Novazym Products Zestaw do identyfikacji materiału genetycznego pierwotniaka Babesia canis canis techniką Loop-mediated Isothermal AMPlification (LAMP) Numery katalogowe produktu: AML-Bc-200 AML-Bc-400 Wydanie 1 (październik 2012)
1. Przeznaczenie testu Babeszjoza jest groźną chorobą inwazyjną ludzi i zwierząt. Rodzaj Babesia liczy około 110 gatunków patogennych dla szerokiego spektrum kręgowców, w tym i człowieka. Głównym czynnikiem etiologicznym babeszjozy u psów jest gatunek Babesia canis, gatunek zbiorczy, reprezentowany przez 3 podgatunki: B. canis canis, B. canis rossi i B. canis vogeli, dla których wektorami są kleszcze. Zarażenie kręgowca następuje poprzez ślinę, podczas ssania krwi przez zarażonego pierwotniakami kleszcza. Pierwotniaki Babesia bezpośrednio atakują czerwone krwinki i niszczą je, doprowadzając do anemii, uszkodzenia wątroby i nerek oraz innych narządów wewnętrznych. Babeszjoza w błyskawicznym tempie sieje spustoszenie w organizmie psa, a nieleczona lub leczona niewłaściwie szybko prowadzi do zgonu. Test pozwala na jakościową detekcję DNA pierwotniaków z gatunku Babesia canis canis w krwi psów chorych na babeszjozę. W zależności od wielkości, zestaw pozwala na przeprowadzenie 200 i 400 testów. Zestaw zawiera: - Isothermal Master Mix (bufor reakcyjny, dntps, polimeraza GspSSD, barwnik fluorescencyjny pochodna 6-FAM) - Primers (F3, B3, FIP, BIP każdy w stężeniu 10 µm) - kontrolę pozytywną DNA (sekwencja DNA amplikonu w wektorze plazmidowym) - sterylną wodę MiliQ do reakcji. 2. Zasada działania testu Test oparty jest na technice LAMP (ang. Loop-mediated Isothermal Amplification) i zapewnia bardzo szybką oraz wysoce specyficzną identyfikację materiału genetycznego pierwotniaka Babesia canis. Zoptymalizowane mieszaniny i specjalnie zaprojektowane startery umożliwiają specyficzną amplifikację konserwatywnego regionu DNA występującego w genomie Babesia canis. Wysoka czułość testu pozwala na detekcję nawet 0,1 pg DNA patogenu. Czas potrzebny na przeprowadzenie reakcji to ok. 30 minut w przypadku wykorzystania standardowego termocyklera oraz 15-20 minut w przypadku termocyklera do Real-time PCR lub platformy Genie II. Test oparty o metodę amplifikacji LAMP jest co najmniej dwukrotnie szybszy od testu opartego o standardową amplifikację PCR. www.novazym.com 2
W zależności od urządzenia wykorzystanego do przeprowadzenia testu, różni się sposób analizy wyników testu: PLATFORMA Termocykler do PCR Termocykler do Real-time PCR Platforma Genie II do LAMP SPOSÓB ANALIZY WYNIKÓW Rozdział elektroforetyczny w żelu agarozowym Obserwacja fluorescencji w probówce w świetle UV Analiza krzywej topnienia produktu po reakcji LAMP Analiza krzywej topnienia produktu po reakcji LAMP Produkt reakcji wybarwiony bromkiem etydyny w żelu agarozowym ma postać tzw. drabinki (ang. Ladder-pattern structure), ponieważ w wyniku reakcji LAMP powstają różnej długości konkatamery złożone z powtórzeń sekwencji matrycowej. Wynik pozytywny reakcji można również zaobserwować w postaci silnej fluorescencji produktów reakcji w świetle UV. Wynik pozytywny reakcji przeprowadzonej w termocyklerze do Real-time PCR oraz na platformie Genie II umożliwia analizę przyrostu ilości produktu w czasie rzeczywistym (proporcjonalnie do wzrostu emisji fluorescencji, odczytywanej przez kanał FAM). Możliwa jest również analiza specyficzności reakcji na podstawie profilu topnienia produktów amplifikacji (ang. Melt Curve Analysis). W analizie Melt Peak widoczny jest jeden specyficzny produkt reakcji. Zaleca się prowadzenie analizy wyników testu w układzie zamkniętym (wizualizacja w świetle UV lub na podstawie analizy profilu topnienia produktów reakcji). 3. Zawartość zestawu Lp. Oznaczenie Element zestawu [1] [2] [3] [4] Isothermal Master Mix Primers Positive Control Woda MiliQ sterylna do reakcji MiliQ Water AML-Bc- 200 AML-Bc- 400 2 4 4 4 1 1 1 1 Warunki przechowywania: przechowywanie długoterminowe -20 C przy częstym, rutynowym użyciu +4 C chronić przed światłem unikać częstego zamrażania i rozmrażania. www.novazym.com 3
