Podstawowym prawem wykorzystywanym w analizie opartej na metodah optyznyh (spektrometrii) jest prawo Lamberta (zwane też prawem Lamberta-Beera-Waltera). Chodzi tu o zależność absorbanji od stężenia i grubośi warstwy pohłaniająej l: = ε l jeśli wyrazimy w molah/dm 3 a l w m (w praktye stosujemy najzęśiej kuwety o grubośi warstwy roztworu absorbująego światło wynosząej 1 m) to ε nosi nazwę molowego współzynnika absorpji. Stosują molowy współzynnik absorpji, szukane stężenie wylizamy w molah/dm 3. Wynik w takih jednostkah jest najzęśiej pożądany w badaniah typu poznawzego. Sens fizyzny wartośi molowego współzynnika jest to wartość (ozywiśie tylko hipotetyzna, bo takiej wartośi żaden przyrząd nie zmierzy) absorbanji roztworu o grubośi warstwy 1 m i stężeniu 1 mol/dm 3. Dla określania stężenia w jednostkah masowyh (np. proentah zy ppm) wygodniej jest stosować tzw. właśiwy współzynnik absorpji, zapisywany zazwyzaj jako a 1 m 1%. Jest to wartość absorbanji roztworu o stężeniu 1% o grubośi warstwy 1 m. Nie zmienia to ozywiśie w nizym samego prawa, inne są tylko wartośi współzynników: =a % 1m l stężenie wyrażamy wówzas ozywiśie w proentah! bsorbanja to wartość logarytmu dziesiętnego z odwrotnośi transmitanji T, zaś transmitanja to stosunek natężenia światła wyhodząego z próbki I x do natężenia światła padająego na próbkę I o : T = I x I o =log 1 T =log I o I x Warto zauważyć, że dla pełnej przepuszzalnośi (brak absorpji promieniowania I x = I o ) = 0, zaś dla roztworu absorbująego 90% promieniowania (I x = 0,1 I o tylko 10% promieniowania przehodzi przez próbkę) = 1. =2 oznaza, że próbka pohłonęła aż 99% światła, a aparat musi praować na podstawie tylko 1% promieniowania wyemitowanego przez źródło światła. W praktye osłabienie natężenia promieniowania następuje po przejśiu przez każdy roztwór, nawet teoretyznie nie zawierająy substanji absorbująyh (drobne odbiia i rozproszenia na śiankah kuwety, załamania w zasie przehodzenia przez granie faz (powietrze-śianka kuwetyroztwór-śianka kuwety-powietrze), obeność drobnyh zaniezyszzeń mehaniznyh roztworu (zmętnienie) oraz innyh, poza oznazanym, składników roztworu, które teoretyznie nie absorbują światła, ale przy dużyh stężeniah też wnoszą swój udział w sumaryzna absorbanję). W związku z tym, zarówno przy wyznazaniu krzywej wzorowej (o tym już za hwilę) jak i pomiarah musimy stosować tzw. ślepą próbę lub bardziej prawidłowo - próbę odniesienia. Pomiar absorbanji spowodowanej wyłąznie obenośią substanji oznazanej zasadza się na pomiarze wartośi absorbanji ślepej próby, zyli próby, która jest identyzna z próbką badaną, za wyjątkiem obenośi w niej substanji badanej (wynik nazwijmy ') i pomiarze absorbanji próbki badanej, zyli (' + ozn. ). Odejmują od wartośi absorbanji próbki badanej wartość absorbanji ślepej próby otrzymujemy wartość absorbanji zależną wyłąznie od zawartośi substanji oznazanej ( ozn. ):
(' + ozn. ) - ' = ozn. Najzęśiej odbywa się to tak, że identyzna wiązka światła przehodzi równoześnie przez próbkę badaną i ślepą próbę (przyrządy dwuwiązkowe) i aparat mierzy od razu różnię. W aparatah jednowiązkowyh najpierw przepuszzamy wiązkę światła przez ślepa próbę, aparat zapamiętuje tę wartość, a następnie wymieniamy próbkę na próbkę badaną i aparat podaje nam różnię, zyli szukane ozn. Każda z tyh metod ma swoje wady i zalety. Znają wartość ozn. (zmierzone), grubość warstwy absorbująej (zastosowana kuweta) i współzynnik absorpji, bez trudu ze wzorów podanyh na pozątku, oblizymy stężenie badanej substanji w próbe mierzonej (w roztworze w kuweie). Największy problem jest z wartośią współzynnika absorpji. Jego wartość głównie zależy od substanji, ale w dość znaznym stopniu także między innymi od długośi fali stosowanego promieniowania i oddziaływań międzyząstezkowyh, a te zależą pośrednio od polarnośi substanji i rozpuszzalnika, temperatury i stężenia. Ponieważ światło w spektrokolorymetrah nie jest nigdy monohromatyzne (wiązka składa się z fal o nieo rożnyh długośiah tzw. spektralna szerokość wiązki, parametr związany z konkretnym przyrządem) można krótko powiedzieć, że wartość współzynnika absorpji zależy nie tylko od badanej substanji, ale także od tego zym (aparatura) i w zym (fizykohemizne parametry roztworu) oraz w jakiej temperaturze dokonujemy pomiaru. Jest i drugi problem związany z pomiarami kolorymetryznymi (ogólniej spektroskopowymi) i prawem Lamberta-Berra. Ze wzoru wynika, że zależność między stężeniem a absorbanją jest liniowa (wprost proporjonalna). W praktye jest tak tylko wówzas, gdy oddziaływania w roztworze nie są zbyt silne, stężenia mierzone nie różnią się zbytnio, promieniowanie jest monohromatyzne (tego warunku nie spełnia prawi żaden przyrząd) a temperatura pomiarów stała. Prawo Lamberta-Beera zostało wyprowadzone przy założeniu monohromatyznośi wiązki światła, stałej temperatury i braku oddziaływań międzyzastezkowyh niestety zęsto się o tyh założeniah nie pamięta. Tak wię przed przystąpieniem do pomiarów nigdy nie wiemy ani ile dokładnie wynosi w warunkah pomiaru współzynnik absorpji ani w jakim zakresie stężeń wolno nam stosować zasadę liniowośi zależnośi absorbanji od stężenia. Do wybrnięia z tyh tarapatów służy nam krzywa wzorowa. Krzywa wzorowa pozwala nam stwierdzić, zy w interesująym nas zakresie stężeń badanej substanji obowiązuje prostoliniowa zależność absorbanji od stężenia i ile wynosi w warunkah naszego doświadzenia (pomiarów) wartość współzynnika absorpji. W elu wyznazenia krzywej (a właśiwie prostej :)) wzorowej przygotowujemy kilka roztworów zawierająyh różne - ale dokładnie znane ilośi oznazanego związku. Skład tyh wzorowyh roztworów powinien być taki, jak późniejsze badane próbki (lub przynajmniej bardzo zbliżony, bo zasem dokładnego składu roztworu analizowanego nie znamy). Roztworów przygotowujemy o najmniej 5, a najzęśiej około 10. Stężenia w poszzególnyh roztworah wzorowyh powinny być tak dobrane, by równomiernie pokrywały ały interesująy nas zakres stężeń, a jednoześnie tak, by ih absorbanje nie były mniejsze od 0,1 ani większe od 1. Ten zakres wartośi absorbanji zależy w dużej mierze od klasy stosowanego przyrządu, ale bez względu na przyrząd nie należy shodzić poniżej wartośi 0,1, bo wówzas dość znaznie zwiększamy błąd pomiaru (a tym samym obniżamy dokładność oznazenia). Warto tu wspomnieć i o tym, że nie należy tyh roztworów wzorowyh przygotowywać przez kolejne rozieńzanie jednego, stężonego roztworu wyjśiowego (o jest niestety powszehnie stosowaną praktyką - zyste lenistwo!), bowiem wówzas ewentualny błąd popełniony przy sporządzaniu roztworu wyjśiowego przeniesie się na wszystkie roztwory wzorowe i na wyniki naszyh oznazeń!!
