BADANIA NAD ZACHOWANIEM SIĘ NIEKTÓRYCH SKŁADNIKÓW HEMOLIMFY PSZCZÓŁ ZARAZONYCH SPOROWCEM PSZCZELIM

PSZCZELNICZE ZESZYTY NAUKOWE ROK XXIII 1979 BADANIA NAD ZACHOWANIEM SIĘ NIEKTÓRYCH SKŁADNIKÓW HEMOLIMFY PSZCZÓŁ ZARAZONYCH SPOROWCEM PSZCZELIM (NOSEMA APIS Z.) Barbara Tomaszewska Instytut Chorób Zakaźnych i Inwazyjnych AR we Wrocławiu WPROWADZENIE Nozemoza, wywoływana przez pierwotniaka Nosema apis Zander, należy do schorzeń pszczół najczęściej występujących na terenie naszego kraju. W roku 1975 stwierdzono 22836 przypadków nozemozy na ogólną ilość 113915 próbek przebadanych w kierunku tego schorzenia (dane uzyskane z Zakładu Chorób Owadów Użytkowych w Swarzędzu). Dane te nie oddają jednak w pełni rzeczywistej ilości chorych pni pszczelich, ponieważ badaniami w tym kierunku nie obejmuje się całego pogłowia pszczół. Również w innych krajach choroba ta stanowi istotny problem w gospodarce pasiecznej. W i II i a m s (1973) uważa nozemozę za najpoważniejsze schorzenie pszczół w Stanach Zjednoczonych, a S v o b o d a (1974) podaje, że około 5fłl/o rodzin pszczelich na terenie Czechosłowacji jest dotkniętych tym schorzeniem. Nozemoza nie zawsze przebiega w sposób manifestujący się wyraźnymi objawami chorobowymi, czy nawet śmiercią całych rodzin pszczelich; bardzo często proces chorobowy w rodzinie jest utajony (S v o b o d a 1961). Wysunięto nawet hipotezę, że w większości rodzin pszczelich znajdują się pszczoły - nosiciele pasożyta. W sprzyjających warunkach liczba pasożyta zwiększa się, ale do rozwoju schorzenia konieczna jest zmiana metabolizmu pszczół (D o u II 1962). Pasożyt Nosema apis Zander cały swój cykl rozwojowy odbywa w komórkach nabłonkowych jelita trawiennego pszczoły (B a i l e y 1955, G r a y i wsp. 1969, We i s e r 1961). U zarażonych pszczół zostają upośledzone procesy trawienia i przyswajania. Chore osobniki pobierają wprawdzie duże ilości pokarmu, nie mają jednak możliwości jego prawidłowego strawienia i przyswojenia. W tych warunkach dochodzi do przepełnienia jelita prostego niestrawionymi resztkami pokarmowymi i pojawia się biegunka. Kał chorych pszczół obok wielkiej ilości spor pasożyta zawiera także dużo nieprzyswojonych cukrów i z tego powodu jest chętnie zjadany przez inne pszczoły, które w ten sposób ulegają 181

procesowi zarażenia; także w formie reinwazji l superinwazji.. Plastry pozostające w ulu, zwłaszcza zanieczyszczone odchodami chorych pszczół, przez wiele lat mogą stanowić źródło zarażenia (B a i l e y 1953, B a i l e y 1959). Schorzenie z uwagi na typowy okres występowania ma silny wpływ na opóźnienie wiosennego rozwoju rodzin, a toczący się w rodzinie pszczelej proces chorobowy wydatnie rzutuje na produkcję jniodu i wosku. Według Kra t o v i l a (1954) straty miodu w chorych rodzdnach wynoszą 25%; inni autorzy są zdania, że produkcyjność rodzin dotkniętych tym schorzeniem zmniejsza się o 400/0 (K i r i a k o v a 1949, K o s t e c ki 1962). Nozemoza powoduje w organizmach pszczół różnorodne zmiany. Przede wszystkim przy toczącym się procesie chorobowym okres życia chorych pszczół jest prawie dwa razy krótszy od okresu życia pszczół zdrowych (F a r r a r 1954, P o t e j k i n a 1960, M o e 11 e r 1964, M o f f e t i L a w s o n 1975). Dowiedziono również, że u chorych osobników procesy metaboliczne przebiegają odmiennie niż u zdrowych. M o f f e t i L a w s o n (1975) stwierdziła, że pszczoły zarażone zużywały o 22% mniej tlenu niż pszczoły kontrolne, zdrowe. Zużycie syropu cukrowego było natomiast o 14% wyższe u osobników chorych. Według R o b e r t s (1968) poziom nasyconych kwasów tłuszczowych w ciele pszczół chorych na nozemozę jest wyższy aniżeli w ciele pszczół zdrowych, u których z kolei zmniejsza się ilość nienasyconych kwasów tłuszczowych. Badania histochemiczne (H a r t w i g 1970) wykazały, że w zaatakowanych przez pasożyta komórkach nabłonka jelita środkowego następuje znaczne obniżenie aktywności esterazy 5-bromoindoksylu oraz fosfotazy kwaśnej i alkalicznej. U chorych osobników obserwuje się spadek produkcji mleczka pszczelego (Ż e r e b k i n 1968). Niedorozwój gruczołów gardzieliowych u zarażonych pszczół obserwowali także Wa n g i M o e 11 e r (1971). U pszczół tych w komórkach gruczołów gardzielowych zanika aparat Golgiego, siateczka plazmatyczna i mitochondria; ulegają zmianie lizosomy. Te obserwacje wyjaśniają, dlaczego w rodzinach pszczelich dotkniętych nozemozą słabo przyrasta liczba czerwiu i matki są ograniczane w czerwieniu. Według K;i r kor a (1962) zmniejszenie czerwienia matki w przebiegu nozemozy sięga 20%. Nozemoza należy do schorzeń sezonowych. Na przebieg choroby istotny wpływ mają takie czynniki jak klimat, sposób prowadzenia gospodarki pasiecznej, siła rodzin, dlość i jakość pożywienia. H a n k o (1969) stwierdził zależność między kondycją rodzin pszczelich a stopniem inwazji. Rodziny, które wykazywały szybki przyrost ilości czerwiu i młodych pszczół, charakteryzowały s:ię niskim procentem zarażenia. J e f f r e e i A 11 e n (1956) stwierdzili zależność między liczebnością rodzin a rozwojem choroby. Według tych autorów szczegól- 182

nie dużą śmiertelność przy nozemozie obserwuje się w zimujących rodzinach - bardzo liczebnych ~ bardzo słabych. Związane jest to prawdopodobnie z temperaturą wewnątrz kłębu. U rodzin bardzo silnych temperatura ta jest wyższa od przeciętnej, co z kolei sprzyja rozwojowi pasożyta. Na rozwój pasożyta bardzo istotny wpływ ma temperatura w obrębie rodziny. Temperatura potrzebna do jego rozwoju waha się między 10 i 38 C, optimum ciepłoty według S c h u l t z - L a n g e r (1958) wynosi 31 C. J a c o b s (1971) uważa za najodpowiedruiejszą do rozwoju Nosema apis temperaturę 35 C. W rozprzestrzenianiu schorzenia w obrębie pasieki duży udział ma sam pszczelarz przy okazji wykonywania wiosennych zabiegów hodowlanych, jak zasilanie rodzin pszczołami, przenoszenie plastrów z czerwiem i miodem, łączenie rodzin, używanie nieodkażonych plastrów do poszerzania gniazd. Niepokojenie pszczół przez częste, a niepotrzebne wiosenne przeglądy zwiększa możliwość oddawania kału wewnątrz ula (B a i l e y 1955, D o u 11 i962). Obserwowano także różnice w podatności pszczół na nozemozę związane z rasą S i d o r o v i M i c h a j l e n k o 1969, S i d o r o v i C z er k a s o v a 1971, M e l n i k 1974, S i d o r o v i wsp. 1975). S i d o r o v i C z e r k a s o v a (1971) badali aktywność katalazy, proteazy, diastazy li inwertazy u pszczół zdrowych i pszczół zarażonych. Autorzy ci stwierdzili, że aktywność katalazy jelita środkowego i prostego na 5,10 i 15 dzień po zarażeniu była wyższa niż u pszczół zdrowych tego samego wieku. Aktywność proteazy jelita środkowego młodych pszczół po zarażeniu była naj wyższa u ras bardziej "odpornych" na zarażenie, aniżeli u pszczół ras podatnych na nozemozę. Po 15 dniach obserwowano proces odwrotny; aktywność proteazy była wyższa u pszczół ras wrażliwych. Aktywność inwertazy i diastazy jelita środkowego i prostego chorych pszczół na 5,10 i 15 dzień po zarażeniu była wyższa aniżeli u pszczół zdrowych. Poglądy różnych autorów na związek między żywieniem pszczół a rozwojem schorzenia są w wielu wypadkach rozbieżne. Zdaniem S t e c h e (1961) intensywne spożywanie pyłku przez chore pszczoły należy do czynników sprzyjających rozwojowi pasożyta w momencie istnienia inwazji. Opierając się na wcześniejszych badaniach Lotmar, Steche uważa, że na skutek przyspieszenia przemiany materii chore pszczoły bardzo szybko zużywają rezerwy białka i chore rodziny giną nie tylko z powodu bezpośredniego działania pasożyta, ale także na skutek powstania niedoboru białka w rodzinie. Ten niedobór białka ma być z kolei przyczyną osłabienia i gwałtownego wyginięcia zarażonych osobników pszczelich. Steche wyraża także pogląd, że pszczoły pochodzące z rodzin cierpiących na niedostatek pokarmu białkowego, zwłaszcza w okresie jesieni, wykazują zwiększoną podatność na nozernozę w okresie wiosennym następnego sezonu pszczelarskiego. Podobnie B a h r m a n n (1963) zwraca uwagę na szczególną podat- 183

ność pszczół na nozemozę wiosną, wiążącą się z brakiem pyłku w jesieni, w następstwie czego pszczoły nie mogą zgromadzić w swoim ciele zapasów białkowo-tłuszczowych. G o n t a r s k i i M e b s (1964) stwierdzdli, że rozwój pasożyta w przewodzie pokarmowym zarażonych pszczół jest intensywniejszy u osobników pszczelich karmionych pokarmem z dodatkiem pyłku,. aniżelu u osobników przebywających na diecie węglowodanowej. Pszczoły karmione przed zarażeniem pyłkiem wykazywały wyższy stopień inwazji, aniżeli pszczoły otrzymujące pokarm bez dodatku pyłku. Karmienie pszczół pokarmem z dodatkiem kazeiny i aminokwasów nie miało większego znaczenia dla przebiegu choroby, stąd autorzy doszli do wniosku, że na rozwój pasożyta w jelicie środkowym pszczoły wywierają wpływ inne substancje zawarte w pyłku. P e r o u t k a (1975) badał wpływ pokarmu zawierającego pyłek lub pierzgę, a także pokarmu z dodatkiem namiastek pyłku na stopień inwazji pasożyta. Autor ten wykazał, że karrnlienie pszczół ciastem miodowo-cukrowym z dodatkiem kazeiny Hammersteina, a także karmienie pszczół ciastem miodowo-cukrowym z dodatkiem 3-6 /0 świeżego i suszonego pyłku rzepakowego zwiększyło stopień inwazji. Podobnie stopień inwazji był wyższy u pszczół otrzymujących pokarm z dodatkiem baktopeptonu. O r o s i - P a l (1966) wykazał, że w warunkach laboratoryjnych karmienie pszczół mleczkiem pszczelim, a więc pokarmem białkowym, sprzyjało rozwojowi pasożyta. B o r n u s i wsp. (1977) w swoich badaniach nad podatnością pszczół na nozemozę zwracają uwagę na związek między zarażeniem osobników pszczelich a dch kondycją.' Zarażenie osobników będących w zadawalającej kondycji przebiega trudniej niż u pszczół słabszych, chociaż w przewodzie pokarmowym pszczół o dobrej kondycji spożywających pyłek, pasożyt rozwija się intensywniej. W dostępnym piśmiennictwie są tylko nieliczne prace dotyczące zmian w hemolimfie pszczół zarażonych Nosema apis. W a n g i M 0- e 11 e r (1970), porównując zawartość aminokwasów w hemolimfie pszczół zdrowych i chorych, stwierdzili u tych ostatnich obniżenie poziomu wolnych aminokwasów i białek. Potwierdzają to spostrzeżenia F o t i. S e r b a n e s c u, C r i ą a n (1971), którzy wykazali spadek poziomu białka całkowitego w hemolimfie zarażonych pszczół. Kar a- b a s k o v a (1969) ustaliła, że zawartość wolnych aminokwasów w hemolimfie pszczół chorych na nozemozę w okresie zimowli była 1,4 do 4 razy wyższa w porównaniu ze zdrowymi. Autorka ta wysunęła przypuszczenie, że zjawisko to jest związane z silnym rozpadem białka tkankowego w organizmie. Poziom ogólnego azotu w hemolimfie chorych pszczół w porównaniu ze zdrowymi zniżał się dwukrotnie. Jednocześnie obserwowała w kwietniu u pszczół pochodzących z rodzin zdrowych klinicznlie, spadek poziomu ogólnego azotu, białka całkowitego i wolnych aminokwasów. Spadek poziomu białka całkowitego 184

w hemolimfie zdrowych pszczół w okresie kwietnia wykazano także we wcześniejszych badaniach własnych (T o m a s z e w s k a 1969). G l i ń s k i (1969 ) badając zachowanie się elementów morfotycznych i białek hemolimfy w procesie zarażenia stwierdził, że ilość hemocytów w hemolimfie nie podlega istotnym zmianom, choć ich odsetkowy skład u zarażonych pszczół podlegał znacznym wahaniom. W obrazie elektroforetycznym białek hemolimfy (elekroforeza bibułowa) mniej ruchliwa frakcja B u pszczół zarażonych wykazywała obniżenie poziomu statystycznie istotne. Celem niniejszej pracy było ustalenie w warunkach laboratoryjnych zachowania się niektórych składników hemolimfy pszczół w procesie zarażenia pasożytem Nosema apis Z. oraz stwierdzenie, w jakim stopniu pewne białkowe dodatki pokarmowe wpływają na obraz tych składników w trakcie procesu chorobowego. W badaniach uwzględniono zachowanie się poziomu białka całkowitego, lipidów całkowitych, glukozy i fruktozy. MATERIAŁ I METODY Badania prowadzono na pszczołach rasy środkowo-europejskiej linii Luboszanka pochodzących z własnej pasieki zakładowej staćjonu- [ącej na przedmieściu Wrocławia. Pszczoły użyte do doświadczeń pochodziły z pni wolnych od nożemozy i o wyrównanej sile. W momencie rozpoczęcia badań rodziny te obsiadały 7 i 8 plastrów w ulu warszawskim poszerzanym i posiadały odpowiednio 5 i 6 ramek z czerwiem. Do badań używano młodych, nielotnych pszczół pobieranych zawsze przez omiecenie ich ze skrajnych ramek. Przy obsadzaniu pszczołami ulików doświadczalnych eliminowano osobniki bardzo młode, dające się łatwo zauważyć ze względu na charakterystyczny wygląd ich okrywy ciała. Doświadczalne i kontrolne pszczoły przebywały w ulikach typu Liebefeld, każda grupa liczyła po 200 osobników pszczelich. Uliki przetrzymywano w termostacie o temperaturze 31 C i wilgotności względnej powietrza 80o/u. Doświadczenia prowadzono w okresie dwóch lat, w dwóch zasadniczych etapach. W pierwszym roku badano zachowanie się : poziomu białka całkowitego, lipidów całkowitych oraz glukozy i fruktozy w hemolimfie pszczół zarażonych pasożytem Nosema apis. Oznaczeń dokonywano w 3, 5, 7 i 10 dniu po zarażeniu. Równocześnie w tych samych dniach prowadzono obserwacje nad zachowaniem się wyżej wymienionych składników w hemolimfie kontrolnych pszczół zdrowych. Do zarażenia doświadczalnych pszczół użyto zawiesiny spor Nosema apis uzyskanych z rozcierów przewodów pokarmowych chorych osobników pszczelich. Rozciery te sporządzano na wodzie wodociągowej i po kilkakrotnym filtrowaniu przez gazę odwirowywano w ciągu 5 min. 185

przy obrotach 1000/min. Ilość spor w 1 ml zawiesiny oznaczono przy użyciu komory Biirkera. Każda grupa zarażanych doświadczalnych pszczół otrzymała jednorazowo 10 ml 50% syropu cukrowego zawierającego w 1 ml 1,5 X 10 6 spor pasożyta. Pokarm zawierający spory Nosema apis podawano doświadczalnym pszczołom w naczyńkach szklanych zaopatrzonych w pławiki; w następnych dniach uzupełniano go czystym 50% syropem cukrowym. Kontrolne pszczoły otrzymywały jako pokarm czysty 50% syrop cukrowy. Wodę podawano pszczołom w fiolkach zaopatrzonych w korek z ligniny. Pokarrn i wodę pszczoły pobierały bez żadnych ograniczeń. Doświadczenie wykonano w trzech powtórzeniach. W każdej doświadczalnej i kontrolnej grupie pszczół w 5, 7, j 10 dniu doświadczenia wykonywano badania w kierunku obecności spor pasożyta w przewodzie pokarmowym. Do badań tych używano losowo wybranych 10 pszczół z każdej grupy, zarówno pszczół zarażonych, jak i pszczół zdrowych. W ocenie rozcierów przewodów pokarmowych pszczół badanych w kierunku obecności spor pasożyta posługiwano się metodą opisaną przez G r o b o v a (1971). Te dodatkowe badania były konieczne ze względu na stwierdzenie z jednej strony skuteczności zarażenia, z drugiej strony na konieczność użycia w badaniach kontrolnych pszczół wolnych od spor pasożyta - zdrowych. Drugi etap badań prowadzonych w następnym roku w okresie maja i czerwca dotyczył obserwacji nad zachowaniem się poziomu wymienionych składników hemolimfy u pszczół zarażonych pasożytem Nosema apis i otrzymujących przez okres 10 dni po zarażeniu dodatki białkowe w pokarmie. Grupy kontrolne w tym etapie doświadczenia stanowiły pszczoły zarażone i otrzymujące jako pokarm tylko syrop cukrowy bez dodatków białkowych i wodę. Pszczoły zarażano zawiesiną spor pasożyta w taki sam sposób, jak w pierwszym etapie badań. Pszczoły zarażone pasożytem Nosema apis podzielono na trzy grupy doświadczalne w zależności od spożywanego przez nie pokarmu. Pierwsza grupa doświadczalnych pszczół otrzymywała jako pokarm ciasto miodowo-cukrowe z dodatkiem 6 fj /o pierzgi. Pierzga pochodziła z plastrów odebranych w początkach maja rodzinom pszczelim wolnym od nozemozy. Przed dodaniem do ciasta miodowo-cukrowego pierzgę suszono przez 7 dni w termostacie w temperaturze 30 C, następnie rozdrabniano w moździerzu porcelanowym. Do sporządzania ciasta miodowo-cukrowego używano pasteryzowanego miodu wielokwiatowego. Druga grupa doświadczalnych pszczół otrzymywała jako pokarm ciasto miodowo-cukrowe z dodatkiem 6,5% drożdży piekarniczych. Drożdże poddawano hydrolizie przez roztarcie ich w moździerzu z cukrem pudrem przeznaczonym do sporządzenia ciasta. Trzecia grupa pszczół doświadczalnych otrzymywała ciasto miodowo-cukrowe z dodatkiem 10% odtłuszczonego mleka Instant w proszku produkcji OSM Lubawa o składzie: laktoza 52,4%, białko 3,5%, sole 186

mineralne 8,1()/o,woda 4,0()/o,tłuszcz 0,5()/o.Ilość białka w przeliczeniu na 100g ciasta wynosiła 3,5%. Mleko przed połączeniem z ciastem miodowo-cukrowym rozpuszczano w niewielkiej ilości wody celem jednolitego rozprowadzenia go w miodzie użytym do sporządzania ciasta. Ciasto miodowo-cukrowe z dodatkami białkowymi, jak również syrop cukrowy używany do karmienia pszczół w trakcie trwania doświadczenia, przechowywano w zamkniętych naczyniach szklanych w temperaturze 4 C. Oznaczenia poziomu białka całkowitego, lipidów całkowitych, glukozy i fruktozy w hemolimfie pszczół wymienionych wyżej grup wykonano również w trzech powtórzeniach dla każdej z tych grup. Dla każdej partii pszczół pobranych z ula wykonywano przed zasiedlaniem ulików i zarażeniem po trzy oznaczenia kontrolne, mające na celu oznaczenie poziomu białka całkowitego, lipidów całkowitych, glukozy i fruktozy. Oznaczenia te były konieczne dla określenia stanu fizjologicznego badanych pszczół w momencie rozpoczęcia doświadczenia. Oznaczenia te nazwano w dalszej części pracy oznaczeniami zerowymi. Hemolimfę do badań pobierano od pszczół posługując się metodyką podaną w pracy wcześniejszej (T o m a s z e w s k a 1969). Ze względu na małą ilość hemolimfy, jaką można otrzymać od jednego osobnika pszczelego, w badaniach posługiwano się hemolimfą "mieszaną", uzyskiwaną od kilkunastu lub kilkudziesięciu pszczół w zależności od wymaganej ilości w zastosowanej metodyce badań. Do oznaczania poziomu białka całkowitego posługiwano się hemolimfą pozbawioną elementów morfotycznych. Hemolimfę odwirowywano przy użyciu wirówki hematokrytowej Unipan 316 w kapilarach o średnicy 1,3-1,5 mm i długości 75 mm w okresie 3 minut przy obrotach 11 tys/min. Po odwirowaniu kapilarę odłamywano ponad osadem złożonym z elementów morfotycznych, a zebrana z kilku kapilarów hemolimfa, ponownie zmieszana, służyła do dalszych oznaczeń. W oznaczeniach poziomu lipidów całkowitych, glukozy i fruktozy posługiwano się hemolimfą nieodwirowaną. Stosunkowo niewielka ilość hemolimfy, jaką można uzyskać od 200 osobników pszczelich, była powodem wprowadzenia pewnych modyfikacji w metodykach niektórych oznaczeń, polegających przede wszystkim na użyciu mniejszej ilości hemolimfy i zastosowaniu odpowiednich przeliczeń uzyskanych wyników. Przy oznaczaniu poziomu glukozy i fruktozy 'użycie mniejszej ilości hemolimfy było konieczne z uwagi na ich wysoki poziom w hemolimfie pszczół. Rozcieńczenie hemolimfy umożliwiło oznaczenie glukozy i fruktozy metodą kolorymetryczną. W każdej grupie pszczół badanej w kolejnych, odpowiednich dniach doświadczenia, wykonywano po trzy oznaczenia poziomu białka całkowitego, lipidów całkowitych, glukozy i fruktozy. W sumie uwzględnia- 187

jąc trzy powtórzenia doświadczenia, dla każdej grupy pszczół wykonano po 9 oznaczeń poziomu białka całkowitego, lipidów całkowitych, glukozy i fruktozy. Poziom białka całkowitego oznaczano metodą biuretową Wolfsona podaną przez T o m a s z e w s k i e g o (1970). Do każdego oznaczenia używano 0,05 ml hemolimfy, o połowę zmniejszano też ilość pozostałych odczynników. W oznaczeniach poziomu lipidów całkowitych posłużono się metodą Swahna podaną przez T o m a s z e w s k i e g o (1970). Oznaczeń poziomu glukozy dokonano przy użyciu metody ortotoluidynowej Hultmana zastosowanej we wcześniejszych badaniach własnych (T o m a s z e w s k a, C z e r n i c h o w s k a 1976). Oznaczeń poziomu fruktozy dokonano posługując się kolorymetryczną metodą Walkirisona podaną przez Tomaszewskiego (1970). Ze względu na wysoki poziom fruktozy w hemolimfie pszczół konieczne było lo-krotne rozcieńczenie hemolimfy i zastosowanie odpowiednich przeliczeń. Oznaczeń.poziornu białka całkowitego, lipidów całkowitych, glukozy i fruktozy dokonano przy użyciu kolorymetru Specol prod. K. Zeiss - Jena. Uzyskane wyniki oznaczeń poziomu białka całkowitego, lipidów całkowitych, glukozy i fruktozy poddano obliczeniom statystycznym wyliczając średnie z 9 oznaczeń, a następnie przy pomocy analizy wariancji porównano średnie poziomów w poszczególnych grupach doświadczalnych i dniach doświadczenia (poziom ufności a = 0,05). Wyniki badań dotyczące poziomu białka całkowitego, lipidów całkowitych, glukozy i fruktozy wykonane przed zarażeniem pszczół i oznaczone jako badania zerowe, nie były poddane obliczeniom statystycznym. WYNIKI BADAŃ I DYSKUSJA Porównując wyniki badań w grupie pszczół zdrowych i zarażonych w ciągu 10 dni trwania doświadczenia, stwierdzono statystycznie istotny spadek poziomu białka całkowitego w grupie pszczół zarażonych. W 3 dniu po zarażeniu poziom białka całkowitego wynosił u pszczół zarażonych 6,9 go/oi był nawet nieco wyższy, aniżeli w hemolimfie pszczół zdrowych, natomiast w 10 dniu doświadczenia u pszczół zarażonych obserwowano znaczny jego spadek do 2,9 go/o.u pszczół zdrowych w tym samym czasie poziom białka całkowitego utrzymywał się na prawie jednakowym poziomie. Szczegółowe dane dotyczące średnich wartości poziomu białka całkowitego w hemolimfie pszczół zarażonych i zdrowych stwierdzane w 3, 5, 7 i 10 dniu doświadczenia przedstawione są w tabeli 1, natomiast bezwzględna wartość różnicy między średnimi 188

poziomów białka całkowitego w obu grupach między 3 a 5, 3 a 7 i 3 a 10 dniem doświadczenia podane są w tabeli 5. W hemolimfie pszczół zarażonych i otrzymujących w pokarmie dodatek pierzgi obserwowano również spadek poziomu białka całkowitego z 5,4 go/ow 3 dniu doświadczenia do 4,2 gil/ow 10 dniu po zarażeniu. W hemolimfie pszczół zarażonych a nie otrzymujących w pokarmie pierzgi, spadek poziomu białka całkowitego był zaznaczony znacznie wyrażniej. Wartość poziomu białka całkowitego w hemolimfie tych pszczół w 3 dniu doświadczenia wynosiła 4,1 tj/o, a w 10 dniu 2,8 go/o. Porównanie pozaomów białka całkowitego w hemolimfie pszczół zarażonych i otrzymujących w pokarmie dodatek pierzgi z poziomem białka całkowitego w hemolimfie pszczół kontrolnych, wykazało wyższą wartość poziomu białka całkowitego (różnice statystycznie istotne) w 3, 5, 7 i 10 dniu doświadczenia na korzyść pszczół grupy pierwszej. Szczegółowe dane przedstawione są w tabeli 2 i 5. W hemolimfie pszczół zarażonych i otrzymujących w pokarmie dodatek drożdży stwierdzono także wyższy poziom białka całkowitego w porównaniu z grupą pszczół kontrolnych. Jedynie w 5 dniu doświadczenia nie stwierdzono istotnych różnic w poziomach białka całkowitego. U pszczół kontrolnych stwierdzono w ciągu 10 dni trwania doświadczenia spadek poziomu białka całkowitego z 3,1 (f/o do 2,1 [f/o; (różnica statystycznie istotna przy porównaniu wartości bezwzględnych między średnimi poziomów zaznaczyła się między 3 a 5 i między 3 a 10 dniem). Natomiast w hemolimfie pszczół zarażonych, ale otrzymujących w pokarmie dodatek drożdży, spadek poziomu białka całkowitego nie był tak wyraźnie zaznaczony, a różnica statystycznie istotna przy porównaniu bezwzględnych wartości poziomów zaznaczyła się tylko między 3 a 10 dniem. Szczegółowe dane dotyczące wartości poziomów białka całkowitego w hemolimfie pszczół obu grup przedstawia tabela 3, a bezwzględne wartości różnic między średnimi poziomów białka w hemolimfie pszczół tych grup, tabela 5. W grupie pszczół zarażonych i otrzymujących w pokarmie dodatek mleka w ciągu 7 dni stwierdzono wzrost poziomu białka całkowitego z 4,6 (f/o w 3 dniu do 5,4 (f/o w 7 dndu, W hemolimfie pszczół kontrolnych 'Obserwowano w tych dniach spadek poziomu białka całkowitego, podobnie jak w poprzednich seriach doświadczenia. Porównanie poziomów białka całkowitego w 3 i 7 dniu w hemolimfie pszczół obu tych grup wykazało statystycznie istotne podwyższenie tego poziomu na korzyść grupy pszczół otrzymującej w pokarmie dodatek mleka. Jedynie w 5 dniu nie stwierdzono tych różnic, a nawet poziom białka w hemolimfie pszczół kontrolnych był nieco wyższy od poziomu białka stwierdzanego w hemolimfie pszczół zarażonych i otrzymujących w pokarmie mleko. Dane dotyczące wartości średnich poziomów białka całkowitego w hemolimfie pszczół obu tych grup są przedstawione w tabeli 4, a bezwzględna wartość różnicy między średnimi pozaomów białka w hemolimfie pszczół tych grup przedstawiona jest w tabeli 5. 189

ṯo o Tabela 1 Table 1 Średnie poziomów białka całkowitego, lipidów całkowitych, glukozy i fruktozy w hemolimfie pszczół zdrowych (x z ) i pszczół zarażonych (xz.) oraz bezwzględna wartość różnicy Ixz-xz.1 między tymi grupami w poszczególnych dniach doświadczenia Averagę levels of total protein, total lipids, glucose and fructose in the hemolymph of healty (xz) and infected Ixz.1bees, as wel1 as the absolute value of difference between these groups on several days- of the experiment Białko całkowite w g% Lipidy całkowite w mg% Glukoza w mg% Fruktoza w mg% Total protein, g% Total lipids, mg% Glucose, mg% Fructose, mg% Dzień Grupa pszczół Grupa pszczół Grupa pszczół Grupa pszczół Day Bee group Bee group Bee group Bee group IXz-xz.1 IXz-xz.1 IXz-xz.1 zdr9we zarażone zdrowe I zarażone zdrowe I zarażone zdrowe zarażone healty I infected healty infected healty infected healty I infected 3 6,5 6,9 0,4 167,0 145,5 21,5* 388,2 352,6 35,6 533,2 528,1 5,1 5 5,9 5,8 0,1 241,6 169,8 71,8* 312,2 285,7 26,5 567,2 585,5 18,3 7 6,9 4,4 2,5* 159,1 138,8 20,3 549,1 281,7 267,4* 512,2 523,5 11,3* 6,02 2,9 3,12* 160,4 132,1 28,3* 355,1 240,0 115,1*' 533,8 417,4 116,4 * różnica statystycznie istotna, statistically sigrufieant difference IXz-xz.1

Tabela 2 Table 2 Średnie poziomów bialka całkowitego, lipidów całkowitych, glukozy i fruktozy w hemolimfie pszczół zarażonych przebywających na diecie bezbiałkowej Ixzl i pszczół zarażonych otrzymujących w pokarmie dodatek pierzgi Ixzp) oraz bezwzględna wartość różnicy między tymi grupami Ixz-xzpl w poszczególnych dniach po zarażeniu Average leve1s of total protein, total lipids, glucose and fructose in the hemyolymph of infected bees kept.on proteinless diet (xz) and infected bees gettingn in food an addition of pollen (xzp), as well as the absolute value od difference between these groups-lxz-xzl.i on several days after infection Dzień Day Białko całkowite, w g% Lipidy całkowite w mg% Glukoza w mg% Fruktoza w mg% Toral protein, g% Total lipids, mg% Glucose, mg% Fructoe, mg% Grupa pszczół Grupa pszczół Grupa pszczół Grupa pszczół Bee group IXz-xzpl Bee group Ixz-ltzpl Bee group Ixz-xzpl Bee group Ixz-x pl X: z I xzp xz I xzp xz xzp xz I I xzp 3 4,1 5,4 1,3* 69,3* 124,0 54,7* 488,0 627,3 139,3 607,5 826,0 218,5* 5 3,7 4,5 0,8* 56,0 112,8 46,8* 365,5 652,6 287,1* 558,2 653,6 95,4 7 3,5 5,2 1,7* 62,2 101,3 39,1* 301,3 235,3 66,0 565,2 495,5 69,7 10 2,8 4,2 1,4* 52,3 123,8 71,5* 359,5 284,0 75,5 600,2 459,5 140,7 * różnica statystycznie istotna, sratisricałly significant difference.. CO...

W 10 dniu doświadczenia nie wykonano oznaczeń białka całkowitego, a także lipidów całkowitych, glukozy d fruktozy, ponieważ 81 /0 pszczół otrzymujących w pokarmie dodatek mleka zginęło wśród objawów silnej biegunki między 8 a 10 dniem i nie dysponowano odpowiednią ilością hemolimfy potrzebnej do wykonania oznaczeń. U pszczół otrzymujących w pokarmie dodatek mleka zaobserwowano począwszy już od 4 dnia zmiany w wyglądzie i zachowaniu. Pszczoły stały się apatyczne, traciły chęć poruszania się, zdradzały pociemnienie pancerza chitynowego. W 8 dniu pojawiła się biegunka, która doprowadziła do śmierci większości doświadczalnych pszczół. Objawów biegunki nie obserwowano mimo 10...dniowego okresu izolacji u żadnych z grup pszczół zarażonych. W grupach tych wskaźnik śmiertelności w 10 dniu obserwacji nie przekraczał 6 /0, a w grupach pszczół zdrowych wahał się w granicach 1-2%. Ocena mikroskopowa stopnia inwazji i jednocześnae kontrola skuteczności zarażenia u pszczół wszystkich grup zarażonych wykazała począwszy od 5 dnia po zarażeniu obecność spor pasożyta w rozcierach z przewodu pokarmowego. Ilość spor w polu widzenia była różna; stopień inwazji oceniano wg metody Grobova na + + (do 100 spor w polu widzenia). Jedynie w grupie pszczół zarażonych otrzymujących w pokarmie dodatek mleka w 7 dniu po zarażeniu stwierdzono silniejszy stopień inwazji oceniany na + + + (średnia z trzech powtórzeń wynosiła 131 spor w polu widzenia). Według B a i l e y (1968) cykl rozwojowy pasożyta trwa w przybliżeniu 7 dni; G o e t z e i Z e u t z c h e l (1959) podają, że cykl ten jest ukończony już po 5 dniach. G l i ń s ki (1959) w swoich badaniach największą ilość spor pasożyta stwierdził między 4-6 dniem po zarażeniu. W badaniach własnych wyraźny spadek poziomu białka całkowitego w hemolimfie zarażonych pszczół obserwowano już od 5 dnia, a najbardziej spadek ten był zaznaczony w 10 dniu po zarażeniu. W grupie pszczół zdrowych przebywających na takiej samej diecie, jak pszczoły zarażone, obserwowano tylko nie znaczne wahania w wartościach poziomu białka całkowitego i nieznaczny spadek tego poziomu w 10 dniu. Obserwowany w badaniach bardzo wyraźny spadek poziomu białka całkowitego w hemolimfie zarażonych pszczół w ciągu 10 dni trwania doświadczenia należy tłumaczyć toczącym się procesem chorobowym i intensywnym namnażaniem się pasożyta w komórkach nabłonkowych jelita środkowego. Wyniki badań własnych zgodne są z wynikami uzyskanymi przez F o t i i wsp. (1976), którzy w hemolimfie pszczół zarażonych Nosetna apis stwierdzili po 12 dniach obserwacji spadek poziomu białka całko-. witego o 44% w porównaniu do poziomu wyjściowego. Spadek poziomu białka całkowitego w hemolimfie pszczół zarażonych i otrzymujących w pokarmie dodatek pierzgi, bądź namiastek pyłkowych takich jak drożdże czy mleko, był znacznie mniej zaznaczony. W hemolimfie tych pszczół w poszczególnych dniach doświadczenia 192

.. I ~n N "' 5' ;; N "' N '"?l ~ '< ~ C :>; o ~ I ~ a Tabela 3 Table 3 Średnie poziomów bialka całkowitego, lipidów całkowitych, glukozy i fruktozy w hemolimfie pszczół zarażonych przebywających na diecie bezbiałkowej (x.) i pszczół zarażonych otrzymujących w pokarmie dodatek drożdży (xztl) oraz bezwzględna wartość różnicy między tymi grupami IX,,-Xzdl w poszczególnych dniach po zarażeniu Average levelś of total protein, totallipids, głucose and fructose in the hemołymph of infected bees kept on proteinless diet (xz) and infected bees getting in food an addition of' yeast (Xzd), as wen as the absolute value of difference between these groups IXz-Xzdl on several days after infection Dzień Day Białko. całkowite w g% Lipidy całkowite, w mg% Glukoza w mg% Fruktoza w mg% To.ra! protein, g% Total lipids, mg%. Glucose, mg% Fructose, mg% Grupa pszczół Grupa pszczół Grupa pszczół Grupa pszczół Bee group IXz-X'dl Bee group IXz,-xzal Bee group IXz-Xzdl Bee group Xz I XŻd iż I X'd X, I Xza Xz I Xzd ".' IXz-X'dl 3 -'3;i '-;' 3,6. 0,5* 85,3 118,4 33,1* 443,5 446;2 2,7 528,8 596,6 67;8 5 3,0 3,2 0,2 61,7 76,8 15:;1* 526,4 422,4 104,0 636,3 519,3 117,0* 7 2,6 3,3 0,7* 44,4 67,1 22,7* 405,3 491,1 85,8 400,5 540,8 140,3 10 2,1 ' 3,1 1,0* 35,1 62,6 27,5* 260,0 344,4 84,4 372,1 554,6 182,5* * różnica statystycznie istotna, statistically significant differcnce... <:O W

... co "'" Tabela 4 Tabłe 4 Średnie poziomów białka całkowitego, lipidów calkowitych, glukozy i fruktozy w hemolimfie pszczół zarażonych przebywających na diecie bezbiałkowej (xz) i pszczół zarażonych otrzymujących w pokarmie dodatek mleka (XZDI) oraz bezwzględna wartość różnicy między tymi grupami Ixz - Xzm w poszczególnych dniach po zarażeniu Average levels of total protein, total lipids, glucose and fructosa in the hemolymph of infected bees kept on proteinless diet (Xz) and infected bees getting in food an addition of miłk (xzm), as we\ł as the absolute value of difference between thes groups IXz-xzml on severał days aftc infection Dzień Day Białko całkowite w g% Lipidy całkowite w mg% Glukoza w mg% Fruktoza w mg% Totał protein, g% Total lipides, mg% Glucose, mg% Fructose, mg% Grupa pszczół Grupa pszczół Grupa pszczół Grupa pszczół Bee group IXz-xzml Bee group [xz-xzml Bee group Bee group r 1',-',.,1 IXz-xzml x. I Xzm xz I Xzm Xz I izm Xz I Xzm 3 5 7 10** 4,0 5,8 3,3 4,6 5,4 5,4 0,6* 0,4 2,1* 96,1 79,6 58,3 127,5 113,5 75,3 31,4* 33,9* 17,0 630,6 408,4 311,7 556,2 218,6 372,6 74,4 189,9* 60,9 724,1 467,1 532,7 576,1 291,4 387,1 148,0* 175,7* 145,6* * różnica statystycznie istotna, statistically sigrufieant difference ** 81 % oc experimental bees getting in food an addition oc milk dicd between the 8th and 10th day

obserwowano zawsze wyższy poziom białka całkowitego aniżeli w hemolimfie pszczół zarażonych, ale nie otrzymujących w pokarmie dodatków białkowych. Wyższy poziom białka całkowitego w hemolimfie pszczół zarażonych i karmionych pokarmem z dodatkami białkowymi wskazywać może, iż mimo toczącego się procesu chorobowego, kondycja tych pszczół jest lepsza. Rzutować by to mogło istotnie na przebieg procesu chorobowego (zwłaszcza utajonego) w warunkach naturalnych, zwłaszcza w okresie wios:ny, kiedy pszczoły pracują intensywnie przy wychowie czerwiu, a często cierpią niedostatek pokarmu białkowego z powodu złych warunków pożytkowych. Dopływ pokarmu białkowego w tym okresie do rodziny pszczelej jest decydującym momentem w produkcji mleczka pszczelego, bardzo potrzebnego do wychowu czerwiu i tym samym nowych generacji pszczół. Na związek między dopływem pokarmu białkowego do rodziny a zwiększeniem liczby czerwiu, uzależnionym z kolei od ilości produkowanego przez pszczoły mleczka, zwraca uwagę D o u II (1976) omawiając znaczenie przede wszystkim naturalnego pokarmu białkowego jakim jest pyłek, dla rozwoju rodziny pszczelej, zwłaszcza w okresie wiosennym. Biorąc pod uwagę częste występowanie nozemozy wiosną w postaciutajonej, a także niedobory białkowe w rodzinach wiążące się z wyczerpaniem rezerw białkowo-tłuszczowych w organizmach starych pszczół i niezbyt obfitym wiosennym pyłkowym pożytkiem, koniecznym wydaje się uzupełnianie pszczołom w pokarmie białek i lipidów. Tabela 6 Table 6 Średnie arytmetyczne wartości poziomów białka całkowitego, lipidów całkowitych, glukozy i fruktozy hemo"imfy pszczół w oznaczeniach zerowych Arithmetic means of the values of levels of total protein, totallipids, glucose and fructose in the hemolymph of bees in zero determination Oznaczenie Białko Lipidy Glukoza Fruktoza Rok Determi- całkowite w g% całkowite w g% w mg% w mg% Year nation Total protein, Total lipids, g Y., g% Glucose, mg% Fructose, mg% 1975 1976 I II III IV 6,9 4,9 3,5 4,3 159,2 110,01 95,2 107,6 422,1 450,3 636,7 420,3 526,5 658,3 624,2 512,2 Porównując uzyskane wyniki badań dotyczące poziomu białka całkowitego w hemolimfie pszczół zarażonych Nosema apis i żywionych pokarmem z dodatkiem pierzgi, drożdży czy mleka, stwierdzić należy, że poziom ten najwyższy był w hemolimfie pszczół otrzymujących pierzgę, a następnie mleko. Poziom białka całkowitego w hemolimfie pszczół otrzymujących mleko w pokarmie był prawie na tym samym 195

1- to Ol Tabela 5 Table 5 Bezwzględna wartość różnicy między średnimi poziomów białka całkowitego, lipidów całkowitych, glukozy i fruktozy w poszczególnych grupach między 3 a 5, 3 a 7 i 3 a 10 dniem doświadczenia Absołute.value of thc difference between the average levels of total protein, total Ii ids, glucose and fructose in particular groups between 3rd and 5th, 3rd and 7th, 3td and 10th day of the experiment Białko całkowite" Lipidy całkowite Glukoza Fruktoza Rok Grupa Total proteiri Total lipids Glucose Fructose Year Group Ix.-xbl Ix,--x?1 Ix.-x)OI Ix,-x.1 IX3-X?1 Ix,-xlOI Ix3-x.1 Ixa-x?1 Ix,-xlOI IX.-Xbl lis-x?1 Ix.-xIIO l 2 _ 3_ 4 5 6-7 8 9 10 11 12 13 14 Pszczoły zdrowe O~ 0,4 0,48 74,6* 12,1 6,6 76,0 160,9., 33,1 34,0 21,0 0,6 Healty bees 1975 Pszczoły zarażone 1;1*: 2,5* 4,0* 24,3* -, 6,7 13,4 66,9 70,9 112,6 57,4 4,6 111,7 Infected bees Pszczoły zarażone na diecie bezbiałkowej 0,4 0,6* 1,3* 3,3 7,1 17,0* _112,5* 186,7* 118,5* 49,3 42,3 7,3 Infectcd bees on proteinless diet '- Pszczoły zarażone otrzymuią-: ce w pokarmie dodatek pierzgi 0,9* 0,2 1,2* 11,2 23,3* 0,2 25,3 392,0* 443,3* 172,4* 330,5* 366,5* Infected bees getting in food an addition of pollen Pszczoły zarażone na diecie..~.. bezbiałkowej 0,1 0,5* 10* 23,6* 40,9* 50,2* 82,9 38,2 1:83,5* 107,5 128,3* 156,7* Infected bees on proteinless diet. Pszczoły zarażone otrzymują- : 1976 ce w pokarmie dodatek drożdży 0,4 0,3 0,5* 31,6* 51,3* 55,8* 23,8 44,9 101,8 77,3 55,8 42,0

cd. tabeli 5 l I 2 _I 3 I 4 I 5 I 6 I 7 I 8 I 9 I 10 I 11 I 12 I 13 I 14 Infected.bee ~ gettin in food an addition ot' yeast Pszczoły zarażone na diecie bezbiałkowej 1,8* 0,7* -. 16,5 39,8* - 222,2* 318,9* - 257,0 191,4* Infected bees on protein1ess diet Pszczoły zarażone otrzymujące w pokarmie dodatek mleka. 0,8* 0,8* ** 14,0 52,2* ** 337,4* 183,6* ** 284,7* 189,0* łt* Infected bees getting in food an addtionof milk * różnica statystycznie istotna statistically significant difference ** pszczoły otrzymujące w pokarmie dodatek mleka padły między 8'8 10 dniem doświadczenia bees getting in food an addition of milk died between the 8th and 10th day of the experiment... CO ~

poziomie, co w hemolimfie pszczół żywionych pierzgą, jednak podkreślić należy jego szkodliwość dla pszczół. Dowodem szkodliwości dodatku mleka do pokarmu pszczół jest wysoki procent śmiertelności jeszcze przed ukończeniem doświadczenia. Niektórzy autorzy: A l j e v (1970), M e l n i k 1975), M a z a n e k (1976) sugerują dodatek do pokarmu pszczół mleka krowiego suszonego, odtłuszczonego, lub nawet mleka pełnotłustego jako namiastki pokarmu białkowego dla pszczół w okresie wiosennym. Nie wnikając w problem stymulacji dodatków białkowych na rozwój pasożyta, stwierdzić należy wysoką szkodliwość tego rodzaju namiastki pyłku w żywieniu pszczół. B ark e r i L e h n e r (1976) w swoich badaniach wykazali wysoką toksyczność dla pszczół laktozy, która spożywana przez pszczoły w koncentracji 6'% w roztworze sacharozy powodowała śmierć doświadczalnych pszczół po 8 dniach. Wysoką śmiertelność pszczół w wyniku spożywania laktozy tłumaczy się brakiem enzymu ~-glikozydazy (laktazy) w przewodzie pokarmowym pszczół. S z y m a ś i W ó j t o w s k i (1977) oceniając w warunkach laboratoryjnych przydatność różnych namiastek pyłku kwiatowego w żywieniu pszczół wykazali również najmniejszą przydatność odtłuszczonego mleka krowiego w żywieniu pszczół i wskazali również na wysoką śmiertelność pszczół w przypadku spożywania pokarmu zawierającego odtłuszczone suszone mleko krowie. W badaniach własnych ilość laktozy spożywanej przez zarażone pszczoły w przeliczeniu na 100 g ciasta miodowo-cukrowego wynosiła 5,2% i w tej koncentracji laktoza okazała się bardzo szkodliwa dla pszczół. Należy przypuszczać, że podanie pszczołom pokarmu zawierającego laktozę, nie tylko w warunkach laboratoryjnych, ale również w warunkach naturalnych, zwłaszcza w okresie występowania nozemozy w formie klinicznej utajonej, czy jawnej, pogrszy stan zdrowia pszczół doprowadzając do ciężkiej biegunki i przedwczesnej ich śmierci, niezależnie od toczącego się procesu chorobowego. Lipidy całkowite. Badania poziomu lipidów całkowitych w hemolimfie pszczół zarażonych wykazało statystycznie istotny wzrost poziomu lipidów w 5 dniu doświadczenia, a następnie nieznaczny spadek tego poziomu w 7 i 10 dniu doświadczenia. W grupie zdrowych pszczół poziom lipidów całkowitych także nieznacznie wzrósł w 5 dniu w porównaniu z 3 dniem obserwacji. W 7 dniu poziom ten nieznacznie się obniżył, a w 10 dniu był zbliżony do poziomu notowanego w 3 dniu obserwacji. Porównując średnie poziomów lipidów całkowitych w hemolimfie pszczół obu grup stwierdzono w 3, 5 i 10 dniu różnice statystycznie istotne na korzyść grupy pszczół zdrowych. Szczegółowe dane dotyczące poziomu lipidów całkowitych w poszczególnych dniach doświadczenia przedstawione są w tabeli 1, a dane dotyczące bezwzględnej wartości różnic między średnimi poziomu lipidów w obu grupach przedstawia tabela 5. W grupie pszczół zarażonych i otrzymujących w pokarmie dodatek pierzgi obserwowano w 7 dniu po zarażeniu spadek poziomu lipidów 198

całkowitych, chociaż wartości poziomu lipidów w 3 i 10 dniu były podobne (124,0 mff/o w 3 dniu i 123,8 mff/o w 10 dniu). Jednocześnie w hemolimfie pszczół kontrolnych obserwowano spadek poziomu lipidów w ciągu 10 dni doświadczenia, sttystycznie istotny w 10 dniu. Poziom lipidów w hemolimfie pszczół zarażonych i otrzymujących dodatek pierzgi był jednak wyższy od poziomu stwierdzonego u pszczół kontrolnych. Różnice między poziomami lipidów w obu grupach były statystycznie istotne dla wszystkich dni, w których prowadzono badania (tabela 2). W grupie pszczół zarażonych i otrzymujących w pokarmie dodatek drożdży stwierdzono stopniowy i statystycznie istotny spadek poziomu lipidów całkowitych. W trzecim dniu po zarażeniu wartość poziomu lipidów wynosiła 118,4 mg%, a w 10 dniu 62,6 mff/o. Podobnie spadek poziomu lipidów całkowitych stwierdzono w hemolimfie pszczół kontrolnych. Porównując jednak poziomy lipidów całkowitych w hemolimfie pszczół obu grup należy stwierdzić, że obserwowano ich wyższy poziom w hemolimfie pszczół zarażonych i otrzymujących dodatek drożdży. Różnice w średnich poziomach lipidów są statystycznie istotne dla obu tych grup we wszystkich dniach obserwacji. Szczegółowe dane przedstawia tabela 3 i tabela 5. W grupie pszczół zarażonych i otrzymujących w pokarmie mleko, obserwowano także spadek poziomu lipidów całkowitych hemolimfy, statystycznie istotny między 3 a 7 dniem obserwacji. Spadek poziomu lipidów zaznaczył się także w grupie pszczół kontrolnych. Różnicę statystycznie istotną wykazano przy porównaniu lipidów między 3 a 7 dniem doświadczenia (tabela 5). Poziom lipidów całkowitych w hemolimfie pszczół zarażonych i otrzymujących mieko był jednak wyższy od poziomu lipidów w hemolimfie pszczół kontrolnych. Różnice statystycznie istotne w poziomie lipidów hemolimfy pszczół obu grup wykazano w 3 i 5 dniu doświadczenia. Szczegółowe dane przedstawia tabela 4. W dostępnym piśmiennictwie prace dotyczące zawartości lipidów w hemolimfie pszczół są nieliczne. Według D e m i a n o w i c z a i Ki r- kor a (1972) whemolimfie pszczół znajdują się znikome ilości lipidów. Zawartość tłuszczu w hemolimfie zależy według T a r a n o va (1965) od pokarmu; w hemolimfie larw pszczelich stwierdza się od 0,370 do 0,58 % lipidopodobnych substancji. We wcześniejszych badaniach własnych określano zawartość lipidów całkowitych w hemolimfie pszczół zimujących. Stwierdzono u nich wahania poziomu lipidów całkowitych od 105,05 mff/o w listopadzie do 62,04 mg% w marcu (T o m a s z e w s k a, C z e r n i c h o w s k a 1976). Poziom lipidów całkowitych określanych w hemolimfie pszczół przy wykonywaniu badań zerowych (przed zarażeniem) był wyższy od stwierdzanego w hemolimfie pszczół zimujących. Fakt ten tłumaczyć należy inną porą (maj, czerwiec) wykonywanych badań oraz możliwością spożywania przez pszczoły pyłku kwiatowego w okresie bezpośrednio poprzedzającym wykonanie oznaczeń. 199

Poziom lipidów w hemolimfie pszczół wykazuje pewne wahania, jednak wyraźnie zaznaczyły się różnice w tym poziomie.przy 'Porównaniu wyników uzyskanych w grupach pszczół zarażonych i otrzymujących w pokarmie dodatki białkowe i w grupach pszczół zarażonych przebywających na diecie bezbiałkowej. W warunkach naturalnych związków o charakterze tłuszczowym dostarcza pszczołom pyłek kwiatowy.. Według D e m i a n o w i c z a i Kir kor a (1972)sucha masa pyłku kwiatowego w zależności od gatunku rośliny, z której pochodzi, zawiera od 0,16 do 3,56% tłuszczu. Lipidy w żywieniu pszczół są równie niezbędne, jak substancje białkowe, zwłaszcza w okresie produkcji mleczka pszczelego i wychowu czerwiu. Wykazane w badaniach własnych różnice w poziomie lipidów całkowitych hemolimfy u pszczół zarażonych i u pszczół zdrowych oraz u pszczół zarażonych a otrzymujących w pokarmie dodatki białkowo-lipidowe, wskazywać mogą na zaburzenia w metaboliżmie lipidów w trakcie trwania procesu chorobowego, a również na korzystny wpływ pokarmu zawierającego dodatki białkowo-tłuszczowe na organizmy pszczół mimo trwającego procesu chorobowego. Wyjątek stanowi tu grupa pszczół zarażonych a otrzymujących w pokarmie mleko. W hemolimfie tych pszczół stwierdzono wprawdzie w 3 i 5 dniu wyższy poziom lipidów aniżeli u pszczół zarażonych przebywających na diecie bezbiałkowej, jed.,. nak w 7 dniu poziom lipidów u tych pierwszych wyraźnie się obniżył. Ciekawe, choć trudne do wytłumaczenia, wydaje się zjawisko, że nie obserwowano równoległego spadku poziomu białka całkowitego i lipidów w tym dniu, który poprzedzał śmierć większości doświadczalnych pszczół karmionych mlekiem. Glukoza. Poziom glukozy w hemolimfie badanych pszczół wahał się w dość znacznych granicach, stwierdzono jednak wyższy poziomglukozy W hemolimfie pszczół zdrowych w porównaniu z poziomem notowanym u pszczół. zarażonych. Różnica statystycznie istotna. między poziomami glukozy w hemolimfie pszczół obu grup zaznaczona była w 7 i 10 dniudoświadczenia '(tabela 1). ;., W, hemolimfie pszczół zarażonych i, otrzymujących w pokarmie dodatek pierzgi stwierdzono w 3 i 5 dniu wzrost poziomu glukozy, a następnie spadek tego poziomu w 7 i 10 dniu doświadczenia. Różnice statystycznie istotne zaznaczone były między 3 a 7 i 3 a 10 dnierrrobserwacji, Bezwzględne wartości różnicy między średnimi poziomów glukozy w obu grupach przedstawione są w tabeli 5. U pszczół kontrolnych obserwowano statystycznie istotny stopniowy.spadek poziomu glukozy notowany we wszystkich dniach. Porównując wyniki badań poziomów glukozy w obu grupach stwierdzono wyższy poziom glukozy tylko w 3 i 5 dniu obserwacjli u pszczół zarażonych i otrzymujących w pokarmie dodatek pierzgi. Różnica statystycznie istotna notowana była w 5 dniu. W 7 i 10 dniu obserwacji poziom glukozy w hemolimfie pszczół zarażonych i nie otrzymujących 200

dane < pierzgi był wyższy aniżeli u pszczół spożywających pierzgę w pokarmie, jednak różnice między tymi poziomami nie były statystycznie istotne. Szczegółowe dane przedstawia tabela 2. W grupie pszczół zarażonych li. otrzymujących w pokarmie dodatek drożdży notowano nieznaczny spadek poziomu glukozy w 5 i 7 dniu doświadczenia, bardżiej zaznaczony w 10 dniu, jednak statystycznie nieistotny. W grupie pszczół kontrolnych spadek poziomu glukozy w hemolimfie był istotny tylko między 3 a 10 dniem doświadczenia. Porównując poziomy glukozy w hemolimfie pszczół obu grup w poszczególnych dniach stwierdzono wyższy jej poziom u pszczół otrzymujących w pokarmie dodatek drożdży. Różnica między tymi grupami była najbardziej zaznaczona w 10 dniu obserwacji, I jednak statystycznie nieistotna. W grupie pszczół zarażonych i otrzymujących w pokarmie dodatek mleka stwierdzono spadek poziomu glukozy, zwłaszcza zaznaczony między 3 a 7 dniem obserwacji i statystycznie istotny. Podobnie statystycznie istotny spadek poziomu glukozy stwierdzano między 3 a 7 dniem w hemolimfie pszczół grupy kontrolnej. Porównując poziomy glukozy w bernolimfie pszczół obu grup stwierdzono w 3 i 5 dniu doświadczenia wyższy poziom glukozy w hemolimfie' pszczół zarażonych i nie karmionych mlekiem. Różnica statystycznie istotna wystąpiła w 5 dniu. Natomiast w 7 dniu poziom glukozy w hemolimfie pszczół zarazonych i otrzymujących dodatek mleka był nieznacznie wyższy od poziomu notowanego u pszczół grupy kontrolnej. Fruktcza. Poziom fruktozy w hemolimfie pszczół zdrowych wykazywał tylko nieznaczne wahania we wszystkich kolejnych' dniach obserwacji, natomiast w hemolimfie pszczół zarażonych.wykazywał tendencje spadkowe we wszystkich dniach.' Różnica statystycznie istotna była notowana jedynie między 3 a 10 dniem po zarażeniu. W grupie pszczół zarażonych i otrzymujących w 3 i 5 dniu doświadczenia.: W 7 i 10 dniu zanotowano spadek tego poziomu. Różnice statystycznieistotne ujawniły się między 3 a 5,' 3 a 7 i 3a:'10 dniem po zarażeniu (tabela 5). U pszczół kontrolnych wartość poziomu fruktozy wykazywała wahania, ale różnice nie były statystycznie istotne. Porównując wyniki badań nad poziomem fruktozy w hemoliimfie pszczółvobu grup stwierdzono jedynie w 3 dniu wyższy jej poziom w hemolimfie pszczół zarażnych i otrzymujących dodatek pierzgi. Szczegółowe przedstawione są w tabela 2. W grupie pszczół zarażonych i otrzymujących w pokarmie dodatek drożdży stwierdzono wyrównany poziom fruktozy w hemolimfie we wszystkich dniach doświadczenia. U pszczół kontrolnych obserwowano po podwyższeniu poziomu fruktozy w 5 dniu, postępujący jego spadek, zwłaszcza zaznaczony w 7 i 10 dniu (różnica statystycznie istotna). Różnica ta jest szczególnie zaznaczona w 7 i 10 dniu doświadczenia na korzyść pszczół zarażonych, ale otrzymujących w pokarmie drc żdże. Szczegółowe dane przedstawia tabela 3. 201

W grupie pszczół zarażonych otrzymujących w pokarmie dodatek mleka stwierdzono spadek poziomu fruktozy, w hemolimfie w 5 i 7 dniu w porównaniu z 3 dniem doświadczenia. Różnica w wartościach poziomów była statystycznie istotna. U pszczół kontrolnych stwierdzono również spadek poziomu fruktozy (różnica statystycznie istotna) między 3 a 5 i 3 a 7 dniem. Poziom fruktozy u tych pszczół był jednak wyższy w poszczególnych dniach obserwacji aniżeli 4 pszczół zarażonych i otrzymujących dodatek mleka. Szczegółowe dane przedstawia tabela 41i 5. W dostępnym pliśmiennictwie znajdują się skąpe i niepełne dane na temat poziomu cukrów w hemolimfie pszczoły. Według W i g g l e s w 0- r t h a (1961) w hemolimfie pszczół głównym cukrem jest glukoza. Z monosacharydów obok glukozy stwierdzono obecność fruktozy; z dwucukrów występuje trehaloza (A l u m o t i wsp. 1969). S c h o n f e l d (1955) podaje, że średni poziom cukrów w hemolimfie pszczoły wynosi 2% z wahatriami od O do 4%. C z a r n o w s k y (1954) ustalił metodą chromatografii bibułowej, że u dorosłych pszczół w hemolimfie ogólny poziom cukrów wynosi 2000-2300 mg%, w tym znajduje się około 800-1300 mgofofruktozy. Według F lor k i n i J e n i a u x (1964) poziom glukozy w hemolimfie dorosłych pszczół waha się od 600 do 3200 mff/o, fruktozy od 200 do 1600 mgojo, a trehalozy od 600 do 1200 mff/o. W badaniach własnych nie można było z przyczyn metodycznych wykonać oznaczeń trehalozy, stąd wyniki badań odnoszą się tylko do mon sacharydów występujących w hemolimfie. W wyniku tych badań stwierdzono wprawdzie różnice statystycznie istotne w poziomach glukozy między poszczególnymi grupami pszczół, jednak nie można dopatrzeć się związku między poziomami tych cukrów w hemolimfne a żywieniem zarażonych pszczół dodatkami białkowo-tłuszczowymi. Jedynie w grupach pszczół zarażonych i pszczół zdrowych zaznaczyły się różnice statystycznie istotne w poziomach glukozy w 7 i 10 dniu obserwacji, a fruktozy w 10 dniu, które to różnice można by przypisywać zmianom chorobowym w organizmach zarażonych pszczół, tym więcej, że poziom tych cukrów w hemolimfie był niższy aniżeli u pszczół zdrowych. W interpretacji wyników badań dotyczących poziomów cukrów w hemolimfie pszczół należy zachować ogromną ostrożność, ponieważ ich poziom w hemolimfie jest bardzo zmienny i uzależniony od ilości węglowodanowego pokarmu, jaki pszczoły pobierają i spożywają. Na związek między poziomem cukrów w hemolimfie a zawartością ich w pokarmie zwraca uwagę M a u r i z i o (1965). Autorka ta również stwlierdziła, że charakter białkowego pokarmu nie wpływa na poziom cukrów w hemolimfie. Nie stwierdziła jednak u pszczół zarażonych Nosema apis zmian w składzie ilościowym i jakościowym cukrów hemolimfy. W świetle badań własnych wydaje się, że w przebiegu nożemozy u pszczół w sposób istotny zostaje naruszona tylko przemiana białkowa i metabolizm lipidów. Dodatek substancji białkowo-lipidowych do po- 202