Prace doświadczalne original papers Borgis Post Fitoter 2015; (16)4: 205-209 *Magdalena Woźniak 1, Izabela Ratajczak 1, Patrycja Kwaśniewska 2, Grzegorz Cofta 2, Elżbieta Hołderna-Kędzia 3, Bogdan Kędzia 3, Bartłomiej Mazela 2 Badanie aktywności ekstraktów propolisowych wobec wybranych gatunków grzybów pleśniowych 1 Katedra Chemii, Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu Kierownik Katedry: prof. dr hab. Piotr Goliński 2 Instytut Chemicznej Technologii Drewna, Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu Dyrektor Instytutu: prof. dr hab. Bartłomiej Mazela 3 Instytut Włókien Naturalnych i Roślin Zielarskich w Poznaniu Dyrektor Instytutu: prof. dr hab. Grzegorz Spychalski THE ACTIVITY OF PROPOLIS EXTRACTS AGAINST SELECTED MOULDS SUMMARY The aim of the study was to examine activity of propolis extracts against moulds. There were six strains of moulds examined in the study: Aspergillus niger, Penicillium pinophilum, Trichoderma virens, Aspergillus versicolor, Paecilomyces variotii and Chaetomium globosum. The antifungal test was performed by methods of serial dilutions on fluid media Sabouraud Broth. The MIC and MFC of the selected propolis extracts were determined in relation to A. niger in the preliminary research. A. niger and the other five moulds species were used in the second step of study, where the acetone and ethanolic extracts were already selected. The acetone extract showed the highest antifungal activity. Other propolis extracts showed lower activity against examined moulds. It has been proved that propolis extracts are potential antifungal substances for eco-friendly wood protection. KEYWORDS: PROPOLIS ANTIFUNGAL ACTIVITY MOULDS Wprowadzenie Propolis jako substancja pochodzenia naturalnego ze względu na swoje liczne korzystne właściwości znajduje szerokie zastosowanie w różnych dziedzinach przemysłu. Jest on składnikiem suplementów diety, kosmetyków i zdrowej żywności (1). Ponadto doniesienia piśmiennictwa wskazują na możliwości zastosowania propolisu w optoelektronice oraz ochronie drewna (2, 3). Takie liczne zastosowanie i popularność tego surowca wynika z faktu, iż jego ekstrakty wykazują aktywność biologiczną, m.in. właściwości przeciwbakteryjne, przeciwgrzybicze, przeciwutleniające, przeciwwirusowe i przeciwnowotworowe (1, 4, 5). Aktywność przeciwgrzybicza propolisu jest jedną z najczęściej badanych właściwości tego produktu. Ekstrakty propolisowe wykazują zdolność hamowania wzrostu grzybów powodujących choroby skóry u ludzi czy choroby roślin. Doniesienia piśmiennictwa wskazują również na możliwości wykorzystania ekstraktów propolisu w ochronie drewna przed korozją biologiczną (2, 6-8). Wykazano aktywność ekstraktów propolisowych wobec takich gatunków grzybów, jak Candida albicans, Trichophyton cutaneum, Alternaria alternata, Trichoderma reesei, Penicillium italicum oraz Gloeophyllum trabeum (1, 2, 6-8). Mimo że właściwości przeciwgrzybicze propolisu są jednymi z najczęściej opisywanych właściwości biologicznych tego surowca, dotyczą one zazwyczaj grzybów powodujących stany chorobowe u ludzi, jak np. drożdżoidalne grzyby z rodzaju Candida spp., znacznie mniej jest doniesień wykazujących aktywność propolisu wobec gatunków grzybów występujących na owocach, roślinach czy drewnie. Niewiele jest również dostępnych danych piśmiennictwa na temat aktywności ekstraktów propolisu wobec gatunków grzybów pleśniowych zastosowanych w niniejszej pracy. Doniesienia naukowe wykazują, że ekstrakty propolisu hamują rozwój grzyba A. niger (13, 14) oraz innych gatunków z tego rodzaju (13, 15). Ponadto z licznych prac wynika, że propolis skutecznie zapobiega rozwojowi grzybów pleśniowych z rodzaju Penicillium spp. (6, 15) oraz Trichoderma spp. (7). Doniesienia piśmiennictwa wskazują również 205