Po sporządzeniu serii roztworów wzorowyh o różnyh stężeniah oznazanej substanji mierzymy ih absorbanje wobe ślepej próby i na podstawie uzyskanyh danyh (stężenie (oś x) absorbanja oś y)) wyznazamy przebieg krzywej wzorowej i oblizamy wartość współzynnika absorpji. Dokonujemy tego przez wyznazenie równania regresji liniowej (arkusz kalkulayjny). Wartość współzynnika determinaji (R 2 ) określa nam liniowość naszyh danyh ( zgodność z prawem Lamberta-Beera ), powinna być ona równa o najmniej 0,95 lub więej (w zależnośi od wymaganej dokładnośi oznazeń). Wartość współzynnika regresji (a) to nasz współzynnik absorpji, zaś wartość b (przeięie prostej z osią y) powinna być bliska 0. Wartośi ujemne świadzą o błędzie w doświadzeniu, większe od zera mogą być spowodowane brakiem prostoliniowośi w układzie stężenie-absorbanja (lub też błędem) tak zy inazej w przypadku wartośi b znaznie różniąyh się od zera (powyżej 0,01) należy przeanalizować sytuaję. Po stwierdzeniu prostoliniowośi w interesująym nas zakresie stężeń i wyznazeniu wartośi współzynnika absorpji możemy przystąpić do pomiarów badanyh próbek wyznazenie absorbanji badanej próbki wobe ślepej próby pozwala z wzoru Lamberta oblizyć wartość stężenia badanego roztworu (tego w kuweie), a po uwzględnieniu proesów obrabiania próbki (np. rozieńzenia) zawartość oznazanej substanji w badanym materiale. Jeśli w wybranym przez nas zakresie stężeń widzimy wyraźny brak prostoliniowośi, zawężamy zakres do przedziału praktyznie prostoliniowego. Czasem dzielimy większy przedział o krzywoliniowym przebiegu na dwa o przebiegah praktyznie prostoliniowyh i różnyh wartośiah a i b. Z reguły nie wolno ekstrapolować otrzymanego wykresu poza sprawdzony zakres stężeń! Kiedyś (gdy brak komputerów powodował, że oblizanie równań regresji było dość uiążliwe) krzywą wzorowa wyznazano grafiznie, tworzą ręznie wykres na papierze milimetrowym. Jest to jednak metoda niejednoznazna (każdy sporządzi nieo inny wykres z tyh samyh danyh!) i obarzona ryzykiem dość dużego błędu i z tyh powodów należy ją wysłać do lamusa. Przykład wyznazenia krzywej kalibraji: Wyznazenie krzywej kalibraji dla oznazeń substanji w rozpuszzalniku grubość warstwy - 1 m długość fali analityznej 572 nm nr kolbki stężenie [mol/dm 3 ] 1,200 Zależność absorbanji od stężenia 1 2,10E-004 0,135 2 3,80E-004 0,251 3 5,50E-004 0,348 4 7,20E-004 0,476 5 8,90E-004 0,562 6 1,06E-003 0,694 7 1,23E-003 0,782 8 1,40E-003 0,891 9 1,57E-003 1,024 10 1,74E-003 1,122 bsorbanja 1,000 0,800 0,600 0,400 0,200 molowy współzynnik absorpji a = 643,81 przejśie przez 0 bardzo dobrze b = 0,0008 liniowość bardzo dobra R 2 = 0,9991 0,000 0,00E+000 5,00E-004 1,00E-003 1,50E-003 2,00E-003 [mol/dm3]
Poniżej przedstawiono hipotetyzny przebieg krzywej wzorowej dla substanji nie spełniająej założeń prawa Lamberta Beera (przebieg poszzególnyh odinków mono przejaskrawiono, w elu wyraźnego przedstawienia istoty problemu). Wartość absorbanji tła, w praktye niwelowana przez zastosowanie ślepej próby 0 a b Dla zakresu stężeń od 0 do a mamy przebieg praktyznie prostoliniowy, przehodząy przez pozątek układu współrzędnyh pełna zgodność z prawem Lamberta Beera. Dla stężeń powyżej b przebieg jest prostoliniowy, lez o innej wartośi współzynnika absorpji i nie przehodzi on przez pozątek układu. Zakres stężeń od a do b jest krzywoliniowy tu niezgodność z prawem Lamberta jest nie do zaakeptowania. Na tym zbiorzym wykresie widać, jak niebezpiezne jest interpolowanie przebiegu krzywej wzorowej poza zakres sprawdzony doświadzalnie. W praktye poszzególne wykresy krzywyh wzorowyh zarejestrowanyh w odniesieniu do ślepej próby wyglądałyby następująo: a) = ε, stężenie wylizamy z prostego przekształenia wzoru = /ε 0 a
b) = ε + t stężenie wylizamy z wzoru = ( t)/ε Tu równanie regresji dla krzywej i równanie do oblizania stężenia powinniśmy wyznazyć niezależnie (w pierwszym przypadku za zmienną niezależna biorą, w drugim przypadku za zmienną niezależną biorą ). Stosowany zazwyzaj sposób prostego przekształenia równania regresji opisująego krzywą wzorową w równanie oblizania stężenia na podstawie wartośi absorbanji, tak jakby to było równanie funkji a nie regresji, jest formalnie błędem, hoć różnie zazwyzaj są niewielkie (ale są!). t 0 a b ) Zakres zależnośi absorbanji od stężenia (zakres między stężeniem a oraz stężeniem b), w obrębie którego nie należy przeprowadzać analiz 0 a b