GOTOWE PODŁOŻA HODOWLANE NA PŁYTKACH INSTRUKCJE STOSOWANIA PA-254058.06 wer.: April 2013 BD Haemophilus Test Medium Agar (HTM) PRZEZNACZENIE Podłoże BD Haemophilus Test Medium Agar (HTM) służy do dyfuzyjnych krążkowych badań wrażliwości izolatów klinicznych gatunków Haemophilus, zgodnie z zatwierdzoną normą M2, opublikowaną przez Instytut Norm Klinicznych i Laboratoryjnych (CLSI). 1 ZASADY I OBJAŚNIENIE PROCEDURY Metoda mikrobiologiczna. Poprzednim podłożem zalecanym do badań Haemophilus influenzae był Mueller Hinton Agar wzbogacony 1% hemoglobiną i 1% dodatkiem wzbogacającym IsoVitaleX (Mueller Hinton Chocolate Agar). 2 Szczegółowe badania przeprowadzone przez Jorgensena i jego współpracowników doprowadziły do opracowania podłoża Haemophilus Test Medium Agar (HTM). 3,4 Składa się ono z podłoża Mueller Hinton agar z dodatkiem czynnika X (hemina lub hematyna), czynnika V (NAD, dinukleotydu nikotynoamidoadeninowego) i wyciągu drożdżowego. Istotną zaletą podłoża HTM Agar w porównaniu z Mueller Hinton Chocolate Agar jest przejrzystość optyczna, umożliwiająca wykonywanie pomiaru średnicy stref na dolnej powierzchni płytki, zgodnie ze standardem procedury testowej dla drobnoustrojów o niskich wymaganiach odżywczych na podłożu Mueller Hinton Agar. Ponadto HTM Agar zawiera niski poziom tymidyny, dzięki czemu lepiej nadaje się do badań trimetoprimu/sulfametoksazolu. Kryteria interpretacji badań wrażliwości bakterii na antybiotyki przedstawiono w dokumencie CLSI M100 (M2), dołączonym do dokumentu CLSI M2. 1 Dokument ten zawiera dalsze informacje na ten temat. BD Haemophilus Test Medium Agar składa się z podłoża Mueller Hinton Agar z dodatkiem czynnika X (heminy lub hematyny), czynnika V (dinukleotydu nikotynoamidoadeninowego) oraz wyciągu z drożdży. ODCZYNNIKI BD Haemophilus Test Medium Agar (HTM) Skład* w przeliczeniu na jeden litr wody oczyszczonej Wyciąg wołowy 2,0 g Kwaśny hydrolizat kazeiny 17,5 Skrobia 1,5 Agar 17,0 Wyciąg drożdżowy 5,0 Hematyna 0,015 Dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy (NAD) 0,015 ph 7,3 ± 0,1 *Skorygowany i (lub) uzupełniony zgodnie z wymaganiami mającymi na celu spełnienie kryteriów wydajności. ŚRODKI OSTROŻNOŚCI. Wyłącznie do zastosowań profesjonalnych. Nie należy używać płytek, jeżeli są na nich widoczne oznaki skażenia mikrobiologicznego, odbarwienia, wyschnięcia, pęknięcia lub inne zjawiska wskazujące na pogorszenie jakości. Nadmierne obkurczenie się opisywanego podłoża na skutek wysychania może prowadzić do uzyskania fałszywych wyników wskazujących na występowanie wrażliwości. Procedury aseptycznej techniki pracy z produktem, zagrożenia biologiczne oraz usuwanie zużytego produktu opisano w dokumencie OGÓLNE INSTRUKCJE DOTYCZĄCE STOSOWANIA. PA-254058.06-1 -
PRZECHOWYWANIE I DOPUSZCZALNY OKRES PRZECHOWYWANIA Po otrzymaniu, płytki należy przechowywać w ciemnym miejscu w temperaturze od 2 do 8 C, w ich oryginalnym opakowaniu izolującym do chwili użycia. Unikać zamrażania i przegrzewania. Posiewu na płytki można dokonywać aż do daty ważności (patrz etykieta na opakowaniu) i inkubować w zalecanych czasach inkubacji. Płytek z otwartych stosów zawierających po 10 płytek można używać przez okres jednego tygodnia, przechowując w czystym miejscu w