Magdalena Woźniak i wsp. na fakt, że grzyby pleśniowe wykazują znacznie większą oporność wobec aktywnych składników propolisu niż np. bakterie Gram-dodatnie (8, 15). Do określania właściwości przeciwgrzybiczych propolisu stosowane są ekstrakty uzyskane przy wykorzystaniu takich rozpuszczalników, jak alkohol metylowy, chlorek metylenu, octan etylu, alkohol etylowy, alkohol n-butylowy oraz aceton. Stwierdzono, że w zależności od zastosowanego do ekstrakcji rozpuszczalnika, zdolność hamowania rozwoju badanych drobnoustrojów przez ekstrakty propolisowe jest różna (6, 9-11). Jednakże w większości przypadków prace te dotyczą ekstrakcji wieloetapowych, gdzie z jednej porcji surowca pozyskiwane są kolejne frakcje wykorzystywane do badań. W niniejszej pracy przedstawiono wyniki oznaczania aktywności ekstraktów propolisu uzyskanych w wyniku jednoetapowej ekstrakcji surowca. Cel pracy Celem pracy było określenie działania ekstraktów propolisu otrzymanych w wyniku ekstrakcji surowca różnymi rozpuszczalnikami wobec wybranych gatunków grzybów pleśniowych. Materiały i metody Ekstrakty propolisu W pierwszym etapie badań wykorzystano 10 różnych ekstraktów propolisu. Otrzymano je na drodze ekstrakcji 10 g surowca za pomocą 100 ml rozpuszczalnika (1:10, m/v). Do ekstrakcji zastosowano następujące rozpuszczalniki: heksan, chloroform, octan etylu, chlorek metylenu, alkohol n-butylowy, wodę dejonizowaną, 96% alkohol etylowy, 70% alkohol etylowy, alkohol metylowy i aceton (6, 9-11). Ekstrakcję prowadzono przez 5 dni z wykorzystaniem wytrząsarki, bez dostępu światła, w temperaturze pokojowej. Po tym czasie ekstrakty sączono i zagęszczano do suchej masy pod zmniejszonym ciśnieniem. Następnie suchą pozostałość rozpuszczano w dimetylosulfotlenku (DMSO), w stężeniu 100 mg/ml. W drugim etapie wykorzystano ekstrakty propolisu uzyskane za pomocą acetonu oraz 70 i 96% alkoholu etylowego (1:10, m/v). Sposób otrzymywania opisano powyżej. Następnie ekstrakty rozpuszczano w 70% alkoholu etylowym w stężeniu 100 mg/ml. Grzyby pleśniowe stosowane w badaniach W badaniach wykorzystano 6 szczepów wzorcowych grzybów pleśniowych: Aspergillus niger Tieghem (ATCC 6275), Aspergillus versicolor, Penicillium pinophilum Thom (CMI 114933), Paecilomyces variotii Bainire (ATCC 9645), Trichoderma virens Miller i in. (ATCC 9645) oraz Chaetomium globosum Kunze: Fries (ATCC 6205). Szczepy przechowywano na pożywkach stałych Sabouraud Agar (Sigma-Aldrich) w temperaturze 4-6 C, przeszczepiając je raz w miesiącu na świeże podłoże agarowe, w celu zachowania czystości hodowli. Określenie właściwości przeciwgrzybiczej Z roztworów wyjściowych ekstraktów propolisowych w DMSO (100 mg/ml) przygotowano rozcieńczenia w płynnym podłożu Sabouraud Dextrose Broth (Sigma-Aldrich) w granicach 0,5-10 mg/ml. Następnie do każdego rozcieńczenia ekstraktu propolisu w podłożu o objętości 1 ml dodawano po 0,1 ml zawiesiny badanego szczepu A. niger. Zawiesinę odpowiednio rozcieńczano w tym samym podłożu płynnym co ekstrakty propolisu. Liczba dodawanych strzępek mieściła się w zakresie 10 4-10 5 w 1 ml. Inkubację prowadzono w