Acta Haematologica Polonica 2008, 39, Nr 1, str

PRACA ORYGINALNA Original Article Acta Haematologica Polonica 2008, 39, Nr 1, str. 99 110 BARBARA PIEŃKOWSKA-GRELA 1, RENATA WORONIECKA 1, KAROLI- NA DOROSZUK 1, JOLANTA RYGIER 1, ANNA PASTWIŃSKA 1, BEATA GRYGALEWICZ 1, WITOLD PREJZNER 2, ANDRZEJ HELLMANN 2 Częstość delecji submikroskopowego obszaru fuzji ABL/BCR w badaniu rutynowym i przy uŝyciu sond specyficznych u pacjentów z przewlekłą białaczką szpikową Frequency of submicroscopic deletion in fused ABL/BCR region by routine diagnostic method and with specific FISH probes in patients with chronic myeloid leukemia 1 Samodzielna Pracownia Cytogenetyki, Centrum Onkologii im. M. Skłodowskiej-Curie, Warszawa 2 Katedra i Klinika Hematologii i Transplantologii Akademii Medycznej, Gdańsk STRESZCZENIE Standard diagnostyczny w CML obejmuje klasyczne badanie kariotypu wykonywane łącznie z badaniem FISH. W pracy porównano skuteczność metody FISH z uŝyciem rutynowo stosowanej sondy D-FISH BCR/ABL i sondy hybrydyzującej do genu ASS dla detekcji delecji submikroskopowego regionu w obszarze fuzji BCR/ABL. Stwierdzono, Ŝe rutynowa technika FISH przy uŝyciu sondy D-FISH BCR/ABL, stosowana równolegle z badaniem kariotypu jest wystarczająco czuła dla wykrycia tej zmiany. SŁOWA KLUCZOWE: Przewlekła białaczka szpikowa Analiza cytogenetyczna FISH SUMMARY Diagnostic standard for chronic myeloid leukemia includes both karyotype and FISH analysis. We connected the efficiency of FISH method with the use of standard D-FISH BCR/ABL and ASS gene probes for selection of CML cases with submicroscopic deletion in fused ABL/BCR region. Our data indicate that routine FISH examination with simultaneous karyotype analysis is sufficient for detection of submicroscopic deletion in fused ABL/BCR region. KEY WORDS: Chronic myeloid leukemia Cytogenetic analysis FISH WSTĘP Przewlekła białaczka szpikowa (chronic myeloid leukemia CML) charakteryzuje się obecnością aberracji chromosomowej w postaci translokacji t(9;22)(q34;q11). Rezultatem pęknięć w regionach 9q34 (locus genu ABL) i 22q11 (locus genu BCR) jest powstanie fuzyjnego genu BCR/ABL, którego produktem jest białko o aktywności kinazy tyrozynowej. Stwierdzenie obecności translokacji t(9;22) lub fuzji BCR/ABL ma