4. Zalecana procedura przed analizą LAMP Szybka izolacja genomowego DNA z krwi obwodowej psa z wykorzystaniem zestawu Nova FAST Blood Genomic DNA Purification KIT, Novazym Polska. 5. Przeprowadzenie testu Warunki reakcji STANDARD PCR Etap Temperatura Czas Ilość cykli Amplifikacja 66 C 35 min 1 Chłodzenie 4 C 1 min REAL-TIME PCR Etap Temperatura Czas Ilość cykli Amplifikacja 66 C 30 sek 70 Pomiar fluorescencyjny ilości produktu amplifikacji po każdym cyklu reakcji, w czasie rzeczywistym Topnienie produktu 66 98 C 0,5 C / 5 sek Pomiar fluorescencji po każdorazowej zmianie temp. o 0,5 C Chłodzenie 40 C 30 sek Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej Lp. [1] [2] [3] [4] Oznaczenie probówki Element zestawu Objętość na 1 reakcję 15 µl Isothermal Master Mix Primer F3/B3 10 µm 0,5 µl 5 µl Primer FIP/BIP 10 µm 2 µl Positive Control 1 µl lub inna matryca DNA 4 µl MiliQ Water RAZEM 25 µl www.novazym.com 4
Obligatoryjne kontrole testu Dla prawidłowej interpretacji wyników testu należy obok próbek badanych zastosować trzy kontrole reakcji: kontrolę pozytywną reakcji (Positive Control), która pozwala ocenić poprawność przebiegu amplifikacji docelowego produktu matrycę stanowi próbka zawierająca amplifikowaną sekwencję DNA [3]. kontrolę negatywną reakcji, która pozwala ocenić poprawność przebiegu amplifikacji matrycę stanowi izolat z krwi obwodowej psa zdrowego. kontrolę negatywną reakcji bez matrycy DNA, która pozwala ocenić czystość odczynników używanych do reakcji amplifikacji LAMP zamiast matrycy, woda MiliQ [4]. Fakultatywnie kontrole testu Okresowo zaleca się przeprowadzić: kontrolę negatywną izolacji DNA pozwala ocenić czystość odczynników do izolacji. Należy wykonać jedną taką kontrolę w każdej serii izolacji lub okresowo w krótkich odstępach czasu, izolując z wody (zamiast z krwi psa). kontrolę pozytywną izolacji pozwala potwierdzić skuteczność procesu izolacji. Należy stosować okresowo np. dla nowej partii odczynników do izolacji DNA (do izolacji należy podać krew naturalnie lub sztucznie zanieczyszczoną pierwotniakiem Babesia canis). www.novazym.com 5
UWAGA! Wysokie ryzyko kontaminacji miejsca pracy! Aby zapobiegać kontaminacji laboratorium produktami amplifikacji LAMP, należy zwrócić szczególną uwagę, aby nie otwierać probówek z produktami amplifikacji w tym samym pomieszczeniu, gdzie jest wykonywany proces izolacji DNA Babesia canis oraz przygotowywanie mieszaniny reakcyjnej do testu. Reakcję LAMP charakteryzuje bardzo wysoka wydajność - powstaje nawet do 25 µg DNA, zawierającego bardzo dużą liczbę kopii amplikonu! Zalecamy wykonywanie izolacji DNA i przygotowywanie mieszaniny reakcyjnej w innym pomieszczeniu, niż rozdział elektroforetyczny produktów amplifikacji. Pomimo możliwości analizy wyników reakcji w żelu agarozowym, zalecamy korzystanie z możliwości wykonania reakcji i analizy wyników w układzie zamkniętym, bez konieczności otwierania probówek z produktami reakcji LAMP (obserwacja fluorescencji produktów amplifikacji w probówce w świetle UV oraz wykorzystanie do wykonania testu aparatu do Real-time PCR lub platformy Genie II). Technologia LAMP została wynaleziona i jest własnością firmy Eiken Chemical Co., Ltd. Lot nr: Data ważności: www.novazym.com 6