METODY DETEKCJI I IDENTYFIKACJI BAKTERII dr n.med. Dorota Żabicka Zakład Epidemiologii i Mikrobiologii Klinicznej, Narodowy Instytut Leków, Warszawa Mikrobiologia, czyli nauka o drobnoustrojach (wirusach, bakteriach, pierwotniakach, grzybach drożdżopodobnych i pleśniowych) stanowi szeroką i niezwykle dynamicznie rozwijająca się dziedzinę wiedzy. Drobnoustroje występują we wszystkich środowiskach, kolonizując zarówno glebę i wodę, jak i organizmy żywe. Poznanie fizjologii i genetyki drobnoustrojów, ich interakcji z otaczającym środowiskiem jest niezwykle istotne zarówno dla profilaktyki zakażeń u ludzi i zwierząt, jak i dla ochrony środowiska i rozwoju wielu gałęzi przemysłu. Bakterie stanowią najliczniejszą pod względem liczby gatunków grupę wśród drobnoustrojów. Są to jednokomórkowe organizmy prokariotyczne, czyli nie posiadające jądra komórkowego. Zamiast jądra komórkowego występuje u nich zanurzony w cytoplazmie chromosom bakteryjny (nukleoid), zbudowany z jednej, koliście zamkniętej, splątanej, powiązanej z białkami cząsteczki DNA. Zewnętrzne osłony komórki bakterii stanowią: białkowo-lipidowa błona komórkowa oraz ściana komórkowa, która nadaje komórce kształt charakterystyczny dla poszczególnych gatunków bakterii (kulisty, cylindryczny lub spiralny). Niektóre z gatunków bakterii posiadają także wielocukrowe otoczki chroniące przed działaniem środowiska zewnętrznego (np. układu odpornościowego człowieka i zwierząt), pile umożliwiające przyleganie do kolonizowanych powierzchni oraz wici umożliwiające poruszanie się bakterii. Stwierdzenie obecności drobnoustrojów i ich identyfikacja w badanym materiale pobranym od zakażonego człowieka lub zwierzęcia lub też w próbce pobranej ze środowiska stanowi cel badania mikrobiologicznego. Tok badania mikrobiologicznego można podzielić na następujące etapy: pobranie materiału i jego transport do laboratorium mikrobiologicznego; badanie materiału z zastosowaniem różnych metod badawczych. Materiał pobiera się z zachowaniem zasad aseptyki, czyli w sposób zapobiegający kontaminacji próbki przez drobnoustroje z otoczenia. Pobrany materiał transportowany jest w jałowych pojemnikach lub w podłożach i buforach transportowych, odpowiednich dla rodzaju materiału oraz wykorzystywanych metod badawczych. Metody stosowane rutynowo w laboratorium mikrobiologicznym można podzielić na metody klasyczne oraz metody molekularne. Do metod klasycznych zaliczamy: badanie mikroskopowe; hodowlę i identyfikację drobnoustrojów na podstawie cech biochemicznych; oznaczanie wrażliwości wyhodowanych bakterii na antybiotyki; metody immunologiczne. 1
Metody molekularne wykorzystują różne techniki wykrywania charakterystycznych sekwencji DNA lub RNA drobnoustrojów. Obecnie do detekcji i identyfikacji bakterii coraz częściej stosowane są również nowe metody takie jak spektrometria MALDI-TOF lub metody wykorzystujące bakteriofagi. Wszystkie wymienione metody zostaną omówione w dalszej części niniejszego opracowania. BADANIE MIKROSKOPOWE Badanie mikroskopowe pozwala na stwierdzenie obecności bakterii w badanym materiale i obserwację morfologii komórek bakteryjnych. W większości przypadków badanie to stanowi tylko pierwszy etap identyfikacji drobnoustroju, ukierunkowując dalsze etapy badania mikrobiologicznego. W medycynie w niektórych