RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 208844 (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: 381829 (51) Int.Cl. C12Q 1/00 (2006.01) G01N 33/48 (2006.01) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: 23.02.2007 (54) Sposób izolacji komórek nowotworowych zawartych w śluzie torbieli nowotworów jajnika typu śluzowego (43) Zgłoszenie ogłoszono: 01.09.2008 BUP 18/08 (73) Uprawniony z patentu: AKADEMIA MEDYCZNA IM. PIASTÓW ŚLĄSKICH WE WROCŁAWIU, Wrocław, PL (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 30.06.2011 WUP 06/11 (72) Twórca(y) wynalazku: JULIA BAR, Wrocław, PL PL 208844 B1
2 PL 208 844 B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest sposób izolacji komórek nowotworowych zawartych w śluzie torbieli nowotworów jajnika typu śluzowego, znajdujący zastosowanie w badaniach diagnostycznych płynów nowotworowych i badaniach naukowych nad oceną cech morfologicznych, immunofenotypowych i biologicznych komórek nowotworowych. Nowotwory jajnika, to grupa charakteryzująca się dużym zróżnicowaniem zarówno w budowie makroskopowej jak i mikroskopowej. Najliczniejszą grupę około 90% stanowią nabłonkowe nowotwory jajnika, które wywodzą się z nabłonka pokrywającego powierzchnię jajnika. W obrębie nabłonkowych nowotworów jajnika wyróżnia się typy histologiczne takie jak nowotwory jajnika typu surowiczego, które stanowią 30-70%, śluzowe stanowiące 5-20%, endometrioidalne - 10-20%, jasnokomórkowe 3-10% oraz nowotwory niezróżnicowane - 1%. W danym typie histologicznym wyróżnia się guzy o utkaniu nowotworu łagodnego, guzy o granicznej złośliwości oraz raki. Większość nowotworów nabłonkowych tworzy struktury o charakterze torbieli wypełnionych płynem surowiczym lub śluzem. Rak jajnika z uwagi na swoje umiejscowienie, daje późne i niejednoznaczne objawy kliniczne, około 2/3 chorych diagnozowana jest w zaawansowanych stadiach choroby. Większość obecnie prowadzonych badań naukowych dotyczy poszukiwania nowych biomarkerów, które mogłyby stanowić niezależne czynniki prognostyczne i predykcyjne w raku jajnika. Badania te koncentrują się na ocenie immunofenotypu, cech biologicznych komórek nowotworowych, które stanowiłyby podstawę do zastosowania alternatywnych metod terapii, a jednocześnie pozwoliłyby na określenie stopnia ryzyka rozwoju przerzutów, poprzez ocenę potencjału przerzutowego komórek raka jajnika. Do prowadzenia badań z zakresu biologii molekularnej, immunologii, cytogenetyki w rakach jajnika, najbardziej wartościowy materiał stanowią komórki nowotworowe zawarte w płynach torbieli. W ocenie cytologicznej materiału komórkowego zawartego w płynie torbieli stwierdza się przede wszystkim obecność komórek nowotworowych, które stanowią 90-100%, a w pojedynczych przypadkach obserwuje się obecność limfocytów w ilości 5-10% składu komórkowego. Pobranie materiału nie stanowi problemu z wyjątkiem nowotworów jajnika typu śluzowego. Torbiele w tym typie nowotworu wypełnione są gęstym śluzem, w którym zawarte są komórki nowotworowe. W skład śluzu omawianych nowotworów jajnika wchodzą lipopolisacharady obojętne jak i kwaśne, które mogą zwierać różne podstawniki rodnikowe. Skład biochemiczny śluzu nowotworów śluzowych jajnika nie