Ćwiczenie 1 Metodyka poprawnych i dokładnych pomiarów absorbancji, wyznaczenie małych wartości absorbancji. Czynniki wpływające na mierzone widma absorpcji i wartości absorbancji dla wybranych długości fali. Zagadnienia: spektroskopia absorpcyjna, prawa absorpcji, budowa i działanie spektrofotometru, czynniki wpływające na mierzone widma absorpcji i wyznaczane wartości absorbancji, dobór warunków dla pomiaru widm absorpcji i wyznaczania poprawnych wartości absorbancji, błędy przypadkowe i systematyczne w pomiarach absorbancji. Wstęp Pomiary widm absorpcji w zakresie ultrafioletu (UV) i części widzialnej (VS) wykonuje się bardzo często, zarówno w badaniach jakościowych jak i ilościowych. W tym celu stosuje się spektrofotometry pracujące najczęściej w zakresie spektralnym λ=200-800 nm (ν=50000-12500 cm -1 ). Korzystając z nich można wykonywać także pomiary w zakresie ultrafioletu próżniowego, =175-200 nm, (ν-57140-50000 cm -1 ) przedmuchując komorę, w której znajdują się kuwety z próbkami gazowym azotem. Możliwe są też pomiary w zakresie bliskiej podczerwieni (NR) do 4000 nm (ν-2500 cm -1 ), sięgającym aż do zakresu spektralnego, w którym stosuje się spektrometry R i Ramana. Część teoretyczna. Poprawny pomiar absorbancji A ma bezpośredni wpływ na błąd wyznaczanych wartości molowego współczynnika absorpcji (równanie 1), stężenie badanego związku w próbce c (równanie 2), wydajność kwantową jego emisji E (równanie 3) i zaniku fotochemicznego, FOT (równanie 4). A c l (1) A c (2) l E E abs (3) 1
FOT c (4) abs gdzie: l[cm]-grubość warstwy roztworu w kuwetce próbki, E -liczba kwantów emitowanych przez badany związek, abs -liczba kwantów zaabsorbowanych przez badany związek wyznaczona z równania 5 lub z pomiarów aktynometrycznych, c-liczba cząsteczek badanego związku, które zaniknęły w reakcji fotochemicznej. wzb (1 10 A ) (5) abs 0 gdzie: 0 -intensywność światła padającego na próbkę. Absorbancję próbki, w której absorbuje jeden związek opisuje ilościowo prawo Lamberta- Beera (6a): absorbancja skolimowanej wiązki monochromatycznego promieniowania w jednorodnym, izotropowym ośrodku jest proporcjonalna do wartości molowego współczynnika absorpcji (mol -1. cm -1. dm 3 ) i do stężenia c (mol. dm -3 ) badanego związku oraz do długości drogi optycznej (l), na której zachodzi absorpcja. Molowy współczynnik absorpcji (ε), który zależy od długości fali charakteryzuje własności absorpcyjne każdego związku. Ta zależność jest faktycznie widmem absorpcji. Wartość molowego współczynnika absorpcji w zależności od typu przejścia ( *, n *, *, itp.) może zmieniać się w bardzo szerokim zakresie od wartości niewiele większych od zera (np. ε = 10-2 mol -1 dm 3 cm -1, na długofalowym ogonie pasma absorpcji), aż do wartości ~ 10 6 mol -1 dm 3 cm -1, dla przejść w pełni dozwolonych. Jeśli w badanej próbce obecne jest tylko jedno indywiduum (tj. najczęściej pojedyncze cząsteczki badanego związku), to wartość ε nie zależy od stężenia. Absorbancję próbki, w której absorbuje więcej niż jeden związek opisuje prawo addytywności absorbancji (6b). A c l (6a) A A1 A2 A3 A i (6b) Eksperymentalnie wartość absorbancji A zgodnie z równaniem (7) jest 2
wyznaczana w oparciu o pomiar intensywności światła przepuszczonego (transmitowanego) przez kuwetę z badanym roztworem T, które dotarło do detektora, a którym jest najczęściej fotopowielacz. A o log logt (7) T Wpływ na wartość T obok absorpcji promieniowania przez próbkę mają także: odbicie światła ( odb ) na przedniej i tylnej ścianie kuwety z badanym roztworem, absorpcja tego światła przez samą kuwetę ( a-k ), rozpraszanie światła w rozworze ( rozp ) a także absorpcja światła przez rozpuszczalnik ( a-r ) i ewentualne zanieczyszczenia w nim obecne ( a-z ). Tak więc, w rzeczywistych pomiarach absorpcyjnych wartość T opisuje równanie 8. T = 0 - abs -( odb + rozp + a-k + a-r + a-z ) (8) Niezależnie od tego czy pomiar absorbancji odbywa się w spektrofotometrze dwuwiązkowym (jednoczesny pomiar dla próbki i dla odnośnika) czy też jednowiązkowym (kolejno pomiar dla próbki i dla odnośnika) przyjmuje się, że w pomiarach absorpcji spełnione jest równanie 9 T 0 abs (9) Aby to podstawowe równanie było spełnione wszystkie wartości w równaniu 8 oprócz abs muszą być takie same dla próbki i