Diagnostyka molekularna odgrywa ważną rolę w hematologii, głównie w hematoonkologii (acz nie tylko!). 1. Podstawowe zastosowania: -identyfikacja mutacji i polimorfizmów wrodzonych hemoglobinopatie skłonności pozakrzepowe cz. V Leiden, polimorfizm genu protrombiny i MTHFR hemofilie defekty metaboliczne erytrocytów niedobory immunologiczne inne- co roku odkrywane i opisywane na świecie -identyfikacja zmian nabytych w chorobach nowotworowych: detekcja genów fuzyjnych (m.in. BCR-ABL, PML-RARA) monitoring odpowiedzi na leczenie celowane (BCR-ABL, FLT3-ITD, PML-RARA) detekcja choroby resztkowej (rearanżacje genów TCR i IGH, geny fuzyjne, czasami mutacje) identyfikacja mutacji w diagnostyce różnicowej i prognozowaniu przebiegu choroby (JAK2 V617F, FLT3-ITD, NPM1, CEBPA, c-kit, tp53) charakteryzowanie mutacji indukujących oporność na leczenie celowane, np. mutacje domeny kinazowej BCR-ABL, mutacja FLT3 D835 - typowanie tkankowe i badaniam okołoprzeszczepowe: typowanie antygenów HLA monitoring chimeryzmu hematopoetycznego badania wirusologiczne: CMV, EBV, wirusy hepatotropowe 2. Najczęściej stosowane metody: PCR Nested PCR Real-Time PCR (RQ-PCR) Allelospecyficzny PCR (wiele odmian) Sekwencjonowanie genów RFLP dhplc HRM
3. Czułość stosowanych metod molekularnych względem innych procedur laboratoryjnych: Rozmaz ręczny < Wykładniki biochemiczne < cytogenetyka klasyczna < FISH < pojednycza runda PCR < ELISA/EIA < RIA < Cytometria przepływowa < Real-Time PCR < Nested PCR Obecnie trwają prace nad wykorzystaniem w diagnostyce reakcji o jeszcze wyższej czułości, łaczących technikę nested z RQ. (QNRT-PCR) Problem stanowi jedynie precyzyjna ocena ilościowa. W przeciwieństwie do tego, co się mówi o badaniach molekularnych, nie zawsze są one najczulszym markerem wznowy choroby. Jeżeli możliwy jest monitoring obecnośc fuzji genowych, to nie ma czulszego narzędzia (nawet 1 cząsteczka nieprawidłowa na 10^6 cząsteczek prawidłowych!). Jeżeli jednak w klonie nowotworowym obecne są jedynie niewielkie mutacje, trudno jest je wyłowić z całej puli DNA/RNA tkanki. Wówczas monitoring molekularny choroby resztkowej nie jest oszałamiająco czuły i należy akcentować wyższość badania cytometrycznego, o ile znane są specyficzne konstelacje antygenów na powierzchni patologicznych komórek. Czułość wykrywania małych mutacji (punktowe oraz insercje/delecje) różnymi metodami przedstawiono poniżej. % obciążenia mutacją minimalny oznacza odsetek matryc DNA, w których może być zauważona zmiana. Zatem jeżeli zmiana jest homozygotyczna to % matryc = % komórek, jeśli heterozygotyczna, to %matryc = 1/2*% komórek. Dla przykładu: mutacja heterozygotyczna w JAK2 na wykryta na poziomie czułości 2% oznacza, że ok. 4% komórek posiada defekt. Sekwencjonowanie sangerowskie (>20% obciążenia mutacją) RFLP (>10% obciążenia mutacją) Allelospecyficzny PCR* (>5% obciążenia mutacją) HRM i dhplc* (>2% obciążenia mutacją) ARMS-PCR* (>2% obciążenia mutacją) Allelospecyficzny Real-Time PCR* (>0,1% obciążenia mutacją) Techniki głębokiego sekwencjonowania** (>0,01% obciążenia mutacją) *- w zależności od matrycy, charakteru mutacji, metodyki czułość tych metod jest bardzo różna, zawsze jednak kształtuje się na poziomie zbliżonym do podanego powyżej. **- póki co technii niedostępne rutynowej diagnostyce onkologicznej, ale przy ich obecnym rozwoju za kilka lub kilkanaście lat znajdą tu zastosowanie. 4. Kontrola jakości badań molekularnych Dz.U. z 2010 nr 107 poz. 679 - USTAWA o wyrobach medycznych z dnia 20 maja 2010r. nakłada na całą diagnostykę medyczna obowiązek korzystania wyłącznie ze zwalidowanych testów. W przypadku testów wykonywanych samodzielnie na bazie kupionych odczynników, obowiązuje wymóg posiadania przez te reagenty certyfikatu CE. W przypadku gotowych, komercyjnych testów diagnostycznych ustawa wprowadza wymóg posiadania przez test certyfikatu CE IVD.