temperaturze 28 C przez okres 7 dni. Po tym czasie określano najmniejsze stężenia ekstraktów propolisu hamujące rozwój badanego szczepu MIC (ang. Minimal Inhibitory Concentration) oraz minimalne stężenia grzybobójcze MFC (ang. Minimal Fungicidal Concentration). Podobnie postępowano z roztworami wyjściowymi ekstraktów propolisowych w 70% alkoholu etylowym. Do każdego rozcieńczenia tych ekstraktów dodawano odpowiednio rozcieńczone zawiesiny wszystkich 6 badanych szczepów grzybów pleśniowych. Jako substancję referencyjną zastosowano przeciwgrzybiczy, syntetyczny związek chemiczny: 4,5-dichloro-2-oktylo- -2H-izotiazol-3-on. Wyniki i ich omówienie W tabeli 1 przedstawiono wydajność ekstrakcji składników propolisu z wykorzystaniem wybranych do badań rozpuszczalników. Największą wydajność ekstrakcji uzyskano stosując jako rozpuszczalnik chloroform oraz n-butanol, najmniejszą wydajnością natomiast odznaczał się ekstrakt wodny. Wydajność ekstrakcyjną w procentach wagowych obliczono według wzoru przedstawionego przez Merestę (12): B 100% A = % wagowy procesu ekstrakcji A masa propolisu użyta do ekstrakcji, B masa suchego ekstraktu po zagęszczeniu. Tabela 1 przedstawia charakterystykę ekstraktów propolisu pod względem ich działania hamującego rozwój szczepu testowego Aspergillus niger (MIC) 206
Badanie aktywności ekstraktów propolisowych wobec wybranych gatunków grzybów pleśniowych Tabela 1. Wydajność ekstrakcji składników propolisu z wykorzystaniem różnych rozpuszczalników oraz charakterystyka ich oddziaływania na szczep A. niger. Rozpuszczalnik Wydajność ekstrakcji [%] MIC MFC Heksan 12,2 7,5 7,5 Chloroform 93,1 2 5 Octan etylu 69,8 2,5 5 Chlorek metylenu 62,7 5 5 Alkohol n-butylowy 87,0 5 7,5 Woda dejonizowana 1,8 5 5 Alkohol etylowy 96% 66,4 5 7,5 Alkohol metylowy 56,8 5 5 Alkohol etylowy 70% 56,1 5 7,5 Aceton 68,5 1 1 oraz działania grzybobójczego (MFC). Na podstawie przeprowadzonych badań można stwierdzić, że największą aktywność przeciwgrzybiczą wykazywał ekstrakt acetonowy. Wartości MIC i MFC wyniosły w obydwu przypadkach 1 mg/ml. Nieco niższą aktywność przeciwgrzybiczą wykazał ekstrakt sporządzony przy użyciu chloroformu i octanu etylu. Wartości MIC i MFC dla tych ekstraktów wyniosły odpowiednio 2 i 5 oraz 2,5 i 5 mg/ml. Pozostałe ekstrakty wykazywały zbliżoną aktywność przeciwgrzybiczą wobec A. niger, dla których, poza ekstraktem heksanowym, MIC wynosiło 5 mg/ml. Wszystkie badane ekstrakty wykazywały taką samą lub wyższą aktywność przeciwgrzybiczą w porównaniu do etanolowego ekstraktu propolisu opisanego w pracy przeglądowej autorstwa Kędzi i wsp. (8). Na podstawie przedstawionych badań wstępnych do dalszych testów wytypowano ekstrakt acetonowy i ekstrakty etanolowe (uzyskane w wyniku ekstrakcji 70 i 96% alkoholem etylowym). Wyboru dokonano w oparciu o uzyskane wyniki dotyczące aktywności biologicznej (aceton) oraz uwzględniając aspekt ekologiczny i ekonomiczny (alkohol etylowy). W tabeli 2 przedstawiono wyniki badania aktywności przeciwgrzybiczej ekstraktów propolisowych wobec wybranych gatunków grzybów pleśniowych. Najbardziej podatny na działanie wszystkich badanych ekstraktów był szczep C. globosum, dla którego MIC Tabela 2. Charakterystyka wytypowanych ekstraktów propolisu pod względem działania hamującego rozwój grzybów testowych oraz działania grzybobójczego. Szczepy testowe grzybów pleśniowych Ekstrakty propolisowe Aceton Alkohol etylowy 70% Alkohol etylowy 96% 4,5-dichloro-2-oktylo- -2H-izotiazol-3-on MIC MFC MIC MFC MIC MFC MIC MFC A. niger 7,5 10,0 7,5 10,0 7,5 10,0 0,75 1,0 A. versicolor 7,5 7,5 7,5 10,0 7,5 7,5 0,75 1,0 C. globosum 0,75 2,0 2,0 5,0 1,0 1,5 0,5 0,75 P. variotii 2,0 5,0 5,0 5,0 7,5 7,5 0,75 1,0 P. pinophilum 7,5 7,5 5,0 7,5 5,0 7,5 0,75 1,0 T. virens 5,0 5,0 5,0 7,5 5,0 7,5 1,0 1,0 207