dla odnośnika. Tylko w takich warunkach spełnione jest równanie Lamberta-Beera, a zmierzone wartości A( ) zależą wyłącznie od absorpcji badanego związku. Różnica jakiejkolwiek innej wartości w równaniu 8 dla próbki i odnośnika powoduje systematyczne błędy w pomiarach absorbancji. Zastosowania spektroskopii UV-VS. Spektroskopię UV-VS stosuje się często do badania przebiegu reakcji chemicznych i fotochemicznych. Ponadto przed wykonaniem badań metodą spektroskopii emisyjnej, zarówno stacjonarnej jak i rozdzielczej w czasie, konieczny jest najpierw pomiar widm absorpcji (WA) badanych związków czy też ich mieszanin, w odpowiednio dobranym rozpuszczalniku. Pomiar ten należy wykonać, przede wszystkim w celu wyboru odpowiednich długości fali promieniowania wzbudzającego dla mierzonego widma emisji. W 3
celu wyznaczenia wydajności kwantowej emisji (Φ E ) i zaniku fotochemicznego (Φ FOT ) badanych związków oraz wydajności kwantowej tworzenia fotoproduktów, konieczny jest także pomiar WA, a przynajmniej pomiar wartości absorbancji dla wybranych długości fali. W wyjątkowo uniwersalnej metodzie HPLC powszechnie stosowane są detektory UV-VS, które pozwalają na pomiar absorbancji przy wybranych długościach fali z zakresu ultrafioletu i części widzialnej, a nawet na pomiar całego widma absorpcji. Dzięki temu są one wykorzystywane do identyfikacji związków znajdujących się w badanej mieszaninie oraz do wyznaczenia ich stężenia. Dokładny pomiar absorbancji. W wymienionych wyżej zastosowaniach spektroskopii absorpcyjnej UV-VS, a także szeregu innych jej zastosowaniach, konieczny jest bardzo dokładny pomiar wartości A. Często są to małe absorbancje, A<0.1, a nawet A 10-2. lościowe pomiary widm absorbcji w szerokim zakresie stężeń, a więc i wartości A, (w tym w zakresie małych wartości A) są wykorzystywane także do badania tworzenia dimerów i wyższych merów, oraz kompleksów z rozpuszczalnikiem, czy też z odpowiednio dobranym związkiem (wygaszaczem, sensybilizatorem, surfaktantem, cyklodekstryną, itp.). Liczne są zastosowania analityczne spektroskopii UV-VS, w których mierzone są bardzo małe wartości A. Nierzadko przyczyną tego mogą być małe wartości molowego współczynnika absorpcji, konieczność użycia małych stężeń, (ze względu na łatwość tworzenia dimerów, a nawet oligomerów, np. dla porfiryn i barwników oraz ich pochodnych), słaba rozpuszczalność badanych związków, a także ich wysoki koszt. Wiarygodny i powtarzalny pomiar małych wartości A z błędem poniżej 10% (a nawet 5%) jest możliwy. Wymaga on jednak poznania rzeczywistych możliwości pomiarowych stosowanego spektrofotometru i jego kalibracji, a także wyboru właściwych parametrów pomiaru. Konieczne jest także dobre zrozumienie metodyki ilościowych pomiarów absorbancji, czynników które obok rzeczywistej absorbcji mogą istotnie wpływać na mierzoną wartość A (patrz równanie 8), jak również stosowania specjalnej procedury pomiarowej. 4
Cele ćwiczenia Celem ćwiczenia jest przeprowadzenie pomiarów, które pozwolą stwierdzić jakie czynniki oprócz absorpcji światła przez badany związek mają wpływ na mierzone WA i na wyznaczoną dla wybranych długości fali wartość absorbancji. Aby ten cel zrealizować konieczne będzie stwierdzenie jaki wpływ na WA i wartości A ma: -odbicie i rozpraszanie światła, -różnice między kuwetą stosowaną dla próbki i odnośnika, dotyczące absorpcji i odbicia światła przez kuwety i różnice ich grubości, -absorbcja światła przez rozpuszczalnik, -parametry stosowanego spektrofotometru, a szczególnie zmiana jego czułośći w trakcie pomiarów Drugim celem ćwiczenia jest bardzo dokładne wyznaczenie wartości A dla wybranych długości fali, a na tej podstawie stwierdzenie jak małe wartości absorbancji można wiarygodnie wyznaczyć stosując spektrofotometr V-550. Aby zrealizować powyższe cele zastosowana będzie specjalna procedura pomiarów absorbancji i przeprowadzenie prostych obliczeń. Część eksperymentalna Pomiary widm absorpcji będą wykonane na spektrofotometrze V-550 (JASCO) lub Cary 300 (Varian). Schemat optyczny spektrofotometru V-550 podany jest na Rys. 1. stosunek / 0 dla danej, zadanej długości fali. Rys.1 Schemat dwuwiązkowego spektrofotometru na przykładzie V-550 (Jasco). 5
