INSTYTUT BADAWCZY LEŚNICTWA Zakład Hodowli Lasu i Genetyki Drzew Leśnych SYNTEZA

INSTYTUT BADAWCZY LEŚNICTWA Zakład Hodowli Lasu i Genetyki Drzew Leśnych SYNTEZA Temat: 361/10Wn50/NE-PR-Tx/D Tytuł tematu: Określenie zmienności genetycznej europejskich i azjatyckich populacji sosny zwyczajnej (Pinus sylvestris L.) na podstawie analiz DNA Główny autor: Współautorzy: prof. nadzw. dr hab. Justyna Nowakowska mgr Jurata Buchovska WYKONANO NA ZAMÓWIENIE MINISTRA ŚRODOWISKA SFINANSOWANO ZE ŚRODKÓW NARODOWEGO FUNDUSZU OCHRONY ŚRODOWISKA I GOSPODARKI WODNEJ Kierownik Zakładu Dyrektor Instytutu Sękocin Stary, październik 2010

Spis treści 1. Wstęp. 3 2. Cel pracy.. 3 3. Zakres pracy.. 4 4. Metodyka pracy.. 4 5. Wyniki pracy 5 5.1. Analizy laboratoryjne polimorfizmu DNA 5 5.2. Genotypowanie populacji... 5 5.3. Statystyczna analiza otrzymanych wyników 5 6. Podsumowanie... 6 7. Literatura... 7 2

1. Wstęp Identyfikacja pojedynczych organizmów oraz populacji jest możliwa dzięki różnicom w budowie kwasu dezoksyrybonukleinowego (DNA). Zmienność ta, inaczej polimorfizm, może być charakterystyczna dla różnych populacji osobników danego gatunku (zmienność międzypopulacyjna) lub nawet dla pojedynczych osobników w obrębie populacji (zmienność wewnątrzpopulacyjna). Ustalenie tożsamości genetycznej materiału biologicznego i określenie jego filogenezy opiera się na badaniu markerów genetycznych. Markery genetyczne są prostymi cechami jakościowymi, które pozwalają na identyfikację genotypu danego organizmu (Hamrick et al. 1992). Markery DNA mitochondrialnego wykorzystywane są przede wszystkim w badaniach struktury genetycznej populacji oraz odtworzenia dróg migracji polodowcowej fauny i flory (Petit et al. 2002, Nowakowska 2006, 2007). Technika mikrosatelitarnego DNA (SSR) jest od około dziesięciu lat najprecyzyjniejszym narzędziem badawczym w genotypowaniu drzew leśnych (Newton et al. 1999, Primack et al. 1998). Jak dotąd, dane na temat struktury genetycznej populacji sosnowych w Europie i Azji są słabo poznane. Praca uzupełnia tę lukę i wnosi nową wiedzę na temat naturalnych zasobów genowych Pinus sylvestris w Europie i Azji. Prezentowane wyniki badań wpisują się w wieloletnią współpracę naukową między Zakładem Hodowli Genetyki Drzew Leśnych IBL i Litewskim Instytutem Badawczym w Kownie, dotyczącą zmienności genetycznej sosny zwyczajnej na podstawie polimorfizmu DNA. 2. Cel pracy Celem badań było określenie stopnia zróżnicowania genetycznego wewnątrz- i międzypopulacyjnego, analiza podobieństwa genetycznego oraz opracowanie map haplotypów dla sosny zwyczajnej w zasięgu euroazjatyckim, przy zastosowaniu ośmiu loci mikrosatelitarnego DNA chloroplastowego. 3

3. Zakres pracy Materiał badawczy obejmował 54 populacje P. sylvestris L., których liczebność wahała się od 3 do 10 drzew. Łącznie, analizami objęto 32 populacje sosny zwyczajnej z krajów europejskich oraz 32 populacje z Rosji. Razem przeanalizowano 522 drzewa, z których stażystka przywiozła wyizolowane DNA z igieł, z populacji pochodzących z różnych powierzchni doświadczalnych na terenie Litwy. W pracy przedstawiono ocenę struktury genetycznej wybranych europejskich, w tym litewskich, czeskich, polskich, niemieckich, szwedzkich i angielskich oraz azjatyckich populacji sosny zwyczajnej, na podstawie markerów molekularnych. 4. Metodyka pracy W ramach pracy wykonano następujące zadania: 1. Analizy laboratoryjne związane z ekstrakcją DNA i badaniem naturalnych populacji sosnowych przy użyciu markerów molekularnych, a mianowicie sześciu chloroplastowych loci mikrosatelitarnego DNA. 2. Genotypowanie populacji za pomocą nowoczesnej aparatury badawczej, która znajduje się w Zakładzie Hodowli Lasu i Genetyki Drzew Leśnych, m.in.: na automatycznym sekwenatorze Beckman Coulter CEQ TM 8000 i elektroforezie chipowej BioAnalyser (Agilent, USA), oraz nauka obsługi programów komputerowych takich, jak Pop Gen 32, BIO-RAD GelDoc 1000 i 2100 Expert DNA 1000 (BioAnalyser, Agilent Technologies ).. 3. Statystyczna analiza otrzymanych wyników za pomocą programu Pop Gen v. 3.2 (Yeh i Boyle 1997). Wynikiem obliczeń następujące wartości statystyczne: częstość alleli, procent loci polimorficznych, heterozygotyczność oczekiwana i obserwowana, zróżnicowanie genetyczne wyrażone indeksem Shannona, oraz dendrogramy podobieństwa genetycznego. 4

5. Wyniki pracy 5.1 Analizy laboratoryjne polimorfizmu DNA Otrzymane preparaty DNA pochodzące z igieł sosny były dobrej jakości, czyli były pozbawione zanieczyszczeń kwasami nukleinowymi i białkowymi. 5.2. Genotypowanie populacji Badane loci były polimorficzne, gdyż statystyczna analiza wyników dla wszystkich populacji ujawniła 100% polimorfizmu między badanymi fragmentami DNA, przy przyjęciu poziomu istotności p < 0,05.. 5.3. Statystyczna analiza otrzymanych wyników Na podstawie uzyskanych wyników stwierdzono, że średnia zmienność wewnątrzpopulacyjna w populacjach europejskich była nieco większa (H S = 0,502) niż w populacjach azjatyckich (H S = 0,477). Podobnie, całkowita zmienność międzypopulacyjna była większa dla krajów europejskich (H T = 0,654) niż dla Rosji (H T = 0,632). Współczynnik zróżnicowania genetycznego, odzwierciedlającego różnice w strukturze genotypów pomiędzy populacjami był prawie na tam samym poziomie dla drzewostanów sosnowych z Europy (G ST = 0,233) oraz z Rosji (G ST = 0,244). Obliczenia dystansów genetycznych wskazały na obecność dwóch głównych grup populacji spokrewnionych genetycznie w Europie, oraz pięciu grup populacji o dużym pokrewieństwie genetycznym w rosyjskiej części Azji. Rozmieszczenie geograficzne dla większości grup genotypów sosny zwyczajnej, wyodrębnionych w dendrogramach dystansu genetycznego Nei (1987) było mozaikowate, tym niemniej odnotowano zgrupowania populacji sosnowych o podobnych genotypach w środkowej i wschodniej Europie oraz w północno-zachodniej i południowo-zachodniej Rosji. Na podstawie analogii z udokumentowanymi drogami migracji polodowcowej dla innych gatunków lasotwórczych w Europie można przypuszczać, że główne refugia sosny zwyczajnej usytuowane były na Półwyspie Bałkańskim i Apenińskim oraz Środkowej Rosji. 5

6. Podsumowanie: Powyższe badania wskazują na przydatność techniki mikrosatelitarnego DNA w celu określenia zmienności badanych populacji sosny zwyczajnej na poziomie DNA. Na podstawie uzyskanych wyników badań z 54 populacji P. sylvestris L. można stwierdzić, że: 1. Średnie zróżnicowanie wewnątrzpopulacyjne dla krajów europejskich było większe H S = 0,502 niż dla Rosji H S = 0,477. 2. Całkowita zmienność międzypopulacyjna była nieco większa dla krajów europejskich (H T = 0,654) niż dla Rosji (H T = 0,632). 3. Nieco większe parametry zmienności genetycznej obserwowane w europejskich populacjach sosny zwyczajnej, w porównaniu do populacji azjatyckich, odzwierciedlają prawdopodobnie większy wpływ gospodarki człowieka na ekosystemy leśne w Europie w przeszłości. 4. Współczynnik zmienności międzypopulacyjnej był większy dla Rosji G ST = 24,4%, w porównaniu do populacji z krajów europejskich G ST = 23,3%, co potwierdzają ogólne badania zmienności genetycznej podstawowych gatunków drzew leśnych. 5. Dendrogram podobieństwa genetycznego dla populacjami z Europy, wykazał istnienie 2 głównych grup zbliżonych filogenetycznie, oddalonych dużym dystansem genetycznym D = 0,421. 6. Obliczenia dystansów genetycznych między populacjami z Rosji, wyodrębniły 5 grup zbliżonych filogenetycznie, oddalonych dużym dystansem genetycznym D = 0,745. Największy dystans dzielił populację Krasnojarsk od pozostałych populacji z Rosji. 7. Rozmieszczenie geograficzne większości grup genotypów sosny zwyczajnej, wyodrębnionych w dendrogramach podobieństwa genetycznego było mozaikowate, tym niemniej odnotowano zgrupowania populacji sosnowych o podobnych genotypach w środkowej i wschodniej Europie oraz w północnozachodniej i południowo-zachodniej Rosji. 6

7. Literatura Hamrick J. L., Godt M. J. W., Sherman-Broyles S. L. 1992. Factors influencing levels of genetic diversity in woody plant species. New Forests, 6: 95-124. Nei M. 1987. Molecular evolutionary genetics. Columbia University Press, New York. Newton A. C., Allnutt T. R., Gillies A. C. M., Lowe A. J., Ennos R. A. 1999. Molecular phylogeography, intraspecific variation and the conservation of tree species. Tree, 14(4): 140-141. Nowakowska J. A. 2006. Zastosowanie markerów DNA (RAPD, SSR, PCR-RFLP I STS) w genetyce drzew leśnych, entomologii, fitopatologii i łowiectwie. Leś. Pr. Bad., 1: 73-101. Nowakowska J. A. 2007. Zmienność genetyczna polskich wybranych populacji sosny zwyczajnej (Pinus sylvestris L.) na podstawie analiz polimorfizmu DNA. Rozpr. Habi., IBL Warszawa 2007, ISBN 978-83-878647-70-4, ss. 118. Petit R. J., Latouche-Hallé C., Pemonge M. H., Kremer A. 2002. Chloroplast DNA variation of oaks in France and the influence of forest fragmentation on genetic diversity. For. Ecol. Managm., 156: 115-129. Primack R. B. 1998. Essentials of conservation biology. Sunderland, Massachusetts, USA, Sinauer Associates Publishers, str. 660. Yeh F. C., Boyle T. J. B. 1997. Population genetic analysis of co-dominant and dominant markers and quantitative traits. Belgian J. Bot., 129: 157. 7

Instytut Badawczy Leśnictwa Zakład Hodowli Lasu i Genetyki Drzew Leśnych SPRAWOZDANIE z realizacji zadania pt. OKREŚLENIE ZMIENNOŚCI GENETYCZNEJ EUROPEJSKICH I AZJATYCKICH POPULACJI SOSNY ZWYCZAJNEJ PINUS SYLVESTRIS L. NA PODSTAWIE ANALIZ DNA NR. UMOWY: 361/10Wn50/NE-PR-Tx/D Okres realizacji zadania: 01.08 31.10.2010 r. Kierownik zadania: prof. nadzw. dr hab. Justyna Nowakowska Stypendystka: mgr Jurata Buchovska Lithuanian Forest Research Institute, Kaunas, Litwa Kierownik Zakładu Dyrektor Instytutu Sękocin Stary, październik 2010 r.

SPIS TREŚCI I. WPROWADZENIE.. 3 II. MATERIAŁ I METODY... 5 1. Wprowadzenie... 5 2. Materiał badawczy. 5 3.Metody 5 3.1. Ekstrakcja DNA genomowego.... 5 3.2. Ocena ilości i jakości otrzymanego DNA... 6 II a. Analiza mikrosatelitarna chloroplastowego (cp) DNA.... 6 1. Dobór odpowiednich starterów i optymalizacja reakcji PCR 6 2. Reakcje PCR mikrosatelitarnego DNA.. 6 3. Analiza komputerowa polimorfizmu DNA 7 II b. Analiza mitochondrialnego DNA.... 7 1. Dobór odpowiednich starterów i optymalizacja reakcji PCR 7 2. Reakcja PCR dla mtdna... 7 3. Analiza polimorfizmu DNA... 8 3.1. Statystyczna analiza danych 8 III. WYNIKI.. 9 1. Izolacja DNA. 9 III a. Analiza mikrosatelitarna (SSR) chloroplastowego (cp) DNA....... 9 1. Ocena zróżnicowania genetycznego badanych populacji sosny zwyczajnej. 9 1.1. Populacje sosny zwyczajnej z krajów europejskich... 9 1.2. Populacje sosnowe z Rosji... 10 III b. Analiza mitochondrialnego (mt) DNA... 12 IV. WNIOSKI 13 V. PODSUMOWANIE 14 VI. LITERATURA 15 VII. TABELE.. 17 VIII. RYCINY. 27 IX. ZAŁĄCZNIKI. 33 1. Maszynopis artykułu: Lasy na Litwie 33 2. Certyfikat... 38 2

I. WPROWADZENIE Zróżnicowanie genetyczne ma kluczowe znaczenie w utrzymaniu równowagi ekologicznej danej populacji (Barbault 1997). Identyfikacja organizmów lub ich populacji jest możliwa dzięki różnicom w budowie kwasu deoksyrybonukleinowego (DNA). Zróżnicowanie to, inaczej polimorfizm, jest charakterystyczne zarówno dla grup populacji (zmienność międzypopulacyjna), jak i dla pojedynczych populacji (zmienność wewnątrzpopulacyjna). Genetyczna zmienność drzew jest podstawą do zachowania zróżnicowania puli genowej populacji, definiuje potencjał reprodukcyjny gatunku i jego odporność wobec czynników chorobotwórczych oraz określa zdolność adaptacyjną gatunku do zmiennych warunków klimatu (Primack 1998). Ustalenie tożsamości genetycznej materiału biologicznego i określenie jego filogenezy opiera się na badaniu markerów genetycznych. Markerami genetycznymi określamy fragmenty DNA lub RNA, które identyfikują różnice w budowie genomu między organizmami. Obecnie rozpoznano wiele różnych markerów DNA, które umożliwiają badanie kodu genetycznego w DNA jądrowym, mitochondrialnym i chloroplastowym. W zależności od rodzaju danego markera, cechuje go mniejsza lub większa przydatność w praktyce leśnej i markery molekularne znajdują szerokie zastosowanie w identyfikacji różnic genetycznych między drzewami oraz między drzewostanami. Drzewa należą do długowiecznych gatunków, które w trakcie ewolucji wytworzyły najwyższy znany dotąd poziom zmienności genomu w obrębie populacji (Arbrez 1994, Hamrick et al. 1992). Po ostatnim zlodowaceniu, ok. 18 000 lat p.n.e., tereny północnej półkuli zasiedlały na nowo gatunki drzew leśnych z czterech głównych refugiów polodowcowych, położonych na Półwyspach Iberyjskim, Apenińskim i Bałkańskim, oraz w centralnej Rosji. Populacje, które zasiedlały Europę posiadały w związku z tym zbliżony stopień podobieństwa genetycznego do puli macierzystej z refugium, zaś dalsze zmiany adaptacyjne prowadziły do zwiększenia zróżnicowania na poziomie osobniczym (Kremer 1994). Przedmiotem niniejszych badań jest sosna zwyczajna (Pinus sylvestris L.) powszechnie uznawana za gatunek o największym zasięgu naturalnym w Azji i Europie. Sosna zwyczajna stanowi ważny element ekosystemów leśnych pod względem ekologicznym i krajobrazowym. Gatunek ten należy do klasy Coniferopsida, rodziny Pinaceae i rodzaju Pinus. Rodzaj Pinus, w 3

którym wyróżnia się blisko 90 gatunków, należy do odrębnej podrodziny Pinoideae. Z wyjątkiem fazy juwenilnej, charakteryzuje się osadzeniem igieł wyłącznie na krótkopędach (Rushforth 1987). Sosna zwyczajna osiąga średnią wysokość 30 metrów i ma igliwie o podwójnych szpilkach, prostą strzałę oraz luźną koronę, która przekształca się ze stożkowatej w okresie młodocianym w rozłożystą i szczytową w wieku dorosłym. U młodych osobników gałęzie boczne wyrastają na całej długości pnia, podczas gdy u starszych drzew strzała jest oczyszczona i przybiera charakterystyczne ceglaste zabarwienie kory w górnych partiach. Przepływ genów w populacjach drzew jest badany głównie na podstawie markerów chloroplastowego i mitochondrialnego DNA. U drzew iglastych chloroplasty przekazywane są potomstwu przez pyłek drzewa ojcowskiego, mitochondria zaś przez drzewo mateczne (Newton et al. 1999, Hamrick 2004). Markery mikrosatelitarne (SSR) dotyczą wybranych, wysoce polimorficznych regionów genomu i stanowią obecnie najprecyzyjniejsze narzędzie badawcze stosowane w celu określenia stopnia zmienności genetycznej badanych osobników (Robledo-Arnuncio et al. 2004, Nowakowska 2005). Dużą zaletą markerów mikrosatelitarnych jest bardzo wysoki stopień wykrywania zmian strukturalnych na poziomie pojedynczych nukleotydów oraz dziedziczenie kodominujące. Dodatkowym atutem markerów SSR jest możliwość szybkich analiz, najczęściej wykonywanych w automatycznym sekwenatorze. Zadanie Określenie zmienności genetycznej europejskich i azjatyckich populacji sosny zwyczajnej (Pinus sylvestris L.) na podstawie analiz DNA realizowane było w Zakładzie Hodowli Lasu i Genetyki Drzew Leśnych Instytutu Badawczego Leśnictwa w okresie od 1 sierpnia do 31 października 2010 r. Projekt obejmował analizę zmienności genetycznej azjatyckich i europejskich wybranych populacji sosny zwyczajnej, przeprowadzoną w ramach stażu przez mgr Juratę Buchovską z Litewskiego Instytutu Badawczego Leśnictwa w Girionys, Kowno. Stażystce zaprezentowano problematykę związaną z prowadzonymi w Zakładzie badaniami nad zmiennością genetyczną sosny zwyczajnej, tak że uczestniczyła w realizacji wszystkich prac związanych z chloroplastowym (cp) DNA i mitochondrialnym (mt) DNA. 4