przypadkach wykonanie i obejrzenie preparatu mikroskopowego jest wystarczające do identyfikacji drobnoustroju, odpowiedzialnego za wywołanie zakażenia. Dzieje się tak wtedy, gdy w materiale pobrany od chorego z określonymi objawami klinicznymi stwierdza się drobnoustroje o charakterystycznym, typowym dla nich kształcie. Przykładami tego typu zakażeń są zakażenia przenoszone drogą płciową (kiła, rzeżączka) czy zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych wywoływane przez grzyby Cryptococcus neoformans. W laboratorium mikrobiologicznym do badań mikroskopowych stosowany jest zwykle mikroskop świetlny z obiektywem immersyjnym o dużych powiększeniach (zwykle 100x) i wysokiej zdolności rozdzielczej (apertura 1,4-1,6). Najpowszechniej stosuje się preparaty barwione z zastosowaniem różnych metod barwienia. Preparaty przygotowywane są na szkiełkach mikroskopowych bezpośrednio z materiału pobranego od pacjenta zawieszonego w kropli soli fizjologicznej (0,9% roztwór NaCl) lub też w postaci rozmazu zawiesiny wyhodowanych komórek bakteryjnych w kropli soli fizjologicznej. Następnie preparaty suszy się na powietrzu i utrwala poprzez ogrzanie preparatu nad płomieniem palnika. Najczęściej stosowaną metodą barwienia jest metoda Grama, która różnicuje bakterie na dwie grupy: barwiące się fioletowo bakterie Gram-dodatnie i barwiące się różowo bakterie Gram-ujemne. Różnice barwy wynikają z różnicy w budowie ściany komórkowej obu grup bakterii. Bakterie Gramdodatnie posiadają ścianę komórkową zbudowaną z grubej warstwy peptydoglikanu (złożonego polimeru N-acetyloglukozoaminy i kwasu N-acetylomuraminowego oraz peptydowych mostków i łańcuchów bocznych) i przenikających przez peptydoglikan cząstek kwasów lipotejchojowych (LTA). Ściana komórkowa bakterii Gram-ujemnych ma bardziej złożoną strukturę. Składa się ona z cienkiej warstwy peptydoglikanu i błony zewnętrznej, połączonych mostkami utworzonymi z lipoproteiny. Petydoglikan i błona zewnętrzna oddzielone są tzw. przestrzenią periplazmatyczną. Błona zewnętrza o strukturze typowej błony białkowo-lipidowej w zewnętrznej warstwie lipidowej zawiera lipopolisacharyd (LPS) o składzie charakterystycznym dla poszczególnych gatunków bakterii Gramujemnych. Przenikanie substancji przez błonę zewnętrzną jest możliwe dzięki obecności białkowych kanałów porynowych. 2
Oprócz metody Grama powszechnie stosowanymi metodami barwienia są także metody specjalne, z zastosowaniem różnych barwników, dzięki którym uwidacznia się specyficzne struktury wewnętrzne komórki bakteryjnej (np. barwienie na obecność zarodników) oraz barwienie negatywne, gdzie tuszem barwi się powierzchnię szkiełka mikroskopowego w celu uwidocznienia otoczek bakteryjnych (preparat tuszowy). Metodą stosowaną głównie do stwierdzenia obecności drobnoustrojów bezpośrednio w materiale pobranym od pacjenta jest mikroskopia fluorescencyjna. Przygotowanie preparatów oglądanych w mikroskopie fluorescencyjnego polega na nałożeniu na utrwalony preparat roztworu przeciwciał wyznakowanych barwnikiem fluorescencyjnym, skierowanych przeciwko poszukiwanemu drobnoustrojowi, a następnie dokładnym wypłukaniu niezwiązanych z drobnoustrojami przeciwciał. Oświetlenie preparatu światłem UV wywołuje świecenie barwnika fluorescencyjnego i uwidacznia komórki o kształcie charakterystycznym dla danego gatunku jedynie wtedy, gdy nastąpiło połączenie przeciwciał z poszukiwanym drobnoustrojem Zdecydowanie rzadziej niż preparaty barwione stosuje się preparaty wilgotne, gdzie przygotowany rozmaz nakrywa się szkiełkiem nakrywkowym. Tak przygotowany preparat może być oglądany w mikroskopie kontrastowo-fazowym, który pozwala obserwować zarówno kształt jak i szczegóły struktury komórki bakteryjnej lub też w mikroskopie z ciemnym polem widzenia, gdzie lepiej widoczne są drobnoustroje o niewielkich rozmiarach i spiralnej budowie (np. krętek blady Treponema pallidum, bakteria wywołująca kiłę). Oglądanie preparatów w mikroskopie elektronowym pozwala na uwidocznienie szczegółów struktury komórek drobnoustrojów: wielkości, kształtu, obecności i wielkości pili lub wici oraz organelli wewnątrzkomórkowych, a także obserwowanie kolejnych faz podziału komórek bakteryjnych. HODOWLA I IDENTYFIKACJA DROBNOUSTROJÓW NA PODSTAWIE CECH BIOCHEMICZNYCH Hodowle drobnoustrojów prowadzi się w warunkach najbardziej odpowiednich dla wzrostu poszukiwanych drobnoustrojów. Bakterie mogą rosnąć w bardzo różnych warunkach temperatury, ph, wilgotności, ciśnienia osmotycznego i zawartości tlenu. Wzrost bakterii obserwowano w zakresie temperatur od 0 C (psychrofile) do 60 C (termofile), przy czym większość gatunków optimum wzrostu osiąga w temperaturze w zakresie 20-40 C. Dla większości gatunków optymalne jest ph neutralne, w zakresie 6,5-7,5, oraz ciśnienie osmotyczne a w ~0,99. Bakterie w zależności od zapotrzebowania na tlen można podzielić na: bakterie tlenowe, czyli rosnące dobrze w obecności tlenu w takiej ilości jak w powietrzu atmosferycznym; bakterie beztlenowe rosnące dobrze w obecności 0,5-1% tlenu; bakterie mikroaerofilne wymagające do wzrostu 5% tlenu i 10% dwutlenku węgla. 3
Wiele bakterii chorobotwórczych takich jak np. pałeczka okrężnicy Escherichia coli czy gronkowiec złocisty Staphylococcus aureus dobrze rośnie zarówno w warunkach tlenowych jak i o obniżonej, aż do warunków beztlenowych, zawartości tlenu. W zależności od gatunku drobnoustrojów hodowle prowadzi się: w organizmie wrażliwych na zakażenie zwierząt: np. krętek blady Treponema pallidum namnażany w organizmie królików; z użyciem hodowli komórkowych komórek zwierzęcych lub ludzkich: np. wirusy, niektóre bakterie namnażające się wewnątrzkomórkowo np. Chlamydophila pneumoniae; na komórkach bakteryjnych: bakteriofagi; na pożywkach płynnych lub stałych: większość bakterii chorobotwórczych, bakterie środowiskowe. Bakterie do wzrostu wymagają obecności źródła węgla w postaci CO 2 dla gatunków autotroficznych lub związków organicznych w pożywce (cukry, aminokwasy, peptydy, lipidy) dla gatunków heterotroficznych takich jak bakterie chorobotwórcze. Wszystkie gatunki bakterii wymagają także obecności w pożywce soli nieorganicznych, a często także niektórych witamin. Bakterie rozmnażają się poprzez podział komórki macierzystej na dwie komórki potomne. Czas prowadzenia hodowli do uzyskania widocznego wzrostu bakterii jest uzależniony od ich tempa namnażania i może wynosić od kilku, kilkunastu godzin jak w przypadku większości gatunków bakterii chorobotwórczych, aż do kilkunastu dni jak w przypadku prątka gruźlicy Mycobacterium tuberculosos. Zmieniającą się liczbę komórek bakterii w