Jak włączyć diagnostykę molekularną do praktyki klinicznej na przykładzie Świętokrzyskiego Centrum Onkologii Artur Kowalik Zakład Diagnostyki Molekularnej Świętokrzyskie Centrum Onkologii w Kielcach
http://www.nccn.org/ National Comprehensive Cancer Institutes w USA
Świętokrzyskie Centrum Onkologii Prof. Tadeusz Koszarowski (1915-2002) Nestor Polskiej Onkologii Twórca koncepcji polskiej sieci wielospecjalistycznych centrów onkologii pacjent leczony kompleksowo w swoim sąsiedztwie Prof. Stanisław Góźdź Prof. Stanisław Góźdź uczeń Profesora Tadeusza Koszarowskiego twórca oraz Dyrektor Świętokrzyskiego Centrum Onkologii Kompleksowa opieka nad pacjentem
Świętokrzyskie Centrum Onkologii Chemioterapia Radioterapia Zakład Diagnostyki Molekularnej Medycyna Nuklearna PET Patologia Biobank Chirurgia
Świętokrzyskie Centrum Onkologii wielospecjalistyczny szpital onkologiczny 30 Poradni (200 000 konsultacji/rok) 12 Klinik (22 000 hospitalizacji/rok) 10 Zakładów Diagnostycznych: Jeden z nich to Zakład Diagnostyki Molekularnej Świętokrzyski Rejestr Nowotworów prowadzony od 1987 roku daje podstawy do dalszego rozwoju ŚCO Dane z rejestru publikowane są od 1995 roku przez International Agency for Research on Cancer (IARC)- WHO
Medycyna Personalizowana w Świętokrzyskim Centrum Onkologii Klinicysta Terapia Celowana Finansowanie Patologia Diagnostyka Molekularna
Medycyna Personalizowana w Świętokrzyskim Centrum Onkologii rozumie zalety terapii celowanej chce zlecić test właściwych biomarkerów Klinicysta ma zaufanie do wykonywanych wysokiej jakości testów w racjonalnym czasie
Medycyna Personalizowana w Świętokrzyskim Centrum Onkologii dobra współpraca z klinicystami i biologiem moleklarnym wysokoprzepustowa (zautomatyzowana) Patologia ludzkie umiejętności
Medycyna Personalizowana w Świętokrzyskim Centrum Onkologii ludzkie umiejętności.dobra współpraca z klinicystami i patologiem Inwestycje w nowoczesne technologie: Jakość, Szybkość, Czułość Specyficzność, Oszczędności Diagnostyka Molekularna
Zakład Diagnostyki Molekularnej Świętokrzyskiego Centrum Onkologii MEDYCYNA PERSONALIZOWANA Inwestycja w nowoczesne technologie dla ludzi, którzy wiedzą jak ich użyć! Predyspozycje do rozwoju choroby nowotworowej. BRCA1/2, CHEK2, CDKN2A. Stratyfikacja pacjentów do terapii celowanych RJG - KRAS, NRAS Rak Płuca - EGFR Czerniak - BRAF GIST- KIT i PDGFRA Monitorowanie skuteczności leczenia TKI w CML: SPRZĘT PGM Ion Torrent 4-capillary 3130 Genetic Analyzer ABI QX100 Droplet Digital PCR system RotorGene Real-Time PCR machine PCR machines
Przykłady wykrytych mutacji w raku płuca, jelita grubego, czerniaku SEKWENCJONOWANIE ekson 21 p.v601e (c.1801a>g) p.l858r (T2573G) p.v601e (c.1801a>g) Ekson 19 KRAS exon 2 c.35g>a, p.g12d p.l747_t751dellreat
Medycyna Personalizowana w Świętokrzyskim Centrum Onkologii Inwestycja w nowoczesne technologie Next generation Sequencing siła analizy wielkoskalowej NGS umożliwia analizę całych genów, genomów szybko i dokładnie. Wiele próbek od wielu pacjentów zsekwencjonowanych w tym samym czasie. Diagnostyka Molekuarna Duża czułość i specyficzność. Pozwala na testowanie mutacji germinalnych (dziedzicznych) i somatycznych (nie dziedzicznych). Pozwala na konstrukcję paneli genowych np. PŁUCO gdzie bada się geny związane z tym nowotworem (jeden test, wielu pacjentów, wiele genów) Wysoka przepustowość = niski koszt + krótki czas Sekwencjonowanie kapilarne BRCA1/2 (exons) = 5000PLN NGS BRCA1/2 (exons) = 700-1000PLN