100 B. PIEŃKOWSKA-GRELA i wsp. zasadnicze znaczenie diagnostyczne, a ich brak wyklucza diagnozę przewlekłej białaczki szpikowej. W obrazie cytogenetycznym translokacja t(9;22) manifestuje się obecnością wydłuŝonego chromosomu 9 [der(9)] oraz chromosomu Philadelphia (Ph), będącego pochodną chromosomu 22 [der(22)]. W klasycznej postaci taka translokacja wzajemna występuje u 90% chorych (1, 2). Do niedawna najczęściej stosowaną metodą wykrywania obecności tej aberracji była technika klasycznej analizy prąŝkowej, a w ostatnich latach do rutynowej diagnostyki CML wprowadzona została technika fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH), co jest obecnie obowiązującym standardem (3). Początkowo stosowane sondy starszej generacji (S-FISH, od ang. single fusion signal) zostały zastąpione bardziej czułymi sondami D-FISH (ang. double fusion signal) bądź ES- FISH (ang. extra signal). Zastosowanie sond o wysokiej czułości pozwoliło wykryć obecność nietypowego znakowania FISH ujawnianego, zaleŝnie od laboratorium, u 9 30% pacjentów. W znakowaniu tym, obraz uzyskany w wyniku hybrydyzacji komórek Ph+ z sondą D-FISH, wykazuje brak jednego bądź dwóch sygnałów pochodzących z regionów BCR i/albo ABL na chromosomie 9, zaangaŝowanym w translokację [der(9)]. Analiza metafaz wykazała, Ŝe w takich przypadkach fuzji BCR/ABL na zmienionym chromosomie 22 [der(22)] towarzyszą delecje regionów, leŝących w pobliŝu punktu pęknięcia na der(9) (4 7). Szczegółowe badania molekularne wykazały, Ŝe wielkość regionów ulegających delecji moŝe wahać się od kilku kpz do kilku mpz. Minimalny region delecji na der(9), obejmuje gen ASS, leŝący w pobliŝu genu ABL lub/i gen IGLL1 przenoszony z chromosomu 22 wraz z regionem BCR (8). Zmiana taka jest aberracją submikroskopową tj. niewykrywalną technikami cytogenetyki klasycznej (G-banding, GTG). Bardzo rzadko obserwowane są przypadki, gdzie następuje utrata tak duŝych fragmentów chromosomu (powyŝej 10mpz), Ŝe aberracje te widoczne są w obrazie prąŝkowym chromosomu (9). Analiza danych klinicznych wykazała, Ŝe pacjenci będący nosicielami delecji w regionie fuzyjnym ABL/BCR są oporni na leczenie interferonem α i cechuje ich krótszy czas przeŝycia (4 7, 10). Ocena znaczenia delecji w leczeniu imatinibem nie jest jednoznaczna. Obecność tej zmiany wydaje się nie wpływać na uzyskanie remisji cytogenetycznej w pierwszym okresie leczenia, jednak późniejsze obserwacje korelują tę cechę z pojawianiem się progresji choroby czy oporności wtórnej (11, 12). Ze względu na stosunkowo krótki, dotychczasowy czas obserwacji pacjentów leczonych imatinibem nie moŝna definitywnie wypowiadać się w kwestii ewentualnego wpływu delecji na całkowity czas przeŝycia u tych pacjentów. W oparciu o dotychczas zgromadzone dane obecność delecji w regionie ABL/BCR została uznana za czynnik zagroŝenia w aktualnych wytycznych European Leukemia Net (13). Rutynowo stosowana do diagnostyki cytogenetycznej sonda D-FISH BCR/ABL, pozwala zaobserwować delecje obejmujące regiony o stosunkowo duŝej wielkości. Z tego względu załoŝono, Ŝe mogą istnieć przypadki z delecjami ograniczającymi się wyłącznie do genu ASS i pozostawiające fragment regionu genu ABL, o wielkości wystarczającej do uzyskania widocznego sygnału hybrydyzacyjnego. Takie zmiany mo-