Art. 5, p.7. Wyrób do diagnostyki in vitro wytworzony przez medyczne laboratorium diagnostyczne lub inny podmiot, który bez wprowadzania do obrotu używa go do świadczenia publicznie dostępnych usług z zakresu diagnostyki medycznej, podlega ustawie i musi być oznakowany znakiem CE po przeprowadzeniu odpowiedniej procedury oceny zgodności. Art. 20. 1. Wyroby medyczne klasyfikuje się do klasy I, IIa, IIb albo III, uwzględniając ryzyko związane ze stosowaniem wyrobów. Art. 21. Wyroby medyczne do diagnostyki in vitro, które ze względu na poważne konsekwencje błędnego wyniku badania z ich użyciem wymagają szczególnych procedur oceny zgodności, są kwalifikowane: 1) do wykazu A albo 2) do wykazu B. Zapisy ustawy regulują sposób oznakowania wyrobów, certyfikacji, a także wymieniają w załącznikach oznaczenia z wykazu A i B, wobeck których muszą zostać spełnione dodatkowe kryteria kontroli jakości, które są wyszczególnione w dyrektywie unijnej 98/79/EC. W aneksie A znajdują się badania serologiczne grup krwi: systemu ABO, Rh (C, c, D, E, e) Kell, oraz badania wirusologiczne HIV, HTLV oraz badania wirusów hepatotropowych. W aneksie B figurują grupy krwi Duffy i Kidd, przeciwciała przeciwkrwinkowe, typowanie tkankowe HLA (serologia), detekcja toksoplazmozy i różyczki, wirusa cytomegalii i chlamydiozy (mikrobiologia, wirusologia), testy na fenyloketonurię, oznaczenie trisomii 21 (genetyczne zaburzenia wrodzone), oznaczenia markeru nowotworowego PSA oraz glukozy we krwi. Należy pamiętać, że wykonując te oznaczenia musimy bezwględnie stosować: - sprzęt wyłacznie certyfikowany CE IVD -wszystkie odczynniki CE IVD oraz musimy pracowaćw oparciu o materiał diagnostyczny, dla którego była przyznana certyfikacja. Tzn. Jeśłi test jest do badań krwi- wyłacznie badamy nim krew, a nie np.pmr. W kontekście badań molekularnych, zgodnie z zapisami ustawy można pracować tylko na odczynnikach ze znakiem CE, chociaż istnieje sporo wątpliwości: -czy startery do PCR, nie mające CE (bo niby jak miałyby mieć???) mogą być legalnie stosowane? -czy własnoręczne wykonywanie mastermixów z odczynników posiadających CE jest dozwolone?
Póki co KIDL nie odpowiedział na żadne z tych pytań, na dzień dzisiejszy ustawa interpretowana jest dość luźno przez laboratoria cytogenetyczne i molekularne ponieważnie ma żadnych obowiązujących interpretacji prawnych dotyczących tych kwestii. Inne kryteria kontroli jakości: Laboratoria molekularne w głównej mierze operują na poziomie bezpieczeństwa biologicznego BSL2 i projektowanie pomieszczeń powinno opierać się o klasyczne laboratoryjne normy bezpieczeństwa. Ryc.Przykład labu BSL2, grafika na licencji GNU, pochodzi zmateriałów CUH2A, Princeton, NJ, USA Poziom BSL3 powinny spełnić laboratoria, w których personel pracuje z materiałem genetycznym wirusów hepatotropowych, HIV, HTLV, CMV, EBV i drobnoustrojami alarmowymi.
Ryc.Przykład labu BSL3 Grafika na licencji GNU, pochodzi zmateriałów CUH2A, Princeton, NJ, USA Poziom BSL4 muszą spełnić jedynie laboratoria pracujące z patogenami o najwyższym zagrożeniu epidemiologicznym, tj. ospą prawdziwą, ebolą, marburgiem, oraz nieznanymi i niescharakteryzowanymi czynnikami grożącymi pandemią, np. H5N1 grypy, lub szczep EHEC z 2011r. Ryc: Praca w BSL4 przypomina trochę pracę w kosmosie ;/ Laminarny obieg powietrza, śluzy i inne atrakcje...
Wyposażenie laboratorium molekularnego poziomu BSL2: Lampy UV Komory z laminarnym przepływem powietrza i lampami UV Oddzielne lodówki izamrażarki dla materiału biologicznego i odczynników Infrastruktura do archiwizowania prób w -80 stopniach lub w ciakłym azocie Najważniejszeelementy kontroli jakości materiału i badań: Najważniejszy etap przedanalityczny: izolacja DNA i RNA. Materiał ZAWSZE musi być poddany analizie jakościowej i ilościowej a priori każdej analizy. Bez tego nie wolno wykonywać żadnych analiz, chyba że etap przygotowania próbki zakłada przed izolacją dodanie kontroli wewnętrznej (niektóre kity wirusologiczne) Metody oceny DNA i RNA: spektrofotometryczna ocena A260, A230 i A280, obliczenie ilości materiału z absorbancji. Ponadto polecane jest wykonywanie elktroforezy RNA w celu oceny integralności prążków rrna Do PCR zawsze dodajmy kontrole- co najmniej kontrolę ujemną i dodatnią, najlepiej także słabododatnią i bez matrycy (tzw. NTC, no template control). Zawsze wybierajmy metodyki multiplex,w której oprócz badanego genu amplifikowany jest też jakiś gen referencyjny, który musi być obecny o ile doszło do amplifikacji. Wynik zawsze opatrzajmy komentarze o czułości metody, jeżeli metoda tego wymaga także o rozdzielczości lub o wykrywanych defektach. Odwołujmy się do publikacji źródłowych Dla każdej metody powprowadzeniu określajmy od razu czułość metody (nie sugerujemy się ulotką producenta!) i twórzmy SOPy- przydadzą się nowym pracownikom i przy wprawadzaniu systemu jakości Pilnujmy kalibracji pipet i ważności przeglądów sprzętu. Jeśli pipety wydają nam sie podejrzane, przeprowadźmy przy pomocy czułej wagi samodzielną kontrolę kalibracji dla maksymalnej i minimalnej objętości. Żeby zapobiegać kontaminacji: korzystajmy z zestawów z UNG i dutp. Jeśli to nie jest osiągalne, zaprzyjaźnijmy się z naszą Uvką i chlorowymi środkami dezynfekcyjnymi. Włączajmy UV najczęściej jak to racjonalnie możliwe (np. raz w tygodniu), a po każdej rekacji PCR dezynfekujmy statywy i blaty związkami chloru.