Magdalena Woźniak i wsp. wynosiło od 0,75 mg/ml dla ekstraktu uzyskanego w wyniku ekstrakcji acetonem do 2,0 mg/ml dla ekstraktu propolisowego uzyskanego za pomocą 70% alkoholu etylowego (MFC w zakresie 1,5-5,0 mg/ml). A. niger i A. versicolor wykazywały największą oporność wobec analizowanych ekstraktów propolisu (MIC 7,5 mg/ml). Wartości MIC i MFC dla badanych ekstraktów były znacznie wyższe niż dla 4,5-dichloro-2-oktylo-2H- -izotiazol-3-on. Na podstawie uzyskanych wyników można stwierdzić, że nie ma znacznych różnic w aktywności przeciwgrzybiczej ekstraktów etanolowych (uzyskanych w wyniku ekstrakcji alkoholem etylowym 70 i 96%) wobec badanych gatunków grzybów, co jest zgodne z wynikami uzyskanymi przez Mavri i wsp. (15). Autorzy stwierdzili, że ekstrakty propolisu otrzymane w wyniku ekstrakcji alkoholem etylowym 70 i 96% wykazują taką samą aktywność wobec badanych szczepów bakterii i grzybów (15). Również Meresta (12) stwierdził, że przy użyciu roztworów alkoholu etylowego w stężeniu od 70 do 96% otrzymuje się ekstrakty propolisu o identycznej aktywności przeciwbakteryjnej. Autor nie wspomina jednak, czy podobną zależność otrzymał on także w odniesieniu do grzybów. Natomiast Kacaniova i wsp. (13) w swoich badaniach wykazali, że ekstrakt propolisu uzyskany w wyniku ekstrakcji alkoholem etylowym 70% wykazywał wyższą aktywność przeciwgrzybiczą i przeciwbakteryjną, niż ekstrakt uzyskany za pomocą alkoholu etylowego 96%. Na podstawie przedstawionych w pracy wyników badań można stwierdzić, że aktywność przeciwgrzybicza ekstraktów propolisu jest różna w zależności od zastosowanego do ekstrakcji rozpuszczalnika. Najlepszą aktywnością przeciwgrzybiczą wobec badanych szczepów grzybów pleśniowych charakteryzował się ekstrakt acetonowy. Wyniki przeprowadzonych badań pokazują również, że aktywność przeciwgrzybicza ekstraktów propolisu uzyskanych z zastosowaniem alkoholu etylowego 70 i 96% jest bardzo zbliżona. Warto wiedzieć, że gatunki grzybów pleśniowych wykorzystane w badaniach są gatunkami rozwijającymi się na owocach, roślinach uprawnych oraz elementach wykonanych z drewna. Dlatego uzyskane wyniki aktywności przeciwgrzybiczej wszystkich badanych ekstraktów propolisowych wskazują na ich potencjalną możliwość wykorzystania w nietoksycznych i bezpiecznych dla środowiska preparatach impregnacyjnych, zabezpieczających drewno (np. opakowania mające kontakt z żywnością) przed szkodliwym działaniem grzybów pleśniowych powodujących jego rozkład. Podjęta tematyka badań wychodzi naprzeciw obecnym trendom poszukiwań bezbiocydowych, przyjaznych dla środowiska preparatów impregnacyjnych, opartych na substancjach pochodzenia naturalnego. Ponadto jest konsekwencją licznych ograniczeń w stosowaniu substancji biologicznie czynnych w środkach ochrony drewna wprowadzonych przez Unię Europejską (m.in. Dyrektywy: 1998/8/WE, 2004/42/WE) oraz rozporządzenia krajowe. Należy podkreślić, że w wielu przypadkach produkty naturalne charakteryzują się mniejszą aktywnością przeciwgrzybiczą niż syntetyczne związki chemiczne, natomiast ich zaletą jest niska toksyczność dla ludzi i środowiska. Wnioski 1. Spośród 10 badanych ekstraktów propolisu, największą zdolność hamowania rozwoju grzybów pleśniowych wykazał ekstrakt acetonowy. 2. Aktywność przeciwgrzybicza etanolowych ekstraktów propolisu (70 i 96%) jest bardzo zbliżona. 3. Powyższe badania wskazują na potencjalne zastosowanie ekstraktów propolisu jako składników nietoksycznych i przyjaznych dla środowiska impregnatów ochronnych do drewna. Badania zostały współfinansowane ze środków z dotacji na prowadzenie badań naukowych lub prac rozwojowych służących rozwojowi młodych naukowców oraz uczestników studiów doktoranckich na Wydziale Technologii Drewna (nr zadania badawczego: 507.472.40) oraz ze środków funduszy norweskich, w ramach programu Polsko-Norweska Współpraca Badawcza realizowanego przez Narodowe Centrum Badań i Rozwoju (umowa nr Pol-Nor/203119/32). Piśmiennictwo 1. Castaldo S, Capasso F. Propolis, an old remedy used in modern medicine. Fitoterapia 2002; suppl. 1:1-6. 2. Budija F, Humar M, Kricej B i wsp. Propolis for wood finishing. IRG/WP 2008; 08-30464. 3. Drapak SI, Bakhtinov AP, Gavrylyuk SV i wsp. Structural and optical characterization of the propolis films. Appl Surf Sci 2006; 253:279-82. 4. Kujumgiev A, Tsvetkova I, Serkedjieva Y i wsp. Antibacterial, antifungal and antiviral activity of propolis of different geographic origin. J Ethnopharmacol 1999; 64:235-40. 5. Banskota AH, Tezuka Y, Kadota S. Recent progress in pharmacological research of propolis. Phytother Res 2001; 15:561-71. 6. Yang SZ, Peng LT, Su XJ i wsp. Bioassay-guided isolation and identification of antifungal components from propolis against Penicillium italicum. Food Chem 2011; 127:210-5. 7. Curifuta M, Vidal J, Sanchez-Venegas J. The in vitro antifungal evaluation of a commercial extract of Chilean propolis against six fungi of agricultural importance. Cien Inv Agr 2012; 39(2):347-59. 8. Kędzia B, Hołderna-Kędzia E. Aktywność antybiotyczna propolisu krajowego i europejskiego. Post Fitoter 2013; 2:97-107. 9. Meneses EA, Durango DL, Garcia CM. Antifungal activity against postharvest fungi by extracts from Colombian propolis. Quim Nova 2009; 32(8):2011-7. 10. Aguero MB, Svetaz L, Sanchez M i wsp. Argentinean Andean propolis associated with the medicinal plant Larrea nitida Cav. (Zygophyllaceae). HLPC-MS and GC- MS characterization and antifungal activity. Food Chem Toxicol 208
Badanie aktywności ekstraktów propolisowych wobec wybranych gatunków grzybów pleśniowych 2011; 49:1970-8. 11. Prytzyk E, Dantas AP, Salomao K i wsp. Flavonoids and trypanocidal activity of Bulgarian propolis. J Ethnopharmacol 2003; 88:189-93. 12. Meresta T. Ekstrahowanie propolisu. Pszczelnictwo 1997; 3:5-6. 13. Kacaniova M, Vukovic N, Chlebo R i wsp. The antimicrobial activity of honey, bee pollen loads and beeswax from Slovakia. Arch Biol Sci 2012; 64(3):1545-57. 14. Mohammadzadeh S, Shariatpanahi M, Hamedi M i wsp. Chemical composition, oral toxicity and antimicrobial activity of Iranian propolis. Food Chem 2007; 103:1097-103. 15. Mavri A, Abramovic H, Polak T i wsp. Chemical properties and antioxidant and antimicrobial activities of Slovenian propolis. Chem Biodivers 2012; 9:1545-58. otrzymano/received: 08.09.2015 zaakceptowano/accepted: 14.10.2015 Adres/address: *mgr Magdalena Woźniak Katedra Chemii Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu ul. Wojska Polskiego 75, 60-625 Poznań tel. +48 (61) 848-78-38 e-mail: magdalena.wozniak@up.poznan.pl 209