Częstość delecji submikroskopowego obszaru fuzji ABL/BCR 101 głyby pozostać niewykrywalne w trakcie rutynowej analizy diagnostycznej. Dla wykazania częstości delecji w CML wykonano analizę FISH u 26 pacjentów z przewlekłą białaczka szpikową, stosując równolegle sondę D- FISH BCR/ABL i sondę znakującą gen ASS. MATERIAŁ I METODY Badanie cytogenetyczne przeprowadzono w grupie 26 pacjentów z potwierdzoną diagnozą przewlekłej białaczki szpikowej, w tym u trzech pacjentów - w trakcie podjętego leczenia. W badaniu wykorzystano materiał pochodzący z krótkotrwałej hodowli in vitro komórek uzyskanych z biopsji szpiku od 10 pacjentów oraz rozmazy szpiku pochodzące od 16 pacjentów. Komórki uzyskane w wyniku standardowej hodowli in vitro a takŝe rozmazy szpiku utrwalone zostały mieszaniną Carnoy a (metanol : kwas octowy lodowaty w stosunku 3:1). Klasyczną analizę prąŝkową (GTG) przeprowadzono na materiale otrzymanym w wyniku hodowli in vitro. Metafazy uzyskane w 9/10 przypadkach poddane zostały róŝnicowemu barwieniu metodą Wright a dla uzyskania wzoru prąŝkowego chromosomów. Analizowano 20 25 metafaz od kaŝdego pacjenta. Kariotypy opisano zgodnie z ISCN 2005 (14). Fluorescencyjną hybrydyzację in situ przeprowadzono na materiale z hodowli in vitro komórek szpiku (10 pacjentów) i na rozmazach szpiku (16 pacjentów). We wszystkich 26 przypadkach równolegle zastosowano dwie sondy: LSI BCR/ABL Dual Colour Dual Fusion Probe (Vysis) i LSI 9q34 Spectrum Aqua, znakującą gen ASS (Vysis) (Ryc.1). Analizowano co najmniej 200 jąder interfazowych w kaŝdym przypadku dla kaŝdej z sond. Efekt hybrydyzacji z sondą BCR/ABL, widoczny jest w typowej komórce z tą fuzją w postaci dwóch Ŝółtych sygnałów fuzyjnych (Y, ang. yellow), pochodzących ze zrearanŝowanych chromosomów 9 i 22, jednego sygnału czerwonego pochodzącego z prawidłowego chromosomu 9 (R, ang. red) oraz jednego sygnału zielonego pochodzącego z prawidłowego chromosomu 22 (G, ang. green). Tak więc wzór znakowania w przypadku typowej fuzji określany jest jako 2Y1R1G (Ryc.1). Znakowanie sondą ASS w prawidłowych komórkach ujawnia obecność dwu sygnałów niebieskich (Aq, ang. aqua), odpowiadajacym dwum kopiom genu ASS. Utrata jednego sygnału wskazuje na delecję jednej z kopii badanego genu. WYNIKI Wyniki analizy cytogenetycznej materiału szpiku, uzyskanego od 26 pacjentów zestawiono w Tabeli 1. Analizę kariotypu przeprowadzono u 9 pacjentów, u których uzyskano figury podziałowe w wyniku hodowli in vitro (HG 277, 276, 108, 135, 136, 185, 186, 281 i 282). U 8 z tych pacjentów stwierdzono obecność typowej translokacji t(9;22)(q34;q11), która w 6 przypadkach była zmianą izolowaną. U pacjenta HG 135, translokacji t(9;22) towarzyszyła aberracja dodatkowa, t(2;12)(q31;q13), zaś w HG

102 B. PIEŃKOWSKA-GRELA i wsp. 108 dodatkową zmianą była delecja fragmentu długiego ramienia chromosomu 18. W komórkach pacjenta HG 276 wykazano w kariotypie obecność translokacji wariantowej t(7;9;22)(q32;q34;q11). Tabela 1. Wyniki analizy kariotypowej i analizy FISH, przeprowadzonej przy uŝyciu dwu sond specyficznych: LSI BCR/ABL Dual Colour Dual Fusion Probe i LSI 9q34 Table 1. Spectrum Aqua (Vysis) na komórkach szpiku 26 pacjentów z CML. Znakowanie Y sygnał fuzyjny, R sygnał czerwony (ABL), G sygnał zielony (BCR), Aq sygnał jasnoniebieski (ASS). A. Pacjenci z nietypowym wzorem znakowania FISH Lp Nr pacjenta Kariotyp sonda BCR/ABL Wzór znakowania (%) 1. HG 277 46,XX,t(9;22) [20] 1Y1R1G (82%) 2R2G (18%) 2. HG302/1*$ n.t. 1Y1R1G (17%) 2R2G (83%) 3. HG 305*$ n.t. 1Y1R1G (30%) 2R2G (70%) 4. HG 438* n.t. 1Y1R1G (95%) 2R2G (5%) 5. HG 263*$ n.t. 1Y1R2G (41%) 2R2G (59%) 6. HG 469* n.t. 1Y1R2G (83%) 2R2G (17%) 7. HG 276 46,XX,t(7;9;22)(q32;q34;q11) [19]/ 46,XX[1] 1Y2R2G (42%); 1Y1R2G (31%); 1Y2R1G (9%) 2R2G (18%) sonda ASS Wzór znakowania (%) 1Aq (78%) 2Aq (22%) 1Aq (18%) 2Aq (82%) 1Aq (23%) 2Aq (77%) 1Aq (88%) 2Aq (12%) 1Aq (49%) 2Aq (51%) 1Aq (86%) 2Aq (14%) 2Aq (100%) B. Pacjenci z typowym wzorem znakowania FISH Lp Nr pacjenta Kariotyp sonda BCR/ABL sonda ASS Wzór znakowania Wzór znakowania 8. HG 108 46,XX, t(9;22),del(18)(q2?1) 2Y1R1G 2Aq [17]/ 46,XX[3] 9. HG 135 46,XY,t(2;12)(q31;q1?3), 2Y1R1G 2Aq t(9;22)[20] 10. HG 136 46,XY,t(9;22) [14] /46,XY [6] 2Y1R1G 2Aq 11. HG 185 46,XY,t(9;22) [17]/ 46,XY[3] 2Y1R1G 2Aq 12. HG 186 46,XX,t(9;22) [20] 2Y1R1G 2Aq 13. HG 281 46,XX,t(9;22) [20] 2Y1R1G 2Aq 14. HG 282 46,XX,t(9;22) [25] 2Y1R1G 2Aq 15. HG 304* n.t. 2Y1R1G 2Aq 16. HG 307* n.t. 2Y1R1G 2Aq 17. HG 335* n.t. 2Y1R1G 2Aq 18. HG336/1* n.t. 2Y1R1G 2Aq 19. HG 431* n.t. 2Y1R1G 2Aq 20. HG 432* n.t. 2Y1R1G 2Aq