wykazuje wyraźnych różnic ze śluzem takich nowotworów złośliwych jak rak o charakterze śluzowym żołądka, jelita grubego czy odbytu. Próby oddzielenia komórek nowotworowych od śluzu przy użyciu enzymów trawiennych, między innymi takich jak trypsyna, proteaza, czy mechaniczne rozbijanie śluzu, nie pozwoliły na uwolnienie komórek ze śluzu, powodując jednocześnie uszkodzenie komórek nowotworowych. W dostępnej literaturze nie znaleziono opracowania, które opisywałoby metodę izolacji komórek nowotworowych zawartych w śluzie. Problem oddzielenia komórek nowotworach od śluzu nie dotyczy wyłącznie nowotworów jajnika typu śluzowego, podobne trudności występują w nowotworach innych narządów, w budowie których stwierdza się obecność komórek wydzielających śluz. Z polskiego opisu patentowego nr 189 880 znany jest sposób wyprowadzania linii komórkowej jasnokomórkowego gruczolakoraka jajnika, poprzez długoterminową hodowlę materiału biologicznego na podłożu zawierającym płyn Eagle'a do hodowli komórek, o symbolu MEM, z dodatkiem płynu zawierającego L-glutaminę, o symbolu GLUT AM AX oraz antybiotyk, do którego to podłoża dodaje się uprzednio wyjałowionego płynu wysiękowego, pobranego z jamy otrzewnowej osoby chorej na wymieniony rodzaj raka w ilości 10-12% masy liczonej w stosunku do MEM. Z płynu wysiękowego uprzednio usuwa się komórki rakowe, a następnie dodaje z powrotem w postaci zawiesiny w jałowym buforowanym roztworze soli fizjologicznej (PBS) do podłoża. Hodowlę prowadzi się z wielokrotnym pasażowaniem poprzez trypsynizację i adekwatną zmianę podłoża, utrzymując ciągłość morfologicznie niezmienionej linii komórkowej, najkorzystniej poprzez zastąpienie podłoża z płynem wysiękowym, typowym podłożem zawierającym surowicę płodową naświetloną promieniami X. Sposobem tym uzyskuje się linię komórkową jasnokomórkowego gruczolakoraka jajnika, umożliwiająca ocenę mechanizmów lekooporności oraz poznanie genotypowych i fenotypowych różnic pomiędzy komórkami rakowymi pierwotnymi a komórkami hodowanymi in vitro. Sposobem tym nie udaje się jednak uzyskać linii komórkowej wyprowadzonej z raka jajnika typu śluzowego. Wynalazek dotyczy sposobu izolacji komórek nowotworowych zawartych w śluzie torbieli nowotworów jajnika typu śluzowego, z zastosowaniem dobranych czasów inkubacji i odczynników chemicznych, zwłaszcza buforowego roztworu soli fizjologicznej (PBS).
PL 208 844 B1 3 Istota wynalazku polega na tym, że niezwłocznie po pobraniu śluzu z torbieli nowotworowych umieszcza się go w naczyniu zanurzonym w łaźni wodnej o temperaturze 37-39 C i rozcieńcza roztworem PBS o temperaturze około 37 C, w stosunku objętościowym najkorzystniej 1:1, podgrzewa aż do uzyskania przez całość temperatury 37-39 C, po czym poddaje co najmniej jeden raz wirowaniu i usuwa supernatant znad osadu komórkowego. Następnie dodaje się do osadu komórek nowotworowych roztworu PBS o temperaturze 39 C i ciągle utrzymuje się temperaturę około 38 C, a następnie płucze się komórki nowotworowe, powtarzając wirowanie w takich samych warunkach. Do uzyskanego osadu komórek dodaje się PBS o temperaturze 37 C w ilości wystarczającej do jego pokrycia, sporządza preparat komórkowy, dodając PBS i przeprowadza się ocenę przeżyciową