temperaturze od 2 do 8 C. KONTROLA JAKOŚCI PRZEZ UŻYTKOWNIKA Procedury kontroli jakości przez użytkownika przedstawiono w standardach CLSI 1 bądź w odpowiednich standardach krajowych. W zasadzie należy stosować procedury opisane w części Procedura testowa, używając szczepów referencyjnych wymienionych w części Materiały niedostarczane. Wykorzystywane płytki z podłożem BD Haemophilus Test Medium Agar (HTM) oraz krążki nasycone antybiotykami należy testować co najmniej dwa razy w tygodniu w ramach kontroli jakości. Wygląd podłoża bez posiewu: zabarwienie jasnobursztynowe. PROCEDURA Dostarczane materiały Podłoże BD Haemophilus Test Medium Agar (płytki Stacker o śr. 90 mm). Sprawdzane pod kątem obecności mikroorganizmów. Materiały niedostarczane 1. Pożywka płynna w probówce, taka jak BD Trypticase Soy Broth (pożywka z ekstraktem sojowo-kazeinowym) lub Mueller Hinton II Broth (ze skorygowaną zawartością kationów) do przygotowania standardowego inokulum, a także sterylna pożywka lub roztwór fizjologiczny do rozcieńczenia inokulum. 2. Standard porównawczy z siarczanem (VI) baru (0,5 ml BaCl 2 o stężeniu 0,048 M [BaCl 2 2H 2 O o stężeniu 1,175% (stężenie wagowo-objętościowe)] w 99,5 ml H 2 SO 4 o stężeniu 0,18 M [0,36 N] [1% stężenie objętościowo-objętościowe]). 3. Urządzenie fotometryczne do korygowania zmętnienia zawiesiny inokulum, tak aby było ono równe standardowi 0,5 McFarland. 4. Alternatywnie do wyżej wymienionych materiałów (1-3) można użyć BD Prompt Inoculation System (urządzenie wolumetryczne do przygotowywania inokulum). 5,6 5. Hodowle kontrolne Haemophilus influenzae ATCC 49247, ATCC 49766 i ATCC 10211. 6. Krążki papierowe nasycone określoną ilością antybiotyków, takie jak krążki do badania wrażliwości BD Sensi-Disc. 7. Aplikator do nakładania krążków, takie jak 6-pozycyjny aplikator Sensi-Disc. 8. Linijka lub inne urządzenie do pomiaru średnicy stref w milimetrach. 9. Inkubator wytwarzający atmosferę zawierającą 5% CO 2 bądź inne urządzenie, które wytwarza podobną atmosferę tlenową wzbogaconą w CO 2. 10. Odczynnik do wykonywania szybkich testów z ß-laktamazą, np. krążki BD Cefinase. 11. Pomocnicze pożywki hodowlane, odczynniki i wyposażenie laboratoryjne zgodnie z wymaganiami. Typy próbek Opisywany produkt jest używany do badań wrażliwości czystych hodowli Haemophilus, które wyizolowano z próbek klinicznych (zobacz także CHARAKTERYSTYKA WYDAJNOŚCI I OGRANICZENIA PROCEDURY). Procedura testowa 1. Przed badaniem wrażliwości należy wykonać barwienie metodą Grama w celu potwierdzenia czystości hodowli i wstępnej identyfikacji Haemophilus. PA-254058.06-2 -
2. Materiał do posiewu należy pobrać z kilku wyraźnie oddzielonych kolonii na inkubowanej przez jedną dobę (najlepiej 20 24 godz.) płytki z podłożem Chocolate Agar. 3. Do szybkiego wykrycia szczepów opornych na penicylinę, ampicylinę i amoksycylinę należy użyć szybkiego testu z ß-laktamazą. 4. Wykonać zawiesinę badanych drobnoustrojów w pożywce płynnej, takiej jak Mueller Hinton Broth, Mueller Hinton II Broth lub roztworze fizjologicznym o stężeniu 0,9%. Zmętnienie tej zawiesiny należy skorygować za pomocą urządzenia fotometrycznego tak, aby odpowiadało ono standardowi 0,5 McFarland. Zawiesina taka będzie zawierała około 1 4 x 10 8 CFU/ml. Podczas przygotowywania tej zawiesiny należy zachować ostrożność, gdyż zbyt duże stężenie inokulum może w przypadku niektórych antybiotyków ß- laktamowych prowadzić do uzyskania fałszywych wyników wskazujących na oporność, zwłaszcza podczas badania szczepów H. influenzae wytwarzających beta-laktamazę. 1 5. Do celów rutynowych badań, w tym badań H. influenzae, za dopuszczalne uznaje się stosowanie alternatywnych metod przygotowywania inokulum za pomocą urządzeń umożliwiających bezpośrednią standaryzację inokulum bez korygowania zmętnienia, takich jak BD Prompt Inoculation System. 5,6 6. W ciągu 15 min od skorygowania zmętnienia inokulum należy zanurzyć sterylną wymazówkę w odpowiednio rozcieńczonym inokulum i kilkakrotnie ją obrócić, mocno przyciskając do górnej wewnętrznej ścianki probówki, aby odsączyć nadmiar płynu. 7. Wykonać posiew, trzykrotnie rozprowadzając materiał po całej powierzchni podłoża BD Haemophilus Test Medium Agar na płytce, obracając płytkę za każdym razem o 60, aby uzyskać równomierny posiew. 8. Płytkę z uchyloną pokrywką pozostawić w temperaturze pokojowej na 3 5 min., lecz nie dłużej niż 15 min, w celu zaabsorbowania wilgoci na powierzchni podłoża przed nałożeniem krążków nasyconych antybiotykami. 9. Nałożyć krążki nasycone antybiotykami za pomocą odpowiedniego aplikatora, zachowując zasady aseptyki. Podczas badań bakterii z rodzaju Haemophilus większość antybiotyków powoduje powstanie większych stref zahamowania wzrostu niż w przypadku innych drobnoustrojów. W związku z tym na pojedynczej płytce o średnicy 100 mm nie należy umieszczać więcej niż cztery krążki nasycone antybiotykami, w tym nie więcej niż sześć spośród następujących krążków: cefalosporyny trzeciej generacji (np. cefotaksym, ceftazidim, ceftriakson, ceftizoksym), aztreonam, imipenem lub ciprofloksacyna. Po umieszczeniu krążków na agarze należy je lekko docisnąć za pomocą sterylnej igły lub pincety, aby dokładnie przylegały one do powierzchni podłoża. 10. W ciągu 15 minut od nałożenia krążków płytki należy odwrócić i inkubować przez 16 18 godz., w temperaturze 35 C, w atmosferze tlenowej wzbogaconej 5% dwutlenkiem węgla. 11. Należy też wykonać posiew szczepu H. influenzae ATCC 10211 na płytce z podłożem BD Haemophilus Test Medium Agar i inkubować ją razem z płytkami, na których badana jest wrażliwość bakterii na antybiotyki, aby określić, czy na podłożu występuje zadowalający wzrost. Wyniki 1. Płytki należy zbadać po 16 18 godzinach inkubacji. Powinien być widoczny zlewny wzrost. Wystąpienie samych izolowanych kolonii oznacza, że inokulum było zbyt rozcieńczone. Należy wówczas powtórzyć test. 2. Zmierzyć średnicę stref całkowitego zahamowania wzrostu (ocenianą nieuzbrojonym okiem), włączając średnicę krążka, w zaokrągleniu do pełnych milimetrów, za pomocą cyrkla, linijki lub specjalnego szablonu. Urządzenie wykorzystywane do pomiaru należy przystawić do dna odwróconej płytki umieszczonej na czarnym, nieodbijającym tle i oświetlonej z góry. 3. Jako granicę należy przyjąć obszar nie wykazujący wyraźnie widocznych oznak wzrostu, które można dostrzec okiem nieuzbrojonym. Należy pominąć śladowy wzrost oraz małe kolonie, które można z trudem zauważyć w pobliżu granicy wyraźnej strefy zahamowania. W przypadku trimetoprimu i sulfonamidów śladowe ilości substancji antagonistycznych w podłożu mogą umożliwić śladowy wzrost; w związku z tym należy pominąć nieznaczny wzrost (do 20% wzrostu zlewnego) i zmierzyć najbardziej wyraźną granicę w celu określenia średnicy strefy. PA-254058.06-3 -
Obliczanie i interpretacja wyników Informacje na temat interpretacji wyników uzyskanych w badaniach szczepów Haemophilus izolowanych z próbek pochodzenia klinicznego przedstawiono w dokumencie CLSI M100-S10 (M2). 1 Możliwe są trzy wyniki: oporne, częściowo wrażliwe lub wrażliwe, w zależności od uzyskanej średnicy strefy. Drobnoustroje dające dodatni wynik testu na wytwarzanie beta-laktamazy należy uznać za oporne na ampicylinę, niezależnie od uzyskanej średnicy strefy. Należy jednak pamiętać o tym, że opisywane były szczepy H. influenzae oporne na ampicylinę, które nie wykazywały aktywności ß-laktamazy. 7 W związku z tym, jeśli średnica strefy wskazuje na wrażliwość na ampicylinę, izolowany szczep należy uznać za oporny na ten lek, nawet w przypadku ujemnego wyniku testu na ß- laktamazę. Hodowli kontrolnych należy używać przy każdym badaniu wrażliwości lub raz w tygodniu, jeśli możliwe jest udokumentowanie zadowalającej wydajności zgodnie ze standardem CLSI M2, który zawiera tabele (M100) prawidłowych wartości średnic stref. 1 Uwaga: Okresowo publikowane są informacyjne dodatki do dokumentu CLSI M2 bądź jego uaktualnione wersje, zawierające poprawione tabele dla krążków przeciwbakteryjnych oraz standardy interpretacji. Należy przestrzegać zaleceń podanych w najnowszych tabelach. Pełen standard i dodatki informacyjne można zamówić pod adresem Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, PA 19087-1898, USA. Telefon: ++1-610-688-1100. CHARAKTERYSTYKA WYNIKÓW I OGRANICZENIA DOTYCZĄCE PROCEDURY A. Badanie odtwarzalności 8 Oceniono trzy partie produkcyjne podłoża BD Haemophilus Test Medium Agar, stosując procedurę badania wrażliwości z krążkami nasączonymi antybiotykami (M2-A4) zalecaną wówczas przez NCCLS. 9 W badaniu użyto łącznie 12 antybiotyków (amoksycylina/klawulanian, ampicylina, ampicylina/sulbaktam, cefaklor, cefonicyd, ceftriakson, cefuroksym, chloramfenikol, ciprofloksacyna, rifampicyna, tetracyklina, trimetoprim/sulfametoksazol) oraz 14 szczepów H. influenzae. Siedem spośród 14 użytych w badaniu szczepów było szczepami ATCC (American Type Culture Collection), a pozostałe siedem było hodowlami zapasowymi, w tym sześć izolatów z próbek pochodzenia klinicznego oraz hodowla kontrolna o jakości przemysłowej. Średnice stref uzyskane w każdej z trzech partii podłoża zostały porównane z kryteriami interpretacji (Tabela 2A) w dokumencie M2-A4. 9 Tylko w sześciu przypadkach strefy uzyskane w jednej partii należały do innej kategorii interpretacyjnej, niż strefy uzyskane w pozostałych dwóch partiach. Wśród tych sześciu rozbieżności cztery dotyczyły tetracykliny, jedna cefakloru i jedna cefuroksymu. W przypadku tetracykliny wynik wskazywał na kategorię interpretacji oznaczającą wrażliwość lub częściową wrażliwość (mniejszy błąd). W przypadku cefakloru i cefuroksymu, zaobserwowana różnica 1 mm oznaczała bądź kategorię częściowej wrażliwości, bądź oporności, co także stanowi mniejszy błąd. W tym badaniu użyto pięciu szczepów H. influenzae wytwarzających beta-laktamazę. Dla każdego z tych szczepów średnice stref uzyskane w każdej partii HTM z ampicyliną należało zinterpretować jako oporność. Dwa z tych pięciu szczepów produkowały także acetylotransferazę chloramfenikolu (CAT). Strefy uzyskane w badaniu wrażliwości tych dwóch szczepów na chloramfenikol odpowiadały rzeczywistej oporności tego antybiotyku. 10,11 B. Porównanie z podłożem Mueller Hinton Chocolate Agar 8 Dla 213 szczepów H. influenzae wyizolowanych z próbek pochodzenia klinicznego wykonana została procedura NCCLS z krążkami na podłożach HTM Agar i Mueller Hinton Chocolate Agar. 9,12 Badane były następujące antybiotyki: ampicylina, ampicylina/sulbaktam, amoksycylina/klawulanian i chloramfenikol. Były to jedyne antybiotyki, dla których zostały zdefiniowane kryteria interpretacyjne średnicy stref dla podłoża Mueller Hinton Chocolate Agar. 13,14 Uzyskano następujące wyniki: PA-254058.06-4 -
Mueller Hinton Chocolate Agar Zgodność: 99,6% S = Wrażliwe I = Częściowo wrażliwe PA-254058.06-5 - BD Haemophilus Test Medium Agar S I R S 808 1 2 I 0 0 0 R 0 0 41 R = Oporne W przypadku ampicyliny wystąpiły dwa duże błędy i jeden mały błąd. W obu dużych błędach wynik uzyskany na podłożu BD Haemophilus Test Medium Agar wskazywał na występowanie oporności, podczas gdy na podłożu Mueller Hinton Chocolate Agar wynik wskazywał na wrażliwość bakterii na antybiotyk. Oba te szczepy dawały dodatni wynik badania w kierunku beta-laktamazy. W związku z tym prawidłowe były wyniki wskazujące na występowanie oporności. Jeden mały błąd dotyczył szczepu, dla którego wynik uzyskany na podłożu HTM Agar wskazywał na częściową wrażliwość, a na podłożu Mueller Hinton Chocolate Agar na wrażliwość. C. Ograniczenia procedury W przypadku pewnych połączeń drobnoustrój-antybiotyk strefa zahamowania może nie mieć wyraźnej granicy, co może prowadzić do nieprawidłowych interpretacji. Niewłaściwe stężenie inokulum może prowadzić do uzyskania nieprawidłowych wyników. Jeśli stężenie inokulum jest zbyt duże, strefy zahamowania mogą być zbyt małe, a jeśli stężenie inokulum jest zbyt małe, strefy mogą być za duże i trudne do zmierzenia. Niewłaściwe przechowywanie krążków z antybiotykami może spowodować utratę ich mocy i fałszywe wyniki wskazujące na występowanie oporności. Wrażliwość drobnoustroju in vitro na określony antybiotyk nie zawsze oznacza, że lek ten będzie skuteczny in vivo. Wskazówki dotyczące interpretacji wyników przedstawiono w odpowiednich publikacjach. 2,15 PIŚMIENNICTWO 1. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, formerly NCCLS). Approved standard: M2. Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests. CLSI, Wayne, PA, USA.Search for latest version at www.clsi.org 2. Thornsberry, C., T.L. Gavan, E.H. Gerlach. 1977. Cumitech 6, New developments in antimicrobial agent susceptibility testing. Coordinating ed., J.C. Sherris. American Society for Microbiology, Washington, D.C 3. Jorgensen, J.H., J.S. Redding, L.A. Maher, and A.W. Howell. 1987. Improved medium for antimicrobial susceptibility testing of Haemophilus influenzae. J. Clin. Microbiol. 25:2105-2113. 4. Jorgensen, J.H., A.W. Howell, and L.A. Maher. 1990. Antimicrobial susceptibility testing of less commonly isolated Haemophilus species using Haemophilus test medium. J. Clin. Microbiol. 28:985-988. 5. Baker, C.N., C. Thornsberry, and R.W. Hawkinson. 1983. Inoculum standardization in antimicrobial susceptibility testing: evaluation of overnight agar cultures and the rapid inoculum standardization system. J. Clin. Microbiol. 17:450-457. 6. Marsik, F., G. Evans, J. Fowler, and L. Thompson. 1989. Comparison of the BBL Prompt system, Abbott A-Just, and visual method for the preparation of Haemophilus influenzae inoculum for the Bauer-Kirby procedure, abstr. C-67, p. 404. Abstr. 89th Annu. Meet. Am. Soc. Microbiol. 1989. 7. Doern, G.V., J.H. Jorgensen, C. Thornsberry, D.A. Preston, T.A. Tubert, J.S. Redding, and L.A. Maher. 1988. A national collaborative study of the prevalence of antimicrobial resistance among clinical isolates of Haemophilus influenzae. Antimicrob. Agents Chemother. 32:180-185. 8. Data on file. BD Diagnostic Systems, Sparks, MD, USA. 9. National Committee for Clinical Laboratory Standards. 1990. Approved standard: M2-A4. Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests, 4th ed. National Committee for Clinical Laboratory Standards, Villanova, Pa.
10. Azemun, P., T. Stull, M. Roberts, and A.L. Smith. 1981. Rapid detection of chloramphenicol resistance in Haemophilus influenzae. Antimicrob. Agents Chemother. 20:168-170. 11. Doern, G.V., G.S. Daum, and T.A. Tubert. 1987. In vitro chloramphenicol susceptibility testing of Haemophilus influenzae: disk diffusion procedures and assays for chloramphenicol acetyltransferase. J. Clin. Microbiol. 25:1453-1455. 12. National Committee for Clinical Laboratory Standards. 1984. Approved standard: M2-A3. Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests, 3rd ed. National Committee for Clinical Laboratory Standards, Villanova, Pa. 13. National Committee for Clinical Laboratory Standards. 1987. Second Informational Supplement: M100-S2. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. National Committee for Clinical Laboratory Standards, Villanova, Pa. 14. Doern, G.V. and R.N. Jones. 1988. Antimicrobial susceptibility testing of Haemophilus influenzae, Branhamella catarrhalis, and Neisseria gonorrhoeae. Antimicrob. Agents Chemother. 32:1747-1753. 15. Woods, G.L., and J.A. Washington. 1995. Antibacterial susceptibility tests: dilution and disk diffusion methods, p. 1327-1341. In P.R. Murray, E.J. Baron, M.A. Pfaller, F.C. Tenover, and R.H. Yolken (ed.), Manual of clinical microbiology, 6th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. USA. PAKOWANIE / DOSTĘPNOŚĆ BD Haemophilus Test Medium Nr katalogowy 254058 Gotowe podłoża na płytkach hodowlanych, cpu 20 DODATKOWE INFORMACJE W celu uzyskania dodatkowych informacji należy się skontaktować z lokalnym przedstawicielem firmy BD. Becton Dickinson GmbH Tullastrasse 8 12 D-69126 Heidelberg/Germany Phone: +49-62 21-30 50 Fax: +49-62 21-30 52 16 Reception_Germany@europe.bd.com http://www.bd.com http://www.bd.com/europe/regulatory/ Prompt is a trademark of 3M ATCC is a trademark of the American Type Culture Collection BD, BD Logo and all other trademarks are the property of Becton, Dickinson and Company. 2013 BD PA-254058.06-6 -