Ćw. M8 Zjawisko absorpcji i emisji światła w analityce. Pomiar widm absorpcji i stężenia ryboflawiny w roztworach wodnych za pomocą spektrofotometru. Wyznaczanie stężeń substancji w roztworze metodą fluorescencyjną. Zagadnienia Kwantowa teoria światła. Struktura energetyczna cząsteczki. Zjawisko absorpcji. Prawo Lamberta Beera. Wielkości służące do ilościowego opisu zjawiska absorpcji. Zjawisko fluorescencji. Prawa związane z tym zjawiskiem. Wielkości służące do ilościowego opisu zjawiska fluorescencji. Widma absorpcji i fluorescencji. Wykorzystanie metod spektroskopowych w analizie ilościowej i jakościowej. Opis ćwiczenia: W ćwiczeniu mierzymy absorbancję i fluorescencję serii roztworów ryboflawiny. Na podstawie zmierzonych widm analizujemy zależność absorpcji i fluorescencji światła od stężenia substancji. Należy sporządzić krzywą wzorcową, znaleźć jej równanie i na jego podstawie wyznaczyć nieznane stężenie roztworu C x, korzystając z danych uzyskanych zarówno z pomiarów absorpcyjnych jak i fluorescencyjnych.. Instrukcja 1. Wykonaj serię roztworów ryboflawiny o stężeniach zadanych przez prowadzącego ćwiczenia. 2. Włącz komputer. 3. Włącz spektrometr M42. O i UV M42 komora pomiarowa (otwierać podnosząc do góry) włącznik 1
4. Włącz oprogramowanie AspectPlus (ikona na pulpicie). 5. Znajdź na pasku zadań Measurement, rozwiń, wybierz Init Device i poczekaj, aż zainicjuje się połączenie z aparatem. 6. W tym samym Menu wybierz: Set parameters i upewnij się, że ustawienia są takie same jak w podanym niżej przykładzie. Jeśli nie - na rozwiniętym pasku wybierz: 1 D:\MEDYCYNA\RFL.PAR i ponownie sprawdź ustawienia parametrów pomiarowych (Set parameters). Ustawione tu będzie m.in. w jakim zakresie długości fal, z jaką dokładnością i szybkością będzie prowadzony pomiar. 2
7. Wstaw do komory pomiarowej (klapkę podnosi się do góry) dwie kuwety: jedną z wodą destylowaną, drugą z roztworem mierzonym (najlepiej zacząć od roztworu najmniej stężonego i skończyć na roztworze wyjściowym). kuweta z roztworem referencyjnym (z tyłu) kuweta z roztworem pomiarowym (z przodu) 8. W menu Measurement wybierz Measuere. Rozpocznie się pomiar widma absorpcji danego roztworu. W trakcie pomiaru dostępne będą polecenia: Stop i Scale. Można wejść w Scale i dostosować sobie podziałkę na osi absorbancji. Wszelkie komunikaty jakie pojawią się po zmierzeniu widma akceptuj przez kliknięcie OK. 9. Po skończonym pomiarze należy odczytać przy jakiej długości fali pojawia się maksimum absorbancji. W tym celu trzeba wejść w polecenie Data Handing a następnie Analysis i Peak. Po wybraniu pojawi się komunikat dotyczący parametrów wybieranego piku. Ważne aby było zaznaczone, że poszukujemy maksimum. Po wybraniu OK pojawi się informacja o wartości absorbancji w maksimum oraz o długości fali przy jakiej to maksimum występuje. Informacje te należy spisać do tabeli, nie zapominając o wartości stężenia jakie miała mierzona ryboflawina. 3
10. Następnie należy wymienić mierzony roztwór i powtórzyć operację od punktu 8. 4
11. Przejdź na stanowisko do pomiaru fluorescencji i zmierz fluorescencję badanych roztworów przy długości fali równej max absorpcji. 12. Uzyskane wyniki opracuj w programie GraphPad Prism według podanej instrukcji. 13. Znając równanie prostej policz C x (stężenie nieznane roztworu ryboflawiny)z pomiarów absorpcyjnych i fluorescencyjnych. Oszacuj niepewność uzyskanych wyniku. 14. Poproś prowadzącego o wydrukowanie wykresów max =. Lp. stężenie A max I max ( A) 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. c x 5