określonej objętości hodowli płynnej można przedstawić w postaci krzywej, gdzie po krótkiej fazie przystosowania metabolizmu komórki do nowych warunków (faza lag) następuje logarytmiczny wzrost liczby komórek bakteryjnych. Wraz z czasem i wyczerpywaniem się składników odżywczych następuje faza stacjonarna, gdzie obserwuje się równowagę liczby komórek obumierających i nowych, powstających w wyników podziałów komórkowych, a następnie faza zamierania hodowli i zmniejszania się liczby komórek bakteryjnych. Na podłożach stałych bakterie rosną w postaci kolonii, które powstają w wyniku podziałów jednej wyjściowej komórki bakteryjnej. W diagnostyce mikrobiologicznej zakażeń wywoływanych przez bakterie chorobotwórcze stosuje się kilka różnych grup stałych podłoży bakteriologicznych. Najpowszechniej stosowane są bogate podłoża wzrostowe wzbogacone krwią, zapewniające optymalne warunki do wzrostu ogromnej większości gatunków bakterii. Niektóre gatunki bakterii produkują hemolizyny powodujące lizę erytrocytów, co jest widoczne w postaci strefy przejaśnienia dookoła kolonii bakteryjnych. Oprócz podłoży wzbogaconych krwią stosuje się także bogate podłoża specjalne, takie jak podłoże Mueller-Hinton agar do oceny wrażliwości na leki, czy podłoża czekoladowe wzbogacone o składniki umożliwiające wzrost niektórych gatunków bakterii np. dwoinki zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych Neisseria meningitidis. Stosowane są także podłoża: 4
wybiórcze, zawierające składniki hamujące wzrost niektórych grup bakterii np. podłoże MacConkey agar hamujący wzrost ziarniaków Gram-dodatnich, czy też podłoża z zawartością antybiotyków hamujących wzrost bakterii wrażliwych na dany lek; podłoża chromogenne zawierające składniki, które metabolizowane przez bakterie nadają koloniom bakteryjnym określonych gatunków charakterystyczne zabarwienie, np. podłoże CPS do hodowli bakterii wywołujących zapalenie dróg moczowych i pozwalające po kolorze wstępnie zidentyfikować gatunek wywołujący zakażenie. Podłoża chromogenne z dodatkiem antybiotyków stosowane są także do badań przesiewowych w celu wykrycia chorych skolonizowanych w drogach oddechowych lub w przewodzie pokarmowym bakteriami opornymi na antybiotyki, stanowiącymi duży problem epidemiologiczny w szpitalach. Podłoża takie mają zastosowanie do wykrywania MRSA (szczepów gronkowca złocistego - Staphylococcus aureus opornych na meticylinę, co oznacza oporność na wszystkie antybiotyki - laktamowe), wykrywania VRE (opornych na wankomycynę szczepów enterokoków) oraz wykrywania szczepów pałeczek Gram-ujemnych produkujących ESBL (enzymów zdolnych do hydrolizy wielu antybiotyków -laktamowych) czy też produkujących karbapenemazy (KPC, NDM-1) rozkładające karbapenemy. Wstępna identyfikacja bakterii wyrastających na podłożach stałych polega na ocenie wielkości, kształtu i koloru kolonii, a na podłożach z krwią także obecności hemolizy. Dobór testów do identyfikacji dokonywany jest po ocenie morfologii komórek bakteryjnych w preparacie barwionym metoda Grama i przeprowadzeniu prostych testów np., zdolności do produkcji enzymu katalazy rozkładającej nadtlenek wodoru. Dokładną identyfikację do gatunku prowadzi się z zastosowaniem szeregu podłoży stałych lub płynnych w probówkach, umożliwiających wykrycie produkcji określonego enzymu (np. ureazy rozkładającej mocznik), czy też zdolności wzrostu w obecności jednego cukru (np. podłoże z laktozą do zbadania zdolności rozkładu laktozy). Obecnie do identyfikacji i oceny lekowrażliwości drobnoustrojów można również zastosować gotowe zestawy identyfikacyjne do odczytu wizualnego lub tez do odczytu w systemach automatycznych różnych producentów (np. Phoenix BD Diagnostic Systems, VITEK 2 Compact BioMerieux). OZNACZANIE WRAŻLIWOŚCI BAKTERII NA ANTYBIOTYKI W leczeniu zakażeń początkowo stosuje się tzw. terapię empiryczną, czyli dobraną zgodnie z analizą wrażliwości na proponowany lek wszystkich gatunków bakterii mogących wywołać dany typ zakażenia oraz oceną skuteczności klinicznej leczenia proponowanym antybiotykiem. Ocena lekowrażliwości bakterii wyhodowanych z materiału pobranego od pacjenta umożliwia wprowadzenie tzw. terapii celowanej, zgodnej z profilem wrażliwości na leki wyhodowanego szczepu. W laboratoriach do oznaczania lekowrażliwości stosuje się następujące metody: 5
metodę rozcieńczeniową, w której do podłoża płynnego lub stałego z antybiotykiem w określonym stężeniu dodaje się taką sama liczbę komórek bakteryjnych i ocenia wzrost w obecności antybiotyku; metodę dyfuzyjną, w której antybiotyk dyfunduje z krążka nasączonego określoną ilością leku lub z paska nasączonego gradientem antybiotyku do podłoża stałego obsianego równomiernie na powierzchni zawiesiną bakterii o znormalizowanej liczbie komórek bakteryjnych; odczyt polega na zmierzeniu średnicy strefy zahamowania wzrostu dookoła krążka lub odczycie przy jakim stężeniu antybiotyku pojawia się strefa zahamowania wzrostu dookoła paska. Odczytaną wartość stężenia antybiotyku hamującego wzrost badanych drobnoustrojów lub średnice strefy zahamowania wzrostu dookoła krążka porównuje się z wartościami granicznymi dla szczepów wrażliwych i opornych i następnie interpretację wrażliwy lub oporny wpisuje się do wyniku oznaczana lekowrazliwości badanego szczepu bakterii. W Polsce od wielu lat stosuje się wartości graniczne zgodne z rekomendacjami amerykańskimi CLSI (ang. Clinical and Laboratory Standards Institute). Od 2011 roku stosowane będą zalecenia Europejskiego Komitetu ds. Oznaczania Lekowrażliwości EUCAST (ang. European Committee for Antimicrobial Susceptibility Testing). Informacje o rekomendacjach doboru testów do oznaczania lekowrazliwości drobnoustrojów są dostępne na stronie internetowej Krajowego Ośrodka ds. Lekowrażliwości Drobnoustrojów www.korld.edu.pl, natomiast informacje o antybiotykach i leczniu na stronach Narodowego Programu Ochrony Antybiotyków www.antybiotyki.pl i stronie Konsultanta Krajowego w dziedzinie mikrobiologii lekarskiej www.mikrobiologia.pl. METODY IMMUNOLOGICZNE Metody immunologiczne wykorzystują reakcję antygenów bakteryjnych z przeciwciałami skierowanymi przeciwko tym antygenom. Reakcja zachodzi pomiędzy przeciwciałami a całymi komórkami bakteryjnymi lub antygenami powierzchniowymi (wielocukry otoczkowe, białka powierzchniowe) lub też toksynami wydzielanymi zewnątrzkomórkowo przez bakterie. W celu ułatwienia uwidocznienia zajścia reakcji immunologicznej stosowane są różnego rodzaju znaczniki przeciwciał. W metodzie mikroskopii fluorescencyjnej (opisanej wcześniej w podrozdziale Metody mikroskopowe ) znacznikiem jest barwnik