II. MATERIAŁ I METODY 1. Wprowadzenie Identyfikacja pojedynczych organizmów oraz populacji jest możliwa dzięki różnicom w budowie kwasu dezoksyrybonukleinowego (DNA). Zmienność ta, inaczej polimorfizm, może być charakterystyczna dla różnych populacji osobników danego gatunku (zmienność międzypopulacyjna) lub nawet dla pojedynczych osobników w obrębie populacji (zmienność wewnątrzpopulacyjna). Ustalenie tożsamości genetycznej materiału biologicznego i określenie jego filogenezy opiera się na badaniu markerów genetycznych. Markery genetyczne są prostymi cechami jakościowymi, które pozwalają na identyfikację genotypu danego organizmu. Markery DNA mitochondrialnego wykorzystywane są przede wszystkim w badaniach struktury genetycznej populacji oraz odtworzenia dróg migracji polodowcowej fauny i flory (Petit et al. 2002, Nowakowska 2006). Technika mikrosatelitarna (SSR) jest od około dziesięciu lat najprecyzyjniejszym narzędziem badawczym w genotypowaniu drzew leśnych. 2. Materiał badawczy Materiał badawczy stanowiły populacje sosny zwyczajnej (Pinus sylvestris L.), z 54 populacji pochodzących z różnych powierzchni doświadczalnych na terenie Litwy. Pochodzenie tych populacji i dane geograficzne przedstawiono w Tabelach 1 i 2. 3. Metody 3.1. Ekstrakcja DNA genomowego Zamrożone igły sosny zwyczajnej ucierano w ciekłym azocie (temp. 196 0 C) i poddawano ekstrakcji DNA za pomocą zestawów Genomic DNA Purification Kid # K0512 (UAB Fermentas, Litwa). 5

Następnie, dla każdego pochodzenia badano wydajność ekstrakcji za pomocą migracji elektroforetycznej w 1% żelu agarozowym, po barwieniu bromkiem etydyny. Otrzymane ilości genomowego DNA analizowano za pomocą skanera używając programu Gel Doc TM 2000 (Bio - Rad) i przedstawiono w ng/µl otrzymanego DNA w każdej próbie. 3.2. Ocena ilości i jakości otrzymanego DNA Oceny jakościowej i ilościowej otrzymanego DNA dokonywano przy pomocy elektroforezy w 1% żelu agarozowym w buforze 1% TBE oraz w oparciu o spektrofotometryczny pomiar absorpcji fali świetlnej przy długościach 260 i 280 nm. Analizy prowadzono na spektrofotometrze Nano-Drop ND 1000 Full spectrum UV Spectrophotometr (Ryc. 1). II a. Analiza mikrosatelitarna chloroplastowego DNA 1. Dobór odpowiednich starterów i optymalizacja reakcji PCR Polimorfizm DNA był badany na podstawie mikrosatelitarnego DNA. Przeprowadzono serię doświadczeń, mających na celu opracowanie optymalnych warunków dla namnażania DNA sosny zwyczajnej w reakcji PCR. W celu zbadania polimorfizmu DNA mikrosatelitarnego sosny zwyczajnej przetestowano 8 loci dla (Pinus sylvestris L.): Pt 87314, Pt 30204, Pt 71936, PCP 30277, PCP 36567, PCP 45071, PCP 71987, PCP 87314 (Tabela 3). 2. Reakcje PCR mikrosatelitarnego DNA Dla loci PCP reakcję przeprowadzono w termocyklerach Professional BASIC GRADIENT, Biometra i PTC-200 Peltier Thermal Cycer, MJ Research. Każdy locus powielano w 18µl mieszaniny reakcyjnej (TAQ PCR CORE KIT 1000, QIAGEN) (Tabela 5) i 50 ng matrycy DNA. Mieszaninę umieszczano w termocylkerze, zaprogramowanym na 25 cykli amplifikacji (Tabela 6). 6

3. Analiza komputerowa polimorfizmu DNA Amplifikacja była sprawdzana metodą elektroforezy agarozowej. Produkty amplifikacji rozdzielono w 1,5% żelu agarozowym (Agaroze Prona) pod napięciem 74 V i otrzymane fragmenty wizualizowano wybarwiając je barwnikiem Nancy 520 (Sigma). Produkty były zapisywane przy użyciu programu do dokumentacji żeli Quantity One 4.3.1 (BIO-RAD Gel Doc 2000). Analiza otrzymanych profili genetycznych była przeprowadzona w automatycznym sekwenatorze CEQ TM 8000 (Beckman Coulter) za pomocą oprogramowania CEQ TM 8000 Genetic Analysis System. II b. Analiza mitochondrialnego DNA 1. Dobór odpowiednich starterów i optymalizacja reakcji PCR Dla ustalenia reakcji pomiędzy 22 populacjami sosny zwyczajnej krajów europejskich i 32 populacjami Rosji, zastosowano analizę mtdna. W celu zidentyfikowania polimorficznych fragmentów DNA, przetestowano 1 locus (Tabela 2). Przeprowadzono serię doświadczeń, mających na celu opracowanie optymalnych warunków dla namnażania DNA sosny zwyczajnej w reakcji PCR. W celu zbadania polimorfizmu DNA sosny zwyczajnej przetestowano locus nad 7 1 (Tabela 4). 2. Reakcja PCR dla mtdna W dalszym etapie badań przeprowadzono analizy zmienności genetycznej na podstawie reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) ze starterami genetycznymi nad 7-1 (Tabela 4). Zawartość DNA genomowego, oszacowano dla każdego drzewa. Przygotowywano każdorazowo 22 µl następującej mieszaniny reakcyjnej dla każdego badanego osobnika: DNA matrycy 50 ng; bufor reakcyjny 1,5 mm; dntp 0,1 mm; MgCl 2 1,5 mm; starter nad 7 FW 0,1 µm; Nad 7-1 REW 0,1 µm; Taq polimeraza 0,125 U. Mieszaninę umieszczano w termocyklerze PTC-200 Peltier Thermal Cycer, MJ Research, zaprogramowanym na 35 cykli amplifikacji DNA: 7

1. 94 0 C - 2 min. - początkowa denaturacja 2. 94 0 C 30 sek. - denaturacja 3. 55 0 C 30 sek. - przyłączanie starterów 4. 72 0 C 1 min. - wydłużanie 5. 72 0 C 10 min. - końcowe wydłużanie fragmentów. 3. Analiza polimorfizmu mtdna Do ustalenia polimorfizmu w locus nad 7-1, użyto enzymów restrykcyjnych: MBO I i RSA I (Fermentas) i trawiono w temperaturze + 37 0 C od 2 do 24 godzin. Otrzymane fragmenty DNA po trawieniu, analizowano przy pomocy elektroforezy chipowej w aparacie Bioanalyzer, stosując odczynniki Agilent DNA 1000 Regents. 3.1. Statystyczna analiza danych Do obliczeń statystycznych brano pod uwagę jedynie wyraźne, polimorficzne prążki DNA. Częstość występowania poszczególnych alleli oraz obliczenia parametrów genetycznych populacji wykonano w programie Pop Gen v. 3.2 (Yeh i Boyle 1997). Program Pop Gen 3.2. przeznaczony jest do analizy zróżnicowania genetycznego pomiędzy i wewnątrz populacji z użyciem szerokiej gamy markerów genetycznych, w tym także markerów kodominujących, takich jak markery SSR. Pozwala on obliczyć następujące wartości statystyczne: częstość alleli, procent loci polimorficznych i zróżnicowanie genetyczne wyrażone indeksem Shannona. Dodatkowo, w oparciu o analizę dystansu genetycznego (Nei 1987), program generuje dendrogramy podobieństwa genetycznego. 8

III. WYNIKI 1. Izolacja DNA Otrzymane preparaty DNA pochodzące z igieł sosny były dobrej jakości, o czym świadczą uzyskane wartości absorbancji na przykładzie populacji Amur (Ryc. 1). Wolne od zanieczyszczeń dwuniciowe DNA ma wartość współczynnika 260/280 równą 1,8. Preparat DNA, którego wartość współczynnika absorbancji jest większa niż 1,8 może być zanieczyszczony RNA, jeśli wartość ta jest mniejsza - zanieczyszczony białkami. III a. Analiza mikrosatelitarna (SSR) chloroplastowego (cp) DNA 1. Ocena zróżnicowania genetycznego badanych populacji sosny zwyczajnej Badane loci były polimorficzne, gdyż statystyczna analiza wyników dla wszystkich populacji ujawniła 100% polimorfizmu między badanymi fragmentami DNA, przy przyjęciu poziomu istotności p < 0,05. 1.1. Populacje sosny zwyczajnej z krajów europejskich Największy procent polimorficznych loci w krajach europejskich wykryto u 7 pochodzeń: Gardin, Rovno, Kijew, Sumsk, Litwa, Szkocja, Labanor (100%) a najniższy dla pochodzenia Estonia i Łotwa (62,50%) (Tabela 7). Dane zostały odzwierciedlone w najniższych i najwyższych wartościach: średniej obserwowanej i oczekiwanej liczbie alleli, współczynnika Shannona oraz współczynnika zmienności wewnątrzpopulacyjnej (h) który jest najmniejszy dla populacji Łotwa 0,347 a największy dla populacji Litwa i wynosi 0,606 (Tabela 7). Średnia obserwowana liczba alleli dla wszystkich populacji wynosi n a = 4,625. Średnia oczekiwana liczba alleli wynosi dla wszystkich populacji n e = 3,097. Średni indeks Shannona dla wszystkich populacji wynosił I = 1,220. Średni współczynnik zmienności wewnątrzpopulacyjnej dla pochodzeń krajów europejskich wynosił H S = 0,502. Współczynnik zmienności międzypopulacyjnej miał wartość H T = 0,654. Porównanie zmienności 9

międzypopulacyjnej w stosunku do zmienności całkowitej dla analizowanych pochodzeń sosny zwyczajnej wynosiło G ST = 23,3%. Analiza odległości genetycznych na podstawie metody UPGMA wykazała, iż najmniej pokrewnymi pochodzeniami są populacje z Polski i Estonii, gdyż dzieli je największy dystans genetyczny wg Nei (1987) D = 0,421 (Tabela 9). Najmniejszy dystans genetyczny dzieli pochodzenia Visakio Ruda (LT) i Germania D = -0,004 (Tabela 9). Dane te znalazły potwierdzenie w dendrogramie odległości genetycznych wg Nei i Li (1978), otrzymanym w programie Pop Gen 32. Dendrogram dystansów genetycznych (Ryc. 3) wyróżnił 2 główne grupy populacji, podzielonych na mniejsze podgrupy, składające się z kilku populacji: 1 grupa: Estonia, Szkocja i Magiliow (oznaczone czerwonym kółkiem, Ryc. 4) 2 grupa, składająca się z podgrup: 2.1. Łotwa, Finlandia, Lwów, Juodkrante (LT), Witebsk i Czerkasy (oznaczone niebieskim trójkątem, Ryc. 4) 2.2. Gardin, Kijew, Labanor (LT), Gruzja, Sumsk, Szwecja i Polska (oznaczone fioletowym kwadratem, Ryc. 4) 2.3. Rovno, Mazeikiai (LT), Czechy, Visakio Ruda (LT) i Niemcy (oznaczone brązowym rombem, Ryc. 4) 2.4. Turcja (oznaczone niebieskim pięciokątem, Ryc. 4) Grupy i podgrupy były podzielone na mniejsze jednostki populacji spokrewnionych genetycznie między sobą. Szczegółowo przedstawiono je w dendrogramie na ryc. 3, zaś pokrewieństwo genetyczne populacji - na mapie Europy (Ryc.4). 1.2. Populacje sosnowe z Rosji W Rosji, największy 100% polimorfizm wykryto u 8 pochodzeń: Smoleńsk, Kostrom, Voronez, Uljanovsk, Bashkiria, Amur, Chita i Sverdlovsk (Tabela 8), zaś najniższy 0% dla pochodzenia Krasnojarsk. Dane zostały odzwierciedlane w najniższych i najwyższych wartościach: średniej obserwowanej i oczekiwanej liczbie alleli, współczynniku Shannona oraz współczynniku zmienności wewnątrzpopulacyjnej (h) który był najmniejszy dla populacji Krasnojarsk (h = 0,000), a największy dla populacji Leningrad i wynosił h = 0,322 (Tabela 8). Średnia obserwowana liczba alleli dla wszystkich populacji wynosiła n a = 4,750. Średnia 10

oczekiwana liczba alleli dla wszystkich populacji to n e = 3,025. Wszystkie populacje z Rosji charakteryzował indeks Shannona I = 1,211 (Tabela 8). Średni współczynnik zmienności wewnątrzpopulacyjnej wynosił H S = 0,477. Współczynnik zmienności międzypopulacyjnej miał wartość H T = 0,632. Porównanie zmienności międzypopulacyjnej w stosunku do zmienności całkowitej dla analizowanych pochodzeń sosny zwyczajnej wynosiło G ST = 24,4% (Tabela 8). Badane populacje Europy i Rosji miały więc podobny poziom zróżnicowania genetycznego. Przeglądając pochodzenia z Rosji (Tabela 10), analiza odległości genetycznych na podstawie metody UPGMA wykazała, iż najmniej pokrewnymi pochodzeniami w Azji były Karelia i Krasnojarsk, gdyż dzielił je największy dystans genetyczny wg Nei (1987) D = 0,745 (Tabela 10 a i Tabela 10 b). Najmniejszy dystans genetyczny oddzielał pochodzenia Vladimir i Komi D = -0,004 (Tabela 10 a i Tabela 10 b). Dane te znalazły potwierdzenie w dendrogramie odległości genetycznych wg Nei i Li (1978), otrzymanym w programie Pop Gen 32., który wyróżnił 5 głównych grup populacji i 4 podgrupy (Ryc. 5). Podgrupy dzieliły się dodatkowo na mniejsze jednostki podobieństwa genetycznego, grupując populacje spokrewnione genetycznie między sobą. Dendrogram z populacjami z Rosji był podzielony na 5 grup. Największą grupę populacji spokrewnionych między sobą stanowiły: 1) grupa: od populacji Karelia-16 do populacji Udmurta. W obrębie tej grupy wyróżniono 4 podgrupy, zaznaczone na mapie Rosji znakami pineska. Podgrupę 1a) tworzyły populacje: Karelia 16, Novgorad, Orienburg, Vladimir, Komi, Tverj i Moskwa (oznaczone żółtym kolorem na ryc. 6). Na podgrupę 1b) składały się Kalinin, Amur, Kostrom, Chita, Voronez, Totoria, Tomsk i Chabarowsk (oznaczone pomarańczowym kolorem). Podgrupę 1c) tworzyły populacje: Smoleńsk, Swerdlowsk, Razin, Briansk, Ulianowsk i Staliningrad (oznaczone czerwonym kolorem na ryc. 6). Na podgrupę 1d) Leningrad, składały się populacje Bashkiria, Tambor, Tiumen i Udmurta (oznaczone brązowym kolorem na ryc. 6). 2. grupa: Vologda i Karelia-15 (oznaczone ciemno żółtym kolorem), 3. grupa: Archangelsk i Pskov (oznaczone jasno zielonym kolorem), 4. grupa: Krasnojarsk (oznaczona bordowym kolorem), 5. grupa: Karelia C- 17 (oznaczona ciemno zielonym kolorem, Ryc. 6), Dwie grupy złożone z pojedynczych populacji tj. Krasnojarsk i Karelia C-17, były najbardziej oddalone od pozostałych grup. 11

Rozmieszczenie geograficzne większości grup genotypów sosny zwyczajnej, wyodrębnionych w dendrogramach dystansu genetycznego było mozaikowate, tym niemniej odnotowano zgrupowania populacji sosnowych o podobnych genotypach w północnozachodniej i południowo-zachodniej Rosji. Na podstawie analogii z udokumentowanymi drogami migracji polodowcowej dla innych gatunków lasotwórczych w Europie można przypuszczać, że główne refugia sosny zwyczajnej usytuowane były na Półwyspie Bałkańskim i Apenińskim oraz Środkowej Rosji. III b. Analiza mitochondrialnego DNA Na podstawie przeprowadzonych badań mitochondrialnego DNA nie można było stwierdzić polimorfizmu, analizowanych populacji i metoda ta wymaga dodatkowych ustaleń metodycznych. 12

IV. WNIOSKI Powyższe badania wskazują na przydatność techniki mikrosatelitarnego DNA w celu określenia zmienności badanych populacji sosny zwyczajnej na poziomie DNA. Na podstawie uzyskanych wyników badań z 54 populacji P. sylvestris L. można stwierdzić, że: 1. Średnie zróżnicowanie wewnątrzpopulacyjne dla krajów europejskich jest większe H S =0,502 niż dla Rosji H S = 0,477. 2. Całkowita zmienność międzypopulacyjna jest nieco większa dla krajów europejskich (H T =0,654) niż dla Rosji (H T = 0,632). 3. Nieco większe parametry zmienności genetycznej obserwowane w europejskich populacjach sosny zwyczajnej, w porównaniu do populacji azjatyckich, odzwierciedlają prawdopodobnie większy wpływ gospodarki człowieka na ekosystemy leśne w Europie w przeszłości. 4. Współczynnik zmienności międzypopulacyjnej był większy dla Rosji G ST = 24,4%, w porównaniu do populacji z krajów europejskich G ST = 23,3%, co potwierdzają ogólne badania zmienności genetycznej podstawowych gatunków drzew leśnych. 5. Dendrogram podobieństwa genetycznego dla populacjami z Europy, wykazał istnienie 2 głównych grup zbliżonych filogenetycznie, oddalonych dużym dystansem genetycznym D = 0,421. 6. Obliczenia dystansów genetycznych między populacjami z Rosji, wykazały u wszystkich populacji istnienie 5 grup zbliżonych filogenetycznie, oddalonych dużym dystansem genetycznym D = 0,745. Największy dystans dzielił populację Krasnojarsk od pozostałych populacji z Rosji. 7. Rozmieszczenie geograficzne większości grup genotypów sosny zwyczajnej, wyodrębnionych w dendrogramach podobieństwa genetycznego było mozaikowate, tym niemniej odnotowano zgrupowania populacji sosnowych o podobnych genotypach w środkowej i wschodniej Europie oraz w północno-zachodniej i południowo-zachodniej Rosji. 13