komórek nowotworowych, za pomocą mikroskopu świetlnego. Korzystne jest, przy stwierdzeniu w zawiesinie komórkowej obecności śluzu, przeprowadzenie ponownej procedury płukania i wirowania. Korzystne jest, w przypadku gdy śluz zawiera dużą liczbę erytrocytów, przeprowadzenie hemolizy, stosując odczynnik zawierający chlorek amonu, dwuwęglan potasu i dwuwersenian sodu, w stosunku objętościowym 1 ml zawiesiny komórek na 1 ml roztworu hemolizującego, a tak przygotowaną mieszaninę inkubuje się w łaźni wodnej w temperaturze 37 C i wiruje przy prędkości obrotowej 1800 obr/min, po czym osad komórkowy przemywa się dwukrotnie PBS o temperturze 37 C, przy zachowaniu parametrów wirowania. Nieoczekiwanie okazało się, że jeżeli pobiera się śluz z torbieli nowotworowych, nie dopuszczając do obniżenia się jego temperatury poniżej temperatury bliskiej temperaturze ciała ludzkiego i podczas dalszej preparatyki będzie się utrzymywać temperaturę w granicach 37-39 C, to sposobem według wynalazku uzyskuje się komórki nowotworowe pozbawione domieszki śluzu, które stanowią pełnowartościowy materiał do różnorodnych badań. Preparaty cytologiczne wykonane z tak przygotowanych komórek nie sprawiają trudności diagnostycznych. Cechy morfologiczne komórek nowotworowych są dobrze widoczne, w odróżnieniu od preparatów wykonanych z komórek zawieszonych w śluzie, które są w wielu przypadkach mało czytelne. Na tak wyizolowanych, pozbawionych śluzu komórkach nowotworowych, mogą być prowadzone badania dotyczące oceny immunofenotypowej, z wykorzystaniem technik enzymatycznych oraz hybrydyzacji in situ. Interpretacja wyników barwień immunohisto-chemicznych jest jednoznaczna, lokalizacja analizowanych antygenów jest dobrze widoczna. Brak jest reakcji nieswoistych, które są charakterystyczne dla preparatów zawierających śluz. Przedmiot wynalazku jest przedstawiony w przykładzie wykonania. Etap 1 - Inkubacja śluzu Śluz uzyskany z torbieli nowotworowych umieszcza się natychmiast w łaźni wodnej i rozcieńcza buforowanym roztworem soli fizjologicznej (PBS) o temperaturze 37 C w stosunku objętościowym 1 : 1, a następnie podgrzewa przez 2-3 godziny do momentu osiągnięcia temperatury 37-39 C. Etap 2 - Oddzielenie komórek nowotworowych Rozcieńczony i podgrzany śluz przenosi się do probówki o pojemności 25 ml i wiruje przez 10 minut przy 2000 obr/min. Następnie usuwa się supernatant znad osadu komórkowego przy użyciu pompki wodnej, a do osadu komórek nowotworowych dodaje się PBS o temperaturze 39 C, umieszcza w łaźni wodnej i doprowadza całość do temperatury 38 C. Etap 3 - Płukanie komórek nowotworowych Otrzymaną zawiesinę komórek nowotworowych przenosi się do probówki o pojemności 5 ml i dodaje PBS o temperaturze 39 C, umieszczana ponownie w łaźni wodnej i podgrzewana do temperatury 38 C, po czym poddaje ponownemu wirowaniu w warunkach jak wyżej opisano. Supernatant znad osadu komórek nowotworowych zlewa się, a do osadu komórek dodaje się PBS o temperaturze 37 C w ilości 3-4 ml, tak aby pokrył osad komórkowy i utrzymuje nadal temperaturę 38 C. Etap 4 - Ocena przeżyciowa komórek nowotworowych Sporządza się preparaty komórkowe, dodając do osadu komórkowego PBS o temperaturze 37 C, w stosunku objętościowym 