Badane będą roztwory rodaminy B w glikolu etylenowym lub benzofenonu w etanolu o wartości absorbancji w maximum długofalowego pasma absorpcji w zakresie A=0.1-1.5. Stosowane będą kuwety kwarcowe o drodze optycznej l/1cm i l/0.2cm. Wartości A dla wszystkich zmierzonych WA będą wyznaczane dla następujących długości fali : -w maksimach pasm absorpcji, -dla kilku długości fali, dla których wartość A wyraźnie się różni, (ustalonych z prowadzącym ćwiczenie), w tym dla długości fali, dla której A~10-2, -w zakresie długofalowym, w którym nie absorbuje badany związek (2-3 długości fali). Dobór warunków pomiaru WA, (ustalonych z prowadzącym ćwiczenie), należy określić po wykonaniu WA badanego związku (pkt. 3) w warunkach standardowych, (dla wykonania tego ćwiczenia), tj. szczelina 1,2-1nm, krok pomiarowy 1nm i czasu pomiaru 0.25s, fast wartości A dla jednej długości fali. W wyborze optymalnych parametrów pomiarowych dla V-550 (Jasco) należy kierować się danymi zawartymi w Tabeli na stronie 5 Metodyki pomiarów WA. Ponadto należy brać pod uwagę kształt WA, wyznaczone wartości A oraz przebieg lini zerowej w zakresie długofalowym gdzie nie absorbuje badany związek. Na tej podstawie należy określić: -zakres spektralny, w którym mierzone będą WA, -szerokość szczeliny w spektrofotometrze, -krok pomiaru, tj. odległość pomiędzy kolejnymi wartościami, dla których mierzone będą wartości A, -czas pomiaru wartości A dla jednej długości fali. Wykonanie ćwiczenia W ramach ćwiczenia należy zmierzyć kolejno: 1. linię bazową spektrofotometru, 2. linię zerową spektrofotometru, 3. WA roztworu badanego związku względem pustej kuwety (która będzie użyta dla odnośnika-rozpuszczalnika), w standardowych warunkach. Przed wykonaniem dalszych pomiarów (4-15) ustalić z prowadzącym ćwiczenie warunki pomiarów (4-15), 4. WA pustej kuwety, która będzie użyta dla próbki, względem powietrza, 6
5. WA pustej kuwety próbki względem pustej kuwety odnośnika, 6. WA rozpuszczalnika w kuwecie próbki wg. pustej kuwety odnośnika, 7. powtórzyć pomiar 2, 8. WA rozpuszczalnika w kuwecie próbki względem rozpuszczalnika w kuwecie odnośnika, 9. powtórzyć pomiar 8, 10. powtórzyć pomiar 2, 11. powtórzyć pomiar 8 12. WA badanego związku względem. rozpuszczalnika, 13. powtórzyć pomiar 12, 14. powtórzyć pomiar 2, 15. powtórzyć pomiar 12. Opracowanie wyników. Biorąc pod uwagę cele ćwiczenia dla ustalonych długości fali (patrz wyżej), należy wyznaczyć wartości A i/lub A, które określają: a. wkład absorpcji i odbicia światła przez kuwetę stosowaną dla próbki (pkt 4), b. różnicę absorpcji i odbicia światła między kuwetą stosowaną dla próbki i dla odnośnika (pkt. 5), c. absorpcję światła pochodąca od rozpuszczalnika (pkt. 6), d. zmianę czułości spektrofotometru porównując wartości A (pkt 2 i pkt. 7) W celu bardzo dokładnego wyznaczenia wartości A i A dla pkt. 1-3 należy uwzględnić wyniki punktu d, e. wyznaczyć wartość A dla rozpuszczalnika A(rozp) z pomiarów 8,9 i 11 uwzględniając ewentualne zmiany czułości spektrofotometru (pkt.7 i 10), a korzystając z tak obliczonych wartości A obliczyć średnią wartość A(rozp), f. wyznaczyć wartość A dla próbki z pomiarów 12,13 i 15, uwzględniając ewentualne zmiany czułości spektrofotometru (pkt.10 i 14), a korzystając z tak obliczonych wartości A obliczyć średnią wartość A(BZ), g. wyznaczyć rzeczywiste wartości A dla badanego związku z relacji A = A(BZ)- A(rozp), 7
h. wyznaczyć zmianę czułości spektrofotometru w krótszych okresach czasu porównując wartości A wyznaczone w (pkt. 2 i 7, pkt. 7 i 10, pkt. 10 i 14) oraz w dłuższym okresie czasu (pkt. 2 i 14). Literatura: [1]-Materiały dotyczące spektroskopii absorpcyjnej dostępne w internecie na stronie http://www.staff.amu.edu.pl/~iwonam/student.htm, [2]-Zbigniew Kęcki, Podstawy spektroskopii molekularnej, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 1998, [3]-Materiały do ćwiczeń z fizyki chemicznej, opracowanie zbiorowe pod redakcją Bronisława Marciniaka, [4]-Walenty Szczepaniak, Metody instrumentalne w analizie chemicznej, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 1997, [5]-H. Haken, H.C. Wolf, Fizyka molekularna z elementami chemii kwantowej, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 1998, [6]-P. W. Atkins, Podstawy chemii fizycznej, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 1999, 8