Częstość delecji submikroskopowego obszaru fuzji ABL/BCR 103 21. HG 433* n.t. 2Y1R1G 2Aq 22. HG 434* n.t. 2Y1R1G 2Aq 23. HG 439* n.t. 2Y1R1G 2Aq 24. HG 470* n.t. 2Y1R1G 2Aq 25. HG 471* n.t. 2Y1R1G 2Aq 26. HG 472* n.t. 2Y1R1G 2Aq * badanym materiałem był rozmaz szpiku $ pacjent w trakcie leczenia n.t. nie testowano Badanie FISH z wykorzystaniem sondy BCR/ABL potwierdziło obecność fuzji BCR/ABL u wszystkich 26 pacjentów, wykazując jednocześnie róŝnice znakowania pomiędzy poszczególnymi przypadkami. ABL (sygnał czerwony) BCR (sygnał zielony) BCR/ABL i ABL/BCR (sygnały fuzyjne Ŝółte, na der(9) i der(22) czyli Ph) 9 9 22 22 Ph 9 Komórka prawidłowa 2R2G Komórka z typową fuzją 2Y1R1G Ryc. 1. Wynik hybrydyzacji z sondą D-FISH BCR/ABL. W komórce prawidłowej widoczne są po dwa sygnały zielone i czerwone pochodzące z prawidłowych chromosomów 9 i 22 (2R2G). W komórce z typową fuzją BCR/ABL widoczny jest jeden sygnał czerwony i jeden zielony pochodzące z prawidłowych chromosomów 9 i 22 oraz dwa Ŝółte sygnały fuzyjne pochodzące ze zmienionego chromosomu 9 i z chromosomu Ph (2Y1R1G). W 7 przypadkach ujawniony wzór znakowania odbiegał od typowego 2Y1R1G. W analizowanych komórkach przypadków HG 277, 302, 305, 438, 263, 468 i 276 widoczny był tylko jeden sygnał fuzyjny. Wykazanie ubytku drugiego z sygnałów fuzyjnych, wskazuje na zajście delecji w obszarze fuzji badanych genów. U chorych z nietypowym obrazem fuzji w jądrach interfazowych występowały róŝne wzory znakowania: 1Y1R1G, 1Y1R2G i 1Y2R2G. W 4 przypadkach (HG 277, 302, 305, 438) ujawniły się komórki ze wzorem hybrydyzacyjnym 1Y1R1G (Ryc. 2A, Tab. 1A). Analiza jąder interfazowych wykazała występowanie znakowania odpowiadającego jednemu sygnałowi fuzyjnemu (1Y, kolokalizacja sygnału czerwonego i zielonego), jednemu sygnałowi czerwonemu (1R,

104 B. PIEŃKOWSKA-GRELA i wsp.

Częstość delecji submikroskopowego obszaru fuzji ABL/BCR 105

106 B. PIEŃKOWSKA-GRELA i wsp. gen ABL) i jednemu sