Wrocław, 26.08.14 Recenzja rozprawy doktorskiej mgr Piotra Zygmunta Trzeciaka pt. Wpływ podwyższonej temperatury na poziom ekspresji wybranych genów w komórkach ziarnistych kompleksu wzgórek jajonośny - oocyt u krów w badaniach in vitro wykonanej na Wydziale Medycyny Weterynaryjnej Szkoły Głównej Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie pod kierunkiem promotora pracy dr hab. Anny Marii Duszewskiej, prof. nadzw. SGGW i dr inż. Rafała Radosława Starzyńskiego promotora pomocniczego 1. Ogólna charakterystyka rozprawy Przedstawiona mi do recenzji rozprawa doktorska mgr Piotra Zygmunta Trzeciaka pt. Wpływ podwyższonej temperatury na poziom ekspresji wybranych genów w komórkach ziarnistych kompleksu wzgórek jajonośny - oocyt u krów w badaniach in vitro jest oprawionym wydrukiem komputerowym złożonym z 113 stron formatu A4. Układ pracy jest typowy dla dysertacji doktorskich w dziedzinie eksperymentalnych nauk z zakresu biologii i zawiera osiem uporządkowanych, objętościowo zrównoważonych, odpowiednio ilustrowanych i starannie opracowanych rozdziałów. Wyniki badań są poparte odpowiednio zredagowanymi wykresami, tabelami i ilustrowane dokumentacją fotograficzną. Praca jest napisana jasnym językiem naukowym. Pracę realizowano w Zakładzie Histologii i Embriologii Katedry Nauk Morfologicznych Wydziału Medycyn Weterynaryjnej SGGW i w Zakładzie Biologii Molekularnej Instytutu Genetyki i Hodowli Zwierząt PAN w Jastrzębcu. Badani były finansowane z dotacji celowych SGGW. 2. Ocena merytoryczna pracy Ocena ogólna Niezależnie od kontrowersji dotyczących globalnego ocieplania klimatu, w Polsce w ostatnich latach obserwujemy zwiększoną liczbę dni w miesiącach letnich, w których temperatura powietrza osiąga poziom zbliżony do lub ponad 30 o C. Fluktuacje podwyższonej temperatury otoczenia wpływają na sezonowe zmiany płodności u bydła, które są opisywane przez Strona 1
praktykujących lekarzy weterynarii. Stanowią one istotny problem medyczny i są przyczyną wymiernych strat gospodarczych. Jedną z przyczyn takiego stanu jest wrażliwość komórek rozrodczych i zarodków we wczesnych etapach rozwoju na stres termiczny rozumiany jako kompleks zmian adaptacyjnych, które mają prowadzić do niwelacji ewentualnych skutków zaburzonej homeostazy termicznej. Istotnie, wykazano, że skutkiem stresu cieplnego jest zaburzony proces dojrzewania oocytów, spowodowany zaburzeniami dojrzewania cytoplazmatycznego, jądrowego, organizacji cytoszkieletu i egzekucją apoptozy co prowadzi do ograniczonej kompetencji biologicznej tych komórek niezbędnej do utworzenia prawidłowego zarodka. Jednak należy mieć na uwadze, ze zmiany adaptacyjne oocytów są ograniczone, ponieważ oocyt jest komórką transkrypcyjnie nieaktywną. W ocenianej rozprawie doktorskiej została sformułowana oryginalna hipoteza badawcza, która zakłada, że u krów negatywny wpływ stresu cieplnego na przedimplantacyjny rozwój zarodków jest uwarunkowany zmienioną ekspresją kluczowych genów sterujących procesem owulacji w transkrypcyjnie aktywnych komórkach ziarnistych wzgórka jajonośnego a nie bezpośrednim oddziaływaniem na oocyt. Komórki ziarniste są komórkami opiekuńczymi dla oocytów. Dlatego przyjęte założenie, że to właśnie komórka ziarnista w odpowiedzi na stres cieplny będzie spełniać rolę ochronną wobec oocytu jest logicznym i trafnym uzasadnieniem podjętych badań. Na szczególna uwagę również zasługuje dobór genów, których ekspresja w komórkach ziarnistych podlegała ocenie: receptor hormonu folikulotropowego, który po związaniu swojego liganda (FSH) aktywuje ścieżkę sygnalizacyjną prowadzącą do wzrostu aktywności cyklazy adenylowej, produkcji camp i utrzymywania odpowiedniego poziomu camp w oocycie; Wewnątrzkomórkowe stężenie camp decyduje o zahamowaniu lub wznowieniu podziału mejotycznego przez tę komórkę. Z kolei oocyt aktywnie wpływa na aktywację białek SMAD i kontrolę ekspresji genów kontrolujących proces owulacji i dyspersji komórek ziarnistych, miedzy innymi genu białka TSG-6, którego poziom transkrypcji i translacji był oceniany w tej pracy. Ocenie również podlegała ekspresja białka HSP-70, kluczowego w ochronie komórek przed stresem cieplnym. Strona 2
Najważniejszym osiągnieciem pracy jest wykazanie, że komórki ziarniste wzgórka jajonośnego odpowiadają na stres cieplny poprzez regulację ekspresji genów kluczowych dla procesów dojrzewania oocytów i odpowiedzi na stres termiczny. Odpowiedz ta jest zależna od czasu działania stresorów jak wykazano w porównaniu z badaniami innych autorów. Co ciekawe, wyniki pracy sugerują intensywną ochronę oocytu poprzez prawdopodobny parakrynny transport HSP-70, jednak ta ochrona nie zachowuje kompetencji oocytu umożliwiającej rozwój zarodków do stadium blastocysty. Obniżenie poziomu FSHR i podwyższenie poziomu TSG-6 w odpowiedzi na stres może sugerować przyspieszony proces odłączania komórek ziarnistych od oocytu i kształtowania struktur macierzy pozakomórkowej, co jest silną przesłanką do dalszych badań nad funkcjonalnym powiązaniami pomiędzy tymi dwoma rodzajami komórek w warunkach stresu a jednocześnie jak sugeruje Autor pracy białko TSG-6 i FSHR mogą służyć jako molekularne markery biologicznej kompetencji oocytów. Ten ostatni aspekt wynikający z podjętych badań może otwierać nową ścieżkę nieinwazyjnej, pośredniej oceny oocytów niezbędnej w trakcie uzyskiwania zarodków technikami in vitro. Na podkreślenie zasługuje fakt, że po raz pierwszy białko TSG-6 zostało wskazane jako marker stresu cieplnego. Podsumowując wyniki badań przedstawione w pracy doktorskiej mgr inż. Piotra Zygmunta Trzeciaka wskazują na kluczową rolę komórek ziarnistych w odpowiedzi na stres termiczny. Są inspirujące do podjęcia dalszych badań o charakterze podstawowym w zakresie biologii oocytów. Niosą również bardzo istotne wskazania aplikacyjne dla prac prowadzonych laboratoriach embriologicznych zajmujących się pozyskiwaniem zarodków zwierząt technikami in vitro. Ocena szczegółowa Edycja pracy jest bardzo staranna. Autor wykazał się dbałością o szczegóły w edycji tekstu, w opisach rycin i schematów. Wstęp szczegółowo wprowadza czytelnika w obszar wiedzy objętej zakresem badań. Pojedyncze uchybienia stylu wynikają prawdopodobnie z konieczności tłumaczenia bardzo skomplikowanych mechanizmów, które dotyczyły wyjaśnienia istoty molekularnych podstaw biologii oocytów. Cele pracy wynikają z aktualnego przeglądu piśmiennictwa, są sformułowane jasno i konkretnie. Strona 3
Dobór metod badawczych odpowiada celowi pracy. Na uwagę zasługuje różnorodność metod stosowanych przez Autora. Obejmowały one hodowle oocytów i zarodków w warunkach in vitro, techniki mikroskopowe oraz techniki biologii molekularnej. W kontekście uzyskanych wyników wskazuje to na biegłość warsztatową Autora pracy. Niektóre jednak informacje dotyczące zastosowanych metod wymagają w mojej ocenie koniecznych uzupełnień przed oddaniem pracy do druku. W podrozdziale 3.1 pt. Pobieranie materiału do badań należy wskazać porę roku, ewentualnie temperaturę otoczenia, która panowała przed ubojem krów, od których pobierano jajniki z rzeźni. Wysoka temperatura otoczenia panująca przed ubojem mogła wpływać na jakość pozyskiwanych COCs i tym samym wyniki przeprowadzonych eksperymentów. W rozdziale 3.8.1 pt. Izolacja całkowitego RNA brakuje informacji o ilości uzyskiwanego RNA lub o liczbie komórek ziarnistych i oocytów wykorzystywanych w każdym z powtórzeń. W rozdziale 3.9.4 pt. Immunoblotting brakuje informacji dotyczącej kontroli pozytywnej i negatywnej używanych przeciwciał W rozdziale 3.13 pt. Immunocytochemiczna analiza HSP 70 w oocytach brak jest informacji o liczbie oocytów poddanych analizie. Na rycinie 5 w oknie ANALIZA sformułowanie analiza kompetencji komórek ziarnistych na podstawie dojrzewania oocytów i rozwoju zarodków in vitro nie jest adekwatna do zamierzeń, ponieważ zastosowany układ doświadczalny nie jest wykluczający dla bezpośredniego wpływu podwyższonej temperatury na oocyt. Wymaga to dodatkowego komentarza. Starannie opracowany rozdział Wyniki nie budzi zastrzeżeń i jest wiarygodnym dowodem prawidłowo przeprowadzonych eksperymentów i uzyskanych wyników. Dyskusja jest bardzo dojrzałą interpretacją uzyskanych wyników. Autor wykazuje bardzo rozległa wiedzę o molekularnym podłożu zaobserwowanych zmian i umiejętnie rozważa możliwy udział badanych białek w ochronie oocytów przed stresem termicznym w Strona 4
kontekście badań innych autorów. Ogólnie, w całej pracy liczba cytowanych publikacji ( głównie anglojęzycznych) wynosi 212. Jednak pragnę zwrócić uwagę na nie uwzględnienie w dyskusji pracy Rispoli i wsp. z 2013 roku, w której autorzy, w nieco odmiennym układzie doświadczalnym, badali ekspresję genów komórek ziarnistych w warunkach stresu termicznego. Wnioski zostały sformułowane prawidłowo w sposób adekwatny do uzyskanych wyników. Konkluzja Reasumując uważam, że przedstawiona mi do recenzji rozprawa jest wartościową pracą naukową przedstawiającą oryginalne wyniki badań identyfikujące istotne mechanizmy towarzyszące stresowi termicznemu w oocytach i komórkach ziarnistych wzgórka jajonośnego u krów a także wskazującą kierunek dalszych poszukiwań w tym zakresie. Dlatego, biorąc pod uwagę ważność problemu biologicznego, któremu jest poświęcona oceniana rozprawa, oryginalną koncepcje przedstawionych badań, przeprowadzone poprawnie doświadczenia wymagające opanowania nowoczesnych metod badawczych i uzyskanie oryginalnych wyników wskazujących na potwierdzenie stawianej hipotezy stwierdzam, że rozprawa doktorska odpowiada warunkom określonym w art. 13 ust.1 ustawy z dnia 14 marca 2003r o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz.U. Nr 65, poz.595 z późn.zm) i zwracam się do Wysokiej Rady Wydziału Medycyny Weterynaryjnej, Szkoły Głównej Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie o dopuszczenie mgr inż. Piotra Zygmunta Trzeciaka do dalszych etapów przewodu doktorskiego. Jednocześnie zwracam się do Wysokiej Rady Wydziału Medycyny Weterynaryjnej, Szkoły Głównej Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie z wnioskiem o nagrodzenie tej pracy stosowną nagrodą. Wrocław, 26.10.2014 Prof. dr hab. Anna Chełmońska-Soyta Strona 5