Poszukiwanie nowych możliwości terapeutycznych dla pacjentów z rakiem płuca Obecnie terapia rozsianego NSCLC opiera się na agresywnym leczeniu skojarzonym : chirurgia, chemioterapia i radioterapia Tylko około 13% pacjentów (10% mutacje w EGFR + 3% translokacja EML4-ALK) NSCLC może być leczonych terapiami celowanymi Reszta nie ma szans na leczenie terapią celowaną Trzeba poszukiwać nowych celów dla terapii celowanych w raku płuca
Mutacje wykryte u pacjentów NSCLC (EGFR WT and EML4-ALK (-)) za pomocą NGS % ERBB4 15% WT 40% MET 5% PIK3CA 5% BRAF 10% KRAS 25% potencjale inhibitory dostępne a niektóre są obecnie w badaniach klinicznych
Przypadek raka tarczycy Młoda dziewczyna 19 lat z rozpoznaniem podejrzenia raka tarczycy z BAC. Problem czy potrzebny jest zabieg usunięcia tarczycy? Wykonaliśmy sekwencjonowanie kapilarne BRAF i KRAS, ale nie znaleźliśmy mutacji. Więc wykonaliśmy analizę 50 onkogenów oraz supressorów za pomocą NGS i znaleźliśmy: NRAS p.q61r (CAA> CGA) TP53 p.leu265arg (CTG>CGG, c.182a>g) I zdecydowano o usunięciu tarczycy. BRAF ek15 wt KRAS ek 2 wt NRAS p.q61r
PREDYSPOZYCJE DO ROZWOJU CHORÓB NOWOTWOROWYCH Przykłady diagnostyki mutacji BRCA1&2 metoda NGS Źródło: Zakład Diagnostyki Molekularnej ŚCO, KIelce
Wyniki NGS (BRCA1/2) z tkanki raka jajnika - przykłady
Medycyna Personalizowana w Świętokrzyskim Centrum Onkologii Zastosowanie terapii w oparciu o wynik testu biomarkerów dostęp do terapii celowanej Terapia celowana
Problemy Nie ma obecnie prostego oraz jasnego systemu na adekwatny zwrot kosztów wykonania testów genetycznych. Rozwiązania, które powinno się wprowadzić na poziomie kraju: poprawić finansowanie zwiększyć dostępność skrócić czas realizacji podwyższyć jakość oraz kontrolę wykonywanych testów
Problemy Klonalność tkanki nowotworowej (mutacja nie jest obecna we wszystkich komórkach nowotworowych) potrzeba czulszych metod Komórka prawidłowa Komórka czerniaka bez mutacji w BRAF mut mut mut mut mut mut mut mut Komórki czerniaka z mutacją w BRAF mut mut
Wagle N1, et a. Dissecting therapeutic resistance to RAF inhibition in melanoma by tumor genomic profiling. J Clin Oncol. 2011 Aug 1;29(22):3085-96.
Mutation for validation using qpcr, dpcr, SangerSeq - example Sample Gene ID Position AA Change Frequency % TS VCF CLC GALAXY 761 2036 2362 4066 4069 KDR 55946123 G>T S1352R 35.2 + + + APC 112175225 G>T p.g1312* 62.7 + + + TP53* 7577509 C>T p.e126k 39.1 + + PIK3CA 178927410 A>G p.i391m 35.3 + + + TP53** 7577058 C>A p.e162* + + + + + + PIK3CA 178936091 G>A p.e545k 29.5 + + + MET 116340262 A>G p.n375s 44.9 + + + BRAF 140453136 A>T p.v600e 19.6 + + + KIT 55599323 A>G p.i817v 17.7 + + + FBXW7* ** 153249384 C>T p.r347h 17.0 + + + BRAF 140453136 A>T p.v600e 31.7 + + + TP53 7577068 delcg + + KIT 55593464 A>C p.m541l 52.8 + + + TP53 7578455 C>T A159T 32.8 + +
Problemy ograniczenia obecnie stosowanych metod w diagnostyce nowotworów Obecnie diagnostykę nowotworu przeprowadza się za pomocą metod inwazyjnych Materiał diagnostyczny uzyskuje się za pomoca bolesnych biopsji oraz operacji Nierzadko zdarza się, że ilość materiału uzyskana za ww. metod nie wystarcza do wykonania pełnej diagnostyki. W tych sytuacjach konieczne jest powtórne wykonanie bolesnej procedury. Dodatkowo obecnie wykorzystywane radiologiczne metody są nie precyzyjne i drogie. WNIOSEK: obecnie stosowane metody nie nadają się do regularnego i precyzyjnego monitorowania skuteczności leczenia.