fluorescencyjny. W metodzie aglutynacji lateksowej przeciwciała opłaszczone są na cząsteczkach lateksu, a połączenie przeciwciał z antygenami bakteryjnymi jest widoczne w postaci wytracających się grudek. Oznaczenie metodą aglutynacji lateksowej wykonuje się najczęściej na szkiełkach mikroskopowych, płytkach z ciemnego szkła lub specjalnych, dołączonych do zestawu powlekanych kartach. W metodach immunoenzymatycznych, określanych często skrótem EIA, przeciwciała (jeśli w materiale poszukujemy antygenów bakteryjnych) lub antygeny (jeśli poszukujemy przeciwciał w płynach ustrojowych pacjenta) znakowane są enzymem i połączenie antygenu z przeciwciałami uwidacznia się w postaci reakcji barwnej, która jest wynikiem działania enzymu związanego z kompleksem antygen-przeciwciało na 6
substrat dodany do roztworu reakcyjnego. Oznaczenia metodą immunoenzymatyczną są często wykonywane w 96-dołkowych płytkach mikrotitracyjnych, a wynik odczytywany wizualnie lub z użyciem czytników spektrofotometrycznych. W laboratoriach diagnostycznych powszechnie stosowane są systemy automatyczne różnych producentów (VIDAS BioMerieux, Architect Abbott Laboratories, różne aparaty Siemens), w których oznaczenia wykonywane są z zastosowaniem różnorodnych metod immunologicznych. Ciągle pojawiają się także nowe automatyczne systemy diagnostyczne, różniące się jedynie sposobem detekcji reakcji immunologicznej. SPEKTROMETRIA MATDI-TOF W ciągu ostatnich kilku lat spektrometria masowa typu MALD-TOF stała się metodą coraz powszechniej stosowaną w diagnostyce mikrobiologicznej. Metoda oparta jest na analizie białek występujących w dużych ilościach, takich jak białka rybosomalne i pozwala zarówno na identyfikację drobnoustrojów (bakterii, grzybów drożdżopodobnych, grzybów strzępkowych) jak i na analizę pokrewieństwa w obrębie izolatów tego samego gatunku. W laboratoriach mikrobiologicznych najczęściej obecnie stosowany jest system MALDI BioTyper firmy Bruker, który umożliwia przeprowadzenie wiarygodnej identyfikacji wyhodowanych drobnoustrojów w ciągu kilku minut dla pojedynczej próbki i ok. 1,5 godziny dla płytki z 96 próbkami. Do przeprowadzenia identyfikacji wystarczający jest materiał zawierający 10 5 komórek bakteryjnych (pojedyncza kolonia lub próbka hodowli płynnej). Pojawiły się także pierwsze doniesienia o możliwości identyfikacji drobnoustrojów bezpośrednio w próbkach moczu pobranego od pacjenta lub w próbkach hodowli krwi. Wadą metody jest jej wysoki koszt oraz brak możliwości oznaczenia wrażliwości na antybiotyki wyhodowanych drobnoustrojów. Więcej informacji o tej metodzie można znaleźć na stronie www.bruker.pl METODY MOLEKULARNE W diagnostyce mikrobiologicznej stosowana są głównie techniki pozwalające na powielanie genów bez ich klonowania, czyli oparte o technikę reakcji łańcuchowej polimerazy, w skrócie PCR: Technika PCR została opracowana w latach 80. XX wieku, ale szersze zastosowanie znalazła dopiero w drugiej połowie lat 90. Polega ona na wielokrotnym powielaniu dowolnej sekwencji DNA z wykorzystaniem starterów, czyli krótkich, o długości ok. 20 nukleotydów, cząstek DNA, których sekwencja jest komplementarna do końcowych sekwencji syntetyzowanego fragmentu DNA. Aby zapewnić prawidłowy przebieg reakcji w mieszaninie reakcyjnej oprócz matrycy, czyli powielanego DNA wyizolowanego z badanej próbki (hodowla drobnoustrojów, materiał pobrany od chorego) znajduje się nadmiar trifosforanów nukleotydów oraz nadmiar starterów reakcji. Reakcja PCR składa się z wielokrotnie (30-40 cykli) powtarzanych następujących etapów: termiczna denaturacja DNA badanego w temperaturze ok 90 C; przyłączanie starterów do matrycy w temperaturze obniżonej do 40-60 C; 7
polimerazycja, czyli synteza nowych nici DNA w temperaturze 72 C z wykorzystaniem specjalnej polimerazy termostabilnej. Każda reakcja PCR prowadzona jest równolegle dla próbek badanych oraz kontroli pozytywnej i negatywnej. Próbka mieszaniny reakcyjnej jest następnie poddawana elektroforezie w celu uwidocznienia obecności cząstek DNA o określonej wielkości, odpowiadającej wielkości fragmentu DNA pomiędzy starterami. Odmiana metody PCR, czyli PCR w czasie rzeczywistym (real-time PCR) przeprowadzana w specjalnych aparatach i z zastosowaniem odpowiednio przygotowanych starterów, nazywanych także sondami, umożliwia odczyt wyniku reakcji PCR w czasie jej przebiegu, poprzez pomiar fluorescencji próbki, która jest proporcjonalna do ilości powstałego produktu. Obie odmiany metody, czyli zarówno klasyczny PCR jak i real-time PCR stosowane są obecnie do stwierdzania obecności drobnoustrojów (bakterii, wirusów, grzybów) w badanej próbce (krew, płyn mózgowo-rdzeniowy) oraz stwierdzania obecności genów kodujących toksyny bakteryjne lub też genów kodujących istotne mechanizmy oporności na antybiotyki u wyhodowanych bakterii. Na rynku dostępne są zestawy odczynników różnych producentów umożliwiające przeprowadzenie reakcji klasycznego PCR lub w aparatach real-time PCR po izolacji DNA z badanej próbki. Wykonanie tych oznaczeń wymaga jednak odpowiedniego wyposażenia laboratorium oraz kompetentnego, przeszkolonego personelu. Ostatnio pojawiły się także zamknięte, łatwe w obsłudze i interpretacji zestawy reakcyjne do analizy w aparatach typu real-time PCR (np. GeneXpert firmy Cepheid), umożliwiające wykrycie w czasie od 1 do 2 godzin istotnych drobnoustrojów w materiale pobranym od chorego bezpośrednio przez personel w Izbie Przyjęć. Wydaje się, że do detekcji istotnych klinicznie gatunków i szczepów bakterii będą w przyszłości również stosowane mikromacierze DNA. Mikromacierz jest to płytka szklana lub plastikowa z naniesionymi w regularnym układzie fragmentami DNA stanowiącymi sondy, które w wyniku hybrydyzacji wykrywają komplementarne do siebie cząsteczki DNA lub RNA. Mikromacierze obecnie mają jednak głównie zastosowanie do badania ekspresji genów. ZASTOSOWANIE BAKTERIOFAGÓW W DETEKCJI BAKTERII Bakteriofagi są wirusami bakteryjnymi zbudowanymi z kwasów nukleinowych (DNA lub rzadko RNA) i białek. Najczęściej występujące bakteriofagi charakteryzują się złożoną strukturą, w której wyróżniamy główkę zawierającą dwuniciowy DNA oraz ogonek zakończony różnymi białkowymi strukturami receptorowymi, umożliwiającymi przyłączenie się bakteriofaga do receptorów na powierzchni komórki bakteryjnej. Bakteriofagi są z reguły wysoce specyficzne gatunkowo, a część ma zdolność przyłączania się jedynie do określonych szczepów bakteryjnych. Typowy lityczny cykl życiowy bakteriofagów składa się z następujących etapów: 1. przyłączenie bakteriofaga do receptorów na powierzchni komórki bakteryjnej; 2. wstrzyknięcie DNA do wnętrza komórki bakteryjnej, białkowy kapsyd pozostaje na zewnątrz; 8
3. replikacja DNA bakteriofaga oraz produkcja białek kapsydu, powstawanie nowych cząstek bakteriofagowych; 4. uwolnienie bakteriofagów potomnych po lizie komórki bakteryjnej. Niektóre z bakteriofagów tzw. bakteriofagi łagodne mogą przechodzić w stan lizogenii, który polega na wbudowaniu się DNA bakteriofaga do chromosomu bakteryjnego, najczęściej w ściśle określonej lokalizacji i namnażaniu się wbudowanego profaga wraz z chromosomem bakteryjnym. Profagi mogą pod wpływem różnorodnych bodźców zostać uwolnione z chromosomu bakteryjnego i przejść w cykl lityczny. Bakteriofagi łagodne w swoim DNA oprócz informacji o budowie białek wirusa mogą także zawierać geny kodujące czynniki zjadliwości bakterii, takie jak toksyny bakteryjne (np. toksyna przecinkowca cholery Vibrio cholerae, odpowiedzialna za wywoływanie wodnistej biegunki w przebiegu cholery). Bakteriofagi już w latach 50. XX wieku znalazły zastosowanie w typowaniu różnych gatunków bakterii (np. gronkowca złocistego - Staphylococcus aureus, pałeczki ropy błękitnej Pseudomonas aeruginosa) i w dochodzeniach epidemiologicznych. Do typowania stosowana jest metoda nakraplania roztworu zawierającego określoną liczbę cząstek bakteriofagów na półpłynne podłoże agarowe zawierające komórki badanego szczepu bakterii. Liza komórek bakteryjnych przez bakteriofagi widoczna jest w postaci tzw. łysinek, czyli przejaśnień hodowli bakteryjnej w miejscu nakroplenia zawiesiny bakteriofagów na powierzchnię agaru. Typowanie bakteriofagowe ze względu na dużą pracochłonność i koszty związane z koniecznością utrzymywania lizatów fagowych i szczepów kontrolnych oraz niską powtarzalność wyników, związaną z rozróżnianiem szczepów ze względu na fenotyp obecności specyficznych receptorów białkowych na powierzchni badanego szczepu bakterii, jest obecnie zastępowane przez coraz doskonalsze i szybsze metody genetyczne. Ostatnie lata przyniosły szereg publikacji donoszących o możliwości zastosowania bakteriofagów w terapii zakażeń oraz w detekcji i identyfikacji bakterii. Biorąc pod uwagę publikowane wyniki dotychczas prowadzonych eksperymentów, zastosowanie bakteriofagów w terapii wydaje się obiecujące, ale wymaga dalszych badań laboratoryjnych i klinicznych, w celu oceny bezpieczeństwa i efektywności stosowania takiej terapii. Również obiecujące i, jak się wydaję, mające większe szanse na szybkie zastosowanie w rutynowych badaniach laboratoryjnych jest wykorzystanie bakteriofagów jako składowych biosensorów wykrywających obecność drobnoustrojów w badanej próbce. W tego typu testach różnego rodzaju systemy sensoryczne (bioluminescencyjne, magnetoelastyczne, powierzchniowy rezonans plazmowy SPR, systemy optyczne) są wykorzystywane jako detektory przyłączania się obecnych w badanej próbce komórek bakteryjnych do połączonych z systemami sensorowymi bakteriofagów, specyficznych dla danego gatunku bakterii. W publikacjach prezentowano możliwość zastosowania tego typu metod do wykrywania różnych gatunków bakterii, w tym bakterii chorobotwórczych takich jak prątki gruźlicy (Mycobacterium tuberculosis), pałeczki Salmonella spp., laseczki wąglika (Bacillus anthracis) czy opornych na meticylinę szczepów gronkowca złocistego (MRSA). 9