący wraz ze wzrostem stopnia zaawansowania nowotworu krtani [4,23]. Gorogh i wsp. [13] sugerują, że zwiększona ekspresja genów TIMP 1 i TIMP 2 upośledza rozwój procesu nowotworowego w raku płaskonabłonkowym krtani. Wykazali ujemną korelację zachodzącą między ekspresją TIMP 1 i TIMP 2, a powstawaniem przerzutów do węzłów chłonnych oraz ujemną korelację między ekssignificance of the immunoexpression of matrix metalloproteinase MMP2 and its inhibitor TIMP2 in laryngeal cancer. Med. Sci. Monit., 2003; 9: MT42 MT47 [7] Duan S., Guo Y.: Expression and clinical significance of stromelysin 3 in laryngeal cancer. Lin Chung Er Bi Yan Hou Tou Jing Wai Ke Za Zhi, 2008; 22: 104 107 [8] Duffy M.J.: The role of proteolytic enzymes in cancer invasion and metastasis. Clin. Exp. Metastasis, 1992; 10: 145 155 [9] Dziankowska Bartkowiak B., Waszczykowska E., Żebrowska A.: Udział metaloproteinaz i ich inhibitorów w patomechanizmie wybranych chorób skóry. Alergia Astma Immunol., 2004; 9: 71 79 [10] Fini M.E., Parks W.C., Rinehart W.B., Girard M.T., Matsubara M., Cook J.R., West Mays J.A., Sadow P.M., Burgeson R.E., Jeffrey J.J., Raizman M.B., Krueger R.R., Zieske J.D.: Role of matrix metalloproteinases in failure to re epithelialize after corneal injury. Am. J. Pathol. 1996; 149: 1287 1302 [11] Gacko M.: Metaloproteinazy macierzy międzykomórkowej (MMPs). Postępy Hig. Med. Dośw., 1997; 51: 577 589 1195

Postepy Hig Med Dosw (online), 2016; tom 70: 1190-1197 [12] Görögh T., Beier U.H., Bäumken J., Meyer J.E., Hoffmann M., Gottschlich S., Maune S.: Metalloproteinases and their inhibitors: influence on tumor invasiveness and metastasis formation in head and neck squamous cell carcinomas. Head Neck, 2006; 28: 31 39 [13] Groblewska M., Tycińska A., Mroczko B., Musiał W., Szmitkowski M.: Metaloproteinazy macierzy zewnątrzkomórkowej w chorobach układu krążenia. Pol. Merkur. Lekarski, 2011; 30: 235 240 [14] Gross J., Lapiere C.M.: Collagenolytic activity in amphibian tissues: a tissue culture assay. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1962; 48: 1014 1022 [15] Hashibe M., Boffetta P., Zaridze D., Shangina O., Szeszenia Dabrowska N., Mates D., Fabiánová E., Rudnai P., Brennan P.: Contribution of tobacco and alcohol to the high rates of squamous cell carcinoma of the supraglottis and glottis in Central Europe. Am. J. Epidemiol., 2007; 165: 814 820 [16] Iqbal A., Warraich R., Udeabor S.E., Rana M., Eckardt A.M., Gellrich N.C., Rana M.: Role of human papillomavirus infection and other factors in patients with head and neck squamous cell carcinoma. Oral Dis., 2014; 20: 288 293 [17] Itoh T., Matsuda H., Tanioka M., Kuwabara K., Itohara S., Suzuki R.: The role of matrix metalloproteinase 2 and matrix metalloproteinase 9 in antibody induced arthritis. J. Immunol., 2002; 169: 2643 2647 [18] Itoh T., Tanioka M., Yoshida H., Yoshioka T., Nishimoto H., Itohara S.: Reduced angiogenesis and tumour progression in a gelatinase A deficient mice. Cancer Res., 1998; 58: 1048 1051 [19] Jassem J., Kawecki A., Krajewski R., Krzakowski M.: Nowotwory nabłonkowe narządów głowy i szyi. Zalecenia diagnostyczno terapeutyczne Polskiej Unii Onkologii. Nowotwory, 2003; 53: 552 569 [20] Józefowicz Korczyńska M., Mazerant M., Morshed K., Olejniczak I., Bojanowska Poźniak K.: Wstępna ocena zależności pomiędzy zakażeniem HPV a wybranymi cechami nowotworu u chorych na raka krtani. Otorynolaryngologia przegląd kliniczny. 2014; 13: 155 162 [21] Jurkiewicz D., Dżaman K., Rapiejko P.: Czynniki ryzyka raka krtani. Pol. Merkur. Lekarski, 2006; 21: 94 98 [22] Kapral M., Strzałka Mrozik B., Paluch J., Kowalczyk M., Jurzak M., Weglarz L.: Evaluation of gene expression of selected matrix metalloproteinases and their tissue inhibitors in laryngeal cancer. Farm. Przegl. Nauk., 2010; 10: 41 46 [23] Kim J.M., Kim H.J., Koo B.S., Rha K.S., Yoon Y.H.: Expression of matrix metalloproteinase 12 is correlated with extracapsular spread of tumor from nodes with metastasis in head and neck squamous cell carcinoma. Eur. Arch. Otorhinolaryngol., 2013; 270: 1137 1142 [24] Kotulska Wolwender K., Larysz Brysz M., Fus Z., Korczyńska I., Górka D., Lewin Kowalik J.: Metaloproteinazy macierzy pozakomórkowej perspektywy ich wykorzystania w medycynie. Wiad. Lek., 2002; 55: 463 471 [25] Krajowy Rejestr Nowotworów 2010; http://onkologia.org.pl/ [26] Kręcicki T., Fraczek M., Jelen M., Podhorska M., Szkudlarek T., Zatonski T.: Expression of collagenase 1 (MMP 1), collagenase 3 (MMP 13) and tissue inhibitor of matrix metalloproteinase 1 (TIMP 1) in laryngeal squamous cell carcinomas. Eur. Arch. Otorhinolaryngol., 2003; 260: 494 497 [27] Kręcicki T., Zalesska Krecicka M., Jelen M., Szkudlarek T., Horobiowska M.: Expression of type IV collagen and matrix metalloproteinase 2 (type IV collagenase) in relation to nodal status in laryngeal cancer. Clin. Otolarygol. Allied Sci., 2001; 26: 469 472 [28] Kubben F.J., Sier C.F., van Duijn W., Griffioen G., Hanemaaijer R., van de Velde C.J., van Krieken J.H., Lamers C.B., Verspaget H.W.: Matrix metalloproteinase 2 is a consistent prognostic factor in gastric cancer. Br. J. Cancer, 2006; 94: 1035 1040 [29] Kwiatkowski P., Godlewski J., Śliwińska Jewsiewicka A., Kmieć Z.: Rola metaloproteinaz macierzy zewnątrzkomórkowej w procesie inwazji nowotworu. Pol. Ann. Med., 2008; 15: 43 50 1196 [30] Lipka D., Boratyński J.: Metaloproteinazy MMP. Struktura i funkcja. Postępy Hig. Med. Dośw., 2008; 62: 328 336 [31] Liu R.R., Li M.D., Li T., Tan Y., Zhang M., Chen J.C.: Matrix metalloproteinase 2 (MMP2) protein expression and laryngeal cancer prognosis: a metaanalysis. Int. J. Clin. Exp. Med., 2015; 8: 2261 2266 [32] Liu W., Xiang C., Jia S.: Study on the expression of matrix metalloproteinase 12 and NM_002426 in squamous laryngeal carcinoma. Lin Chuang Er Bi Yan Hou Ke Za Zhi, 2006; 20: 1120 1123 [33] Liu W.W., Zeng Z.Y., Wu Q.L, Hou J.H., Chen Y.Y.: Overexpression of MMP 2 in laryngeal squamous cell carcinoma: a potential indicator for poor prognosis. Otolaryngol. Head Neck Surg., 2005; 132: 395 400 [34] Liu Y., Li Y., Liu Z., Zhang L., Anniko M., Duan M.: Prognostic significance of matrix metalloproteinase 20 overexpression in laryngeal squamous cell carcinoma. Acta Otolaryngol., 2011; 131: 769 773 [35] Łapka A., Drąg J., Goździalska A., Jaśkiewicz J.: Metaloproteinazy macierzy pozakomórkowej w glejakach. Postępy Psychiatrii i Neurologii, 2008; 17: 207 211 [36] Machiels J.P., Lambrecht M., Hanin F.X., Duprez T., Gregoire V., Schmitz S., Hamoir M.: Advances in the management of squamous cell carcinoma of the head and neck. F1000Prime Rep., 2014; 6: 44 [37] Magary S.P., Ryan M.W., Tarnuzzer R.W., Kornberg L.: Expression of matrix metalloproteinases and tissue inhibitor of metalloproteinases in laryngeal and pharyngeal squamous cell carcinoma: a quantitative analysis. Otolaryngol Head Neck Surg., 2000; 122: 712 716 [38] Mallis A., Teymoortash A., Mastronikolis N.S., Werner J.A., Papadas T.A.: MMP 2 expression in 102 patients with glottic laryngeal cancer. Eur. Arch. Otorhinolaryngol., 2012; 269: 639 642 [39] Murray G.I., Duncan M.E., O Neil P., McKay J., Melvin W.T., Fothergill J.E.: Matrix metalloproteinase 1 is associated with poor prognosis in oesophageal cancer. J. Pathol., 1998; 185: 256 261 [40] Nelson A.R., Fingleton B., Rothenberg M.L., Matrisian L.M.: Matrix metalloproteinases: biologic activity and clinical implications. J. Clin. Oncol., 2000; 18: 1135 1149 [41] Nissinen L., Kähäri V.M.: Matrix metalloproteinases in inflammation. Biochim. Biophys. Acta, 2014; 1840: 2571 2580 [42] Nowak K., Szyfter W.: Nowotwory krtani. W: Szyfter W., red. Nowotwory w Otolarynglogii. Poznań: Termedia, 2012: 275 329 [43] O charoenrat P., Rhys Evans P.H., Eccles S.A.: Expression of matrix metalloproteinases and their inhibitors correlates with invasion and metastasis in squamous cell carcinoma of the head and neck. Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg., 2001; 127: 813 820 [44] Osuch Wójcikiewicz E.: Rak krtani i gardła dolnego. W: Janczewski G. (red.), Otorynolaryngologia Praktyczna. Via Medica; Gdańsk: 2007: 507 517 [45] Papadas T.A., Naxakis S.S., Mastronikolis N.S., Stathas T,. Karabekos N.C., Tsiambas E.: Determination of matrix metalloproteinase 9 (MMP 9) protein expression in laryngeal squamous cell carcinomas based on digital image analysis. J. BUON, 2013; 18: 977 981 [46] Peschos D., Damala C., Stefanou D., Tsanou E., Assimakopoulos D., Vougiouklakis T., Charalabopoulos K., Agnantis N.J.: Expression of matrix metalloproteinase 9 (gelatinase B) in benign, premalignant and malignant laryngeal lesions. Histol. Histopathol., 2006; 21: 603 608 [47] Rosenthal E.L., Matrisian L.M.: Matrix metalloproteases in head and neck cancers. Head Neck, 2006; 28: 639 648 [48] Samantaray S., Sharma R., Chattopadhyaya T.K., Datta Gupta S., Ralhan R.: Increased expression of MMP 2 and MMP 9 in esophageal squamous cell carcinoma. J. Cancer Res. Clin. Oncol., 2004; 130: 37 44 [49] Shields S.E., Ogilvie D.J., McKinnell R.G., Tarin D.: Degradation of basement membrane collagens by metalloproteases released by human, murine and amphibian tumours. J. Pathol., 1984; 143: 193 197

Lucas-Grzelczyk W. i wsp. Metaloproteinazy w raku krtani [50] Stocker W., Grams F., Baumann U., Reinemer P., Gomis Ruth F.X., McKay D.B., Bode W.: The metzincins topological and sequential relations between the astacins, adamalysins and matrixins (collagenases) define a superfamily of zinc peptidases. Protein Sci., 1995; 4: 823 840 [51] Suarez Alvarez B., Garcia Suarez M.M., Argüelles M.E., Sampedro A., Alvarez Marcos C., Mira E., Van den Brul F.A., Liu F.T., Chowdhury P.S., de los Toyos J.R.: Circulating IgG response to stromelysin 3, collagenase 3, galectin 3 and mesothelin in patients with pharynx/ larynx squamous cell carcinoma. Anticancer Res., 2001; 21: 3677 3684 [52] Śliwowska I., Kopczyński Z.: Metaloproteinazy macierzy zewnątrzkomórkowej charakterystyka biochemiczna i kliniczna wartość oznaczania u chorych na raka piersi. Współ. Onkol., 2005; 9: 327 335 [53] Talamini R., Bosetti C., La Vecchia C., Dal Maso L., Levi F., Bidoli E., Negri E., Pasche C., Vaccarella S., Barzan L., Franceschi S.: Combined effect of tobacco and alcohol on laryngeal cancer risk: a case control study. Cancer Causes Control., 2002; 13: 957 964 [54] Tang X., Shen X., Qian X., Gao X.: Expressions of HMGB1, MMP 2 and MMP 9 and prognostic alue in human laryngeal carcinoma. Lin Chung Er Bi Yan Hou Tou Jing Wai Ke Za Zhi, 2013; 27: 181 187 [55] Visse R., Nagase H.: Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of matrix metalloproteinases: structure, function, and biochemistry. Circ. Res., 2003; 92: 827 839 [56] Vu T.H., Werb Z.: Matrix metalloproteinases: effectors of development and normal physiology. Genes Dev., 2000; 14: 2123 2133 [57] Wittekindt C., Jovanovic N., Guntinas Lichius O.: Expression of matrix metalloproteinase 9 (MMP 9) and blood vessel density in laryngeal squamous cell carcinomas. Acta Otolaryngol., 2011; 131: 101 106 [58] Xie M., Sun Y., Li Y.: Expression of matrix metalloproteinases in supraglottic carcinoma and its clinical implication for estimating lymph node metastases. Laryngoscope, 2004; 114: 2243 2248 [59] Yana I., Seiki M.: MT MMPs play pivotal roles in cancer dissemination. Clin. Exp. Metastasis, 2002; 19: 209 215 [60] Yüce I., Bayram A., Cağlı S., Canöz O., Bayram S., Güney E.: The role of CD44 and matrix metalloproteinase 9 expression in predicting neck metastasis of supraglottic laryngeal carcinoma. Am. J. Otolaryngol., 2011; 32: 141 146 [61] Zhang H., Liu M., Sun Y., Lu J.: MMP 14 can serve as a prognostic marker in patients with supraglottic cancer. Eur. Arch. Otorhinolaryngol., 2009; 266: 1427 1434 Autorzy deklarują brak potencjalnych konfliktów interesów. 1197