Katarzyna Guz Instytut Hematologii i Transfuzjologii w Warszawie
Nieinwazyjne badania molekularne antygenów komórek krwi Dlaczego są ważne? Dzięki czemu są możliwe? Jakimi metodami prowadzimy je w Polsce i na świecie? Dlaczego nie są proste? Jakie są nasze wyniki i wyniki innych laboratoriów? Co wymaga ulepszenia?
Dlaczego są ważne? Antygeny komórek krwi mogą być immunogenne: erytrocyty: najważniejsze RhD, ale też K, Rhc, RhE i inne płytki: najważniejsze HPA-1a, ale też HPA-5b i inne HPA Matczyne alloprzeciwciała mogą powodować chorobę hemolityczną (ChHPN) lub alloimmunologiczną małopłytkowość (AIMP/N) płodu/noworodka, gdy dany antygen jest obecny na komórkach płodu nie są groźne, gdy płód nie ma antygenu do którego są przeciwciała nie trzeba monitorować ciąży metodami inwazyjnymi (kordocenteza, amniopunkacja - ryzyko utraty płodu 1%, pogłębienia alloimmunizacji Immunoprofilaktyka konfliktu RhD nie potrzebna jak płód Rh-
Konflikt RhD przed immunoprofilaktyką ~20% immunizacja immunoprofilaktyka po porodzie, poronieniu 1,6% immunizacja (Lenkiewicz 2000), 0,49% w latach 2006-2007 (Żupańska 2009) ~1000 rocznie w Polsce 90% skuteczność (zaniedbania podania immunoglobuliny anty-d, za mała dawka, przeciek i alloimmunizacja już w trakcie ciąży, u 1% ciężarnych w pierwszej ciąży, błędy w oznaczeniu RhD dziecka) immunoprofilaktyka w 28 lub 34 tyg ciąży (rutynowo stosowana w wielu krajach) Obniżenie ryzyka immunizacji do 0,3% (van der Schoot 2009) wysokie koszty, a nie jest potrzebna gdy płód RhD ujemny (40%) w Wielkiej Brytanii 40 000 kobiet na 700 000 porodów rocznie niepotrzebnie dostanie immunoglobulinę anty-d (Wright 2009)
Konflikty inne niż RhD brak immunoprofilaktyki obowiązek skriningu przeciwciał czerwonokrwinkowych u wszystkich ciężarnych w 12 i 28 tyg ciąży od roku 1996 zagwarantowany ustawowo: ocena stosowania tego prawa w latach 2006-2007 (Żupańska 2009): niespełna 48% ciężarnych objęto badaniami skriningowymi (prawie 100% w Holandii) jedynie 50% z nich to ciężarne RhD dodatnie (ich liczba powinna być 5-krotnie wyższa) przeciwciała nie anty-d u 0,37% ciężarnych RhD+ (anty-e, -K, - c, -Jk a,-jk b, -Fy a, -C, MNS, anty-co a ) szacunkowo ~2000 przypadków rocznie w Polsce aż 4/5 niedodiagnozowane
Klinicznie istotne przeciwciała nie anty-d Anty-K: ciężka ChHP/N Anty-c: ciężka ChHPN nawet przy niskim mianie przeciwciał przeciwciała mogą wytworzyć się w późniejszym etapie ciąży Anty-E: często wykrywane u ciężarnych na ogół nie reagują one w pośrednim teście antyglobulinowym (PTA) albo miano ich jest bardzo niskie rzadko są przyczyną choroby hemolitycznej płodów/noworodków (ChHP/N) zdarzają się przypadki ChHP/N o bardzo ciężkim przebiegu
Dzięki czemu są możliwe? badania antygenów Diagnostyka prenatalna Inwazyjna na komórkach pobranych w trakcie kordocentezy DNA z amniocytów zbyt mało materiału u około 2% kobiet; ryzyko utraty płodu 1% (Mujezinovic, 2007) z kosmków łożyska zbyt mało materiału u około 8%; ryzyko utraty płodu u około 1% (Mujezinovic, 2007) W Wielkiej Brytanii rocznie ~20 000 amniocentez i 5 000 CVS - około przypadków 250 utraty płodu Nieinwazyjna badania komórek płodu we krwi matki zarzucona bo komórki te mogą przetrwać >20 lat wolnokrążącego DNA płodu (cell free fetal - cff-dna) w osoczu kobiety ciężarnej
cff-dna w osoczu ciężarnych (Lo 1997) DNA matki cff-dna Izolacja DNA Z wykładu Non invasive Prenatal Diagnosis Technical Challenges and Advances, Helen White, PhD, 2009