Przerzut nowotworu znaczenie krążących komórek nowotworowych (CTC) Lokalna inwazja Intrawazacja CTC Extrawazacja Namanżanie w miejscu przerzutu http://www.rcsismj.com/2009-2010-issue/breast-ca-mets/
Po co oceniać CTC u pacjenta Wczesny nawrót choroby nowotworowej może być wykryty nawet 3-6 miesięcy przed możliwą ocena radiologiczną Genotypować CTC dla przewidzenia odpowiedzi na leczenie = biopsja płynów personalizacja leczenia
Doświadczenia ŚCO Przykład zastosowania immunofluorescencji do badania CTC wykrytych za pomocą fotocytometru Image Stream Mark II we krwi pacjentek leczonych z powodu raka jajnika przed zabiegiem operacyjnym operacyjnym 2 szt na 125 000 kom jadrzastych 1 szt na 125 000 kom jadrzastych CD45- marker leukocytów, DAPI- barwi jądro komórkowe, CD326 (Ep-CAM)- marker nabłonkowy Źródło Zakład Diagnostyki Molekularnej ŚCO 26
W poszukiwaniu rozwiązania problemu wzbogacania CTC nawiązaliśmy współpracę z WAT Sito zespolone + = 27
Nanocząstki- współpraca z zespołem Prof. Elbauma z Instytutu Fizyki PAS Nanocząstki mają właściwości fluorescencyjne i fotouczulacza tlenu singletowego (1O2) w bliskiej podczerwieni (NIR) oraz para i superparamagentyczne właściwości. Zastosowanie nanocząstek: za pomocą zewnętrznego źródła pola magnetycznego można je kumulować w danym miejscu, wzmocniony kontrast w magnetycznym rezonansie, niszczenie tkanki nowotworowej za pomocą miejscowego nagrzewania wywołanego zmiennym polem magnetycznym (hypertermia). Źródło Dr Bożenia Sikora IP PAS Warsaw
Instytut Wysokich Ciśnień PAN (UNIPRESS) w Warszawie Ryc. Schemat budowy i działania platform SERS Powierzchniowo wzmocniona spektroskopia ramanowska do wykrywania mutacji w DNA (dzięki uprzejmości Prof. dr hab. Jan Weyher IWC-PAN). Nanocząstki (ZrO2) do wykrywania, znakowania i niszczenia komórek nowotworowych (Profesor Łojkowski oraz Dr Świderska Środa)
Biopsja płynów przykład dpcr oceniający ilość kopii zmutowanego ctdna BRAF V600E w osoczu pacjentów z czerniakiem. Próbki osocza pobrano od trzech pacjentów (34, 35 i 36) chorych na rozsianego czerniaka przed rozpoczęciem leczenia (A) i po 6 tygodniach leczenia Vemurafenibem (drobnocząsteczkowy inhibitor zmutowanego białka BRAF V600E). Wykres przedstawia liczbę kopii ctdna z mutacją BRAF V600E w jednym ul osocza pobranego od pacjenta (mgr Małgorzata Chłopek, Zakład Diagnostyki Molekularnej ŚCO Kielce).
Biobank Świętokrzyski jako inwestycja w zdrowie i podstawa przyszłych profilaktycznych i naukowych programów Pojemność: 1 mln fiolek w -80C 155,000 próbek nowotworowych (tkanka, krew, DNA).
Przyszłość Biobanku ŚCO: elektroniczny osobisty rekord koncept Bio-PINu Biobankowanie jako inwestycja społeczeństwa w zdrowie Biobank Cykl wzbogacania rekordu pacjenta w dane kliniczne Badania diagnostyczne i naukowe
Przyszłe kierunki na rozwój ŚCO Świętokrzyskie Centrum Zaawansowanych Technologii Molekularnych i Imunoterapii Adoptywnej jako część Świętokrzyskiego Centrum Onkologii. Miejsce gdzie badania podstawowe łącza się z praktyką kliniczną dla poprawy skuteczności leczenia pacjentów.
Mierzalne efekty działalności ŚCO na polu prewencji i leczenia nowotworów. Prowadzone systematycznie badania epidemiologiczne jasno wskazują, że przed rozpoczęciem pełnoprofilowej działalności przez Świętokrzyskie Centrum Onkologii, częstość przezyćia buła 34% (przed 1995), podczas gdy obecnie jest na poziomie 60%.
Dziękuję za uwagę 36