5:1. Na otrzymanym preparacie komórkowym przeprowadza się przyżyciową ocenę czystości preparatów komórkowych przy użyciu mikroskopu świetlnego. Jeżeli w zawiesinie komórkowej stwierdza się obecność śluzu procedurę płukania przeprowadza się ponownie z zachowaniem parametrów jak opisano w etapie 3. W przypadku, gdy śluz zawiera dużą liczbę erytrocytów przeprowadza się hemolizę, stosując handlowy odczynnik Lysing Reagent firmy Diadnostic z USA, zawierający chlorek amonu, dwuwęglan potasu i dwuwersenian sodu, w stosunku 1 ml zawiesiny komórek na 1 ml roztworu hemolizującego. Tak przygotowaną mieszaninę inkubuje się w łaźni wodnej w temperaturze 37 C przez 20 minut,
4 PL 208 844 B1 a następnie wiruje przez 10 minut przy prędkości obrotowej 1800 obr/min. Osad komórkowy przemywa się dwukrotnie PBS o temperaturze 37 C, przy zachowaniu parametrów wirowania jak podano wyżej. Osad komórkowy rozcieńcza się PBS o temperaturze 37 C, w zależności od liczby komórek nowotworowych w proporcjach 20-50 milionów komórek w 1 ml PBS. Zawiesinę komórek nowotworowych do momentu rozpoczęcia wykonywania preparatów umieszcza się w cieplarce lub łaźni wodnej w temperaturze 37 C. Etap - 5 przygotowanie preparatów komórkowych Do osadu komórek nowotworowych nie zawierających śluzu dodaje się PBS o temperaturze 37 C, w proporcji 20-50 milionów komórek zawieszonych w 1 ml PBS o temperaturze 37 C. Roztwór komórek nowotworowych do momentu przygotowania preparatów utrzymuje się w temperaturze 37 C. Na szkiełka podstawowe nanosi się zawiesinę komórek nowotworowych pozbawionych śluzu. Na podstawie oceny cytologicznej preparatów komórkowych otrzymanych przykładowym sposobem uzyskano 5 odmiennych morfologicznie subpopulacji komórek nowotworowych o niżej podanych cechach. Cechy morfologiczne komórek nowotworowych zostały opisane po izolacji komórek ze śluzu. Typ 1 - Komórki złośliwe o zróżnicowanej wielkości (30-60 μ) o dużym, nieregularnym jądrze komórkowym, położonym centralnie. Jądro komórki często posiada wyraźną błonę jądrową o silnie zagęszczonej jednolicie rozłożonej chromatynie. Jąderka nie zawsze widoczne. Cytoplazma kwasochłonna skąpa, równomiernie otaczająca jądro komórki. Wskaźnik jądrowo-cytoplazmatyczny 3:1. Typ 2 - Komórki złośliwe o wielkości od 35 do 65 μ.. W cytoplazmie obecne pojedyncze duże lub liczne mniejsze wakuole otoczone wąskim rąbkiem cytoplazmy. Jądro komórki spłaszczone o silnie zagęszczonej cytoplazmie, zlokalizowane na obwodzie komórki. W jądrze widoczne jedno lub dwa jąderka, wskaźnik jądrowo-cytoplazmatyczny 1:3-1:5. Typ 3 - Komórki o cechach atypii duże (35-55 μ) o jądrze położonym centralnie lub obwodowo. Chromatyna niejednolicie rozłożona w jądrze, błona jądrowa rozmyta. W jądrze obecne 2 lub 3 jąderka. Cytoplazma obfita, kwasochłonna zawierająca liczne drobne wakuole. Wskaźnik jądrowo - cytoplazmatyczny 1:5. Typ 4 - Komórki nie wykazujące cech morfologicznej złośliwości o kształcie kielichowatym" o wielkości 40-60 μ. Jądro owalne lub okrągłe o równomiernie rozłożonej chromatynie, zlokalizowane u podstawy komórki. Jąderka pojedyncze. Cytoplazma kwasochłonna, jednorodna. Cytoplazma zakończona wypustkami w kształcie kielicha, w którym obserwuje się niewielkie ilości śluzu. Wskaźnik jądrowo-cytoplazmatyczny 1:3. Typ 5 - Komórki nie wykazujące cech złośliwości o wielkości 25-40 μ. Jądro komórki małe położone centralnie lub biegunowo o luźnym utkaniu chromatyny. Jądro zawiera jedno lub dwa jąderka. Cytoplazma kwasochłonna, homogenia. Wskaźnik jądrowo - cytoplazmatyczny 1:3. Cechy cytomorfologiczne komórek zawartych w płynach torbieli nowotworów jajnika typu śluzowego przedstawiono w poniższej tabeli. CECHY KOMÓREK TYPY KOMÓREK 1 2 3 4 5 KOMÓRKA : 30-60 μ 35-65 μ 35-55 μ. długość 40-60 μ szerokość 4 μ 25-40 μ 1 2 3 4 5 6 WIELKOŚĆ KSZTAŁT duża różna duża średnia średnia GRANICE okrągły okrągły okrągły kielichowaty okrągły wyraźne wyraźne wyraźne wyraźne wyraźne JĄDRO: ILOŚĆ pojedyncze pojedyncze pojedyncze pojedyncze pojedyncze KSZTAŁT nie zawsze regularny nieregularny okrągły owalny okrągły LOKALIZACJA centralna biegunowa centralna lub biegunowa biegunowa biegunowa lub centralna
PL 208 844 B1 5 cd. tabeli 1 2 3 4 5 6 HETERONUCLEOSIS + + - HYPERNUCLEOS1S +/- + - - - CYTOPLAZMA OBFITOŚĆ skąpa skąpa lub obfita obfita umiarkowana umiarkowana BARWLIWOŚĆ kwasochłonna kwasochłonna pojedyncza kwasochłonna kwasochłonna liczne drobne kwasochłonna WODNICZKI brak duża lub kilka drobnych liczne drobne liczne drobne brak WSKAŹNIK N/C 3:1 1:3-1:5 1:5 1:3 1:3 Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób izolacji komórek nowotworowych zawartych w śluzie torbieli nowotworów jajnika typu śluzowego z zastosowaniem dobranych czasów inkubacji i odczynników chemicznych, zwłaszcza buforowego roztworu soli fizjologicznej (PBS), znamienny tym, że niezwłocznie po pobraniu śluzu z torbieli nowotworowych umieszcza się go w naczyniu zanurzonym w łaźni wodnej o temperaturze 37-39 C i rozcieńcza roztworem PBS o temperaturze około 37 C, w stosunku objętościowym najkorzystniej 1:1, podgrzewa aż do uzyskania przez całość temperatury 37-39 C, po czym poddaje co najmniej jeden raz wirowaniu i usuwa supernatant znad osadu komórkowego, a następnie dodaje się do osadu komórek nowotworowych roztworu PBS o temperaturze 39 C i ciągle utrzymuje temperaturę około 38 C, po czym płucze się komórki nowotworowe, powtarzając wirowanie w takich samych warunkach, zaś do uzyskanego osadu komórek dodaje się PBS w ilości wystarczającej do jego pokrycia, sporządza preparat komórkowy dodając PBS i przeprowadza się ocenę przeżyciową komórek nowotworowych za pomocą mikroskopu świetlnego. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w przypadku stwierdzenia obecności śluzu w zawiesinie komórkowej, przeprowadza się ponowną procedurę płukania i wirowania. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w przypadku, gdy śluz zawiera dużą liczbę erytrocytów, przeprowadza się hemolizę, stosując odczynnik zawierający chlorek amonu, dwuwęglan potasu i dwuwersenian sodu, w stosunku objętościowym 1 ml zawiesiny komórek na 1 ml roztworu hemolizującego, a tak przygotowaną mieszaninę inkubuje się w łaźni wodnej w temperaturze 37 C i wiruje przy prędkości obrotowej 1800 obr/min, po czym osad komórkowy przemywa się dwukrotnie PBS o temperaturze 37 C, przy zachowaniu parametrów wirowania.
6 PL 208 844 B1 Departament Wydawnictw UP RP Cena 2,46 zł (w tym 23% VAT)