Charakterystyka cff-dna możliwe do wykrycia już w 5/7 tygodniu ciąży stężenie początkowo bardzo niskie, wzrasta z wiekiem ciąży, ale zawsze konieczne czułe metody by je wykryć stanowi tylko 3-6% DNA w osoczu reszta to DNA matki ulega degradacji w kilka godzin po porodzie (źródłem cff-dna komórki trofoblastu)
Kierunki intensywnych badań cff-dna w osoczu Choroby uwarunkowane genetycznie sprzężone z płcią jednogenowe aneuploidia Konflikty serologiczne (od 10 lat w IHiT): RhD, Rhc, RhE K w standaryzacji
Jakimi metodami badamy cff-dna? Efektywna metoda izolowania DNA: z dużych objętości (1 ml) odczynnikami dedykowanymi do izolowania kwasów nukleinowych wirusów Bardzo czuła i specyficzna detekcja DNA: real-time PCR spektrometria mas MALDI-TOF digital PCR Ograniczenie ryzyka kontaminacji na etapie przedanalitycznym i analitycznym
Dlaczego nie jest to proste? śladowa ilość cff-dna w osoczu wobec wysokiej proporcji DNA matki tylko połowa genów w cff-dna pochodzi od ojca różna skala trudności badania w zależności jakie jest podłoże genetyczne determinujące antygen, którego szukamy u płodu ryzyko kontaminacji próbki DNA w fazie przedanalitycznej genem powszechnym w populacji konieczność udowodnienia, że badamy DNA płodu, a nie tylko DNA matki - trudności w opracowaniu taniej, uniwersalnej kontroli cff-dna > niedopuszczalny wynik fałszywie ujemny!
Skale trudności nieinwazyjnych badań prenatalnych Najłatwiej szukać genu, którego nie ma u matki SRY - nie ma go u kobiet RHD nie ma go u kobiet RhD-, a jest u osób RhD+ ale skomplikowane i różnorodne podłoże fenotypów RhD+ i RhD stwarza dodatkowe trudności
Podłoża genetyczne fenotypu RhD(-) Delecja (brak) genu RHD (99% w rasie białej*) pseudogen RHD ψ (67% w rasie negroidalnej) RHD-CE(3-9)-D (4-6% w rasie żółtej) RHDel (20-30% w rasie żółtej) inne nieznane dotąd mutacje * u 1% osób RhD- rasy kaukaskiej gen RHD jest obecny, różne warianty RHD niemego
Warianty białka RhD o zmienionej ekspresji lub/i zmienionych epitopach Słabe D - mała ilość antygenu D na krwinkach mutacje punktowe w regionach przezbłonowych lub wewnątrzkomórkowych białka RhD i niektóre hybrydy RHD-CE-D Częściowy D - utrata jakiegoś epitopu D hybrydy RHD-CE-D lub mutacje punktowe w zewnątrzkomórkowych fragmentach białka RhD DEL - szczególnie słaby D możliwe do wykrycia serologicznie tylko techniką adsorpcji elucji mutacje nonsensowne lub delecja eksonu 9 lub 8 RHD
Konsekwencje skomplikowanego podłoża genetycznego antygenu RhD dla nieinwazyjnej diagnostyki Niektóre osoby RhDmają gen RHD lub jego fragmenty Niektóre osoby RhD+ mogą nie mieć pewnych fragmentów genu RHD Jeśli kobieta Rh ujemna ma niemy gen RHD nie można u niej wykonać nieinwazyjnej diagnostyki RHD płodu Analiza poziomu genu RHD względem genu kontrolnego na poziomie ilości DNA matczynego a nie cff-dna RhD dodatni płód może nie mieć wszystkich eksonów/intronów genu RHD Konieczne badanie więcej niż jednego fragmentu RHD
fluorescencja Ilościowe wyniki wykrywania RHD pozwalają odróżnić czy to gen płodu czy matki Sygnał tła (fluorescencja z pierwszych 15 cykli) RhD dodatnia kobieta Ct=28 RhD ujemna kobieta z RhD dodatnim płodem Ct=35 Osoba RhD ujemna Ct=40
Przypadki w których niemożliwe było nieinwazyjne ustalenie czy płód jest RhD+ IHiT, Warszawa 4 matki z RHD słabe 1 matka z wariantem RHDel (IVS3 +1G>A) 5/353 Amsterdam 16/2380 6 RHD 1 RHDel (IVS3 + 1 G>A) RHD częściowe (3 DVI typ 2, 1 DVI typ 1; 1 DV typ 4) 3 RHD słabe (typ 1, 11, 17)
Jeśli w osoczu kobiety ciężarnej Rhnie wykryto genu RHD najprawdopodobniej płód jest RHD ujemny lecz trzeba potwierdzić, że w próbce było: wystarczająco dużo DNA płodu dobra jakość DNA płodu Badamy geny kontrolne odziedziczone po ojcu, a nie obecne u matki dla chłopców : gen SRY dla dziewczynek: polimorfizmy typu delecja genu: GSTM1, GSTT1, S03, S06, S 15 lub bialleliczne polimorfizmy typu insercja/delecja w obrębie genu: S01a/b, S04a/b, S05a/b, S07a/b, S08a/b, S09a/b, S10a/b, S11a/b, S14a/b, S 18a/b RHCE, ACEdel/ins TRUDNE, ŻMUDNE, DROGIE Transfusion, 2005, 45, 9 Gin.Pol, 2004, 75, 12 Gin.Pol, 2004, 75, 1
Wykrywanie genu kodującego RhD w osoczu RhD ujemnej ciężarnej WYNIKI POWTARZALNE > dla 3 reakcji realtime PCR (3 fragmentów genu RHD) Gen RHD + Gen RHD- Gen SRY+ Gen RHD- Gen SRY- WYNIKI ROZBIEŻNE GEN RHD+/- POWTÓRZYĆ BADANIE RhD (+) dziecko RhD (-) chłopiec prawdopodobnie RHD (-) dziewczynka ALE trzeba potwierdzić obecność DNA płodu z drugiej probówki wykryciem polimorfizmu ins/del odziedziczonego po ojcu
Przykład wyniku Zakład Immunologii Hematologicznej i Transfuzjologicznej Instytut Hematologii i Transfuzjologii 00-957 Warszawa, ul. Chocimska 5 Warszawa dn. 17.02.2005 Wynik Metodą real-time PCR w osoczu pani XY (RhD-) z 16 tygodnia ciąży nie wykryto genu RHD pochodzącego od płodu. Osocze zawierało DNA płodu, co potwierdzono wykrywając w nim polimorfizmy S08a i ACEdel, nieobecne u matki, a obecne u ojca (pana Z Y). Komentarz: Wyniki badania wskazują, że płód jest Rh ujemny.
Konsekwencje kliniczne fałszywych wyników Fałszywie dodatni = wykrywamy antygen, którego płód nie ma Fałszywie ujemny = nie wykrywamy antygenu, który jest groźny Płód jest traktowany jako mogący zimmunizować matkę i zagrożony ChHPN niepotrzebnie zastosowana immunoprofilaktyka anty-d (dotyczy tylko konfliktu Rh) monitorowanie hemolizy u płodu co byłoby i tak stosowane gdyby badania cff-dna nie wykonać Płód jest traktowany jako nie zagrożony, a: matka powinna dostać immunoglobuliną anty-d (dotyczy tylko konfliktu Rh) płód powinien być monitorowany i ewentualnie leczony
Potencjalne źródła wyniku fałszywie dodatniego, sposoby przeciwdziałania Kontaminacja próbki materiałem zawierającym DNA od osoby RhD dodatniej >> odpowiedni sposób pobierania, przesyłania materiału, izolacji DNA, wykonania badania Obecność niemego genu RHD u płodu w populacji kaukaskiej ryzyko około 0,2-1% jeśli ojciec innej rasy niż kaukaska ryzyko większe konieczność analizy wykrywania różnych fragmentów RHD należy podać na skierowaniu pochodzenie etniczne (rasa czarna, żółta)
Potencjalne źródła wyniku fałszywie ujemnego, sposoby przeciwdziałania Brak lub zbyt mała koncentracja DNA płodowego w próbce Konieczne udowodnienie obecności cff-dna: dla płodów płci męskiej wykrycie genów z chromosomu Y dla płodów płci żeńskiej wykrycie genu/polimorfizmu ins/del odziedziczonego po ojcu, a nie obecnego u matki (wieloetapowe i skomplikowane badania) Powtórzenie badania w późniejszym etapie ciąży Dalsze badania nad sposobami udowodnienia dobrej jakości cff-dna w próbce badanej analiza metylacji DNA
Skala trudności diagnostyki nieinwazyjnej w konfliktach innych niż RhD znacznie trudniejsza, bo podłożem różnicy antygenów u matki i płodu są tzw. SNP wysoki poziom niespecyficznej amplifikacji, powstający z przeważającej ilości DNA matczynego zadawalające wyniki jedynie dla badania: alleli RHCE*c, RHCE*E genu RHCE ze względu na to że, użyte startery zawierają dodatkowe polimorfizmy SNP, prócz tych warunkujących antygeny Rhc czy RhE allelu KEL*1 ze względu na modyfikację startera - wstawienie tzw. LNA (z ang. locked nucleic acids) przed specyficznym nukleotydem na końcu 3
Jakie są wyniki nasze i innych laboratoriów? Czułość i swoistość kliniczna wykrywania genów płodu w cff-dna według publikowanych danych Wykry wany gen SRY Publikacja/ Liczba przypadków Metaanaliza 57 publikacji / 7 000 Czułość % (przedział ufności dla 95%) 99.9 (99.7 100%) Swoistość (przedział ufności 95%) 94.9% (93.5 96.4) RHD Wielka Brytania/ 1997 99.8 99.2 Francja / 300+ 283 100 97.5-100 Belgia / 563 100 99.5 Polska / 230 100 99.6* * u jednej ciężarnej z płodem RhD- nie wykryliśmy genu RHD, ale nie potwierdziliśmy obecności cff-dna, gdyż nie znaleźliśmy markera obecnego u ojca, a nieobecnego u matki
Rutynowo przeprowadzana diagnostyka nieinwazyjna w konfliktach serologicznych w IHiT RhD u 348/348 kobiet prawidłowo oznaczono RhD płodu: Rhc u 260 płód RHD(+) u 88 płód RHD(-): u 51 gen SRY (chłopcy), u 36 marker ins/del po ojcu, w 1 przypadku brak markera od ojca (87/88 wydano wynik) u 22/22 kobiet prawidłowo oznaczono Rhc płodu: RhE u 16 płód RHCE*c (+) u 6 płód RHCE*c (-) u 21/21 kobiet prawidłowo oznaczono RhE płodu: u 14 płód RHCE*E (+) u 7 płód RHCE*E (-)
Badania nieinwazyjne allelu KEL*1 minimalizacja ryzyka fałszywej amplifikacji przez stosowanie zmodyfikowanych starterów o podwyższonej swoistości, tzw. LNA (locked nucleic acids) Finning i wsp. 2008: prawidłowe wyniki u 43 kobiet, które urodziły dzieci K- 1/27 wynik fałszywie ujemny u kobiet z przeciwciałami anty-k, które urodziły dziecko K+ IHiT pilotażowe badania DNA z osocza 11ciężarnych K- u 5 potwierdzone prawidłowe wyniki: u 3 urodziły się K+ dzieci, u 2 K- poziom wykrywanego allelu KEL*1 o 3-4- krotnie niższy od genu RHD
Projekt masowych badań RHD płodu do kwalifikacji do podania anty-d Przy masowych badaniach automatyzacja zmniejszenie kosztów
Koszty immunoprofilaktyki w czasie ciąży i ich organiczenie po wprowadzeniu oznaczania RHD płodu w Holandii Obecnie stosowany schemat: Ig dla kobiet Rh ujemnych, które nie maja dzieci (14 000 ) koszt 3.1mln Euro Wprowadzenie badań RHD w ciąży i podawanie Ig tylko gdy płód jest Rh+ koszt razem z badaniami 3 mln Euro Objęcie wszystkich kobiet podawaniem Ig w ciąży (34 000) koszt 6.6 mln Euro Po włączeniu nieinwazyjnych badań RHD płodu 3.9 mln Euro Van der Schoot, 2009
Co wymaga ulepszenia? Potencjalne metody udoskonalenia nieinwazyjnych badań prenatalnych Rozdzielenie cff-dna od DNA matki na podstawie: wielkości cff-dna <300bp DNA matczyne >500bp różnic w budowie białek histonowych (cff-dna z H3.1, DNA matczyne z H3.3) Opracowanie uniwersalnej kontroli cff-dna różnice w metyzacji cff-dna
Podziękowania Wszystkim lekarzom i diagnostom laboratoryjnym, którzy współpracują z IHiT dla udoskonalania nieinwazyjnej diagnostyki płodu i kobietom ciężarnym, które wyrażają zgodę na pobranie krwi i udostępniają dane o grupie krwi urodzonego noworodka składa zespół Pracowni Biologii Molekularnej Zakładu Immunologii Hematologicznej i Transfuzjologicznej w składzie: dr Katarzyna Guz, dr Agnieszka Orzińska, mgr Justyna Smolarczyk-Wodzyńska, mgr Magdalena Łakomy, prof. Ewa Brojer, prof. Barbara Żupańska Tylko z Państwa pomocą możemy kontynuować badania!
Zakład Immunologii Hematologicznej i Transfuzjologicznej IHiT Kierownik: Prof. dr hab. Ewa Brojer ebrojer@ihit.waw.pl tel. (22)34 96 611 Pracownia Biologii Molekularnej: dr Katarzyna Guz kguz@ihit.waw.pl dr Agnieszka Orzińska orzińska@ihit.waw.pl tel. 022 34 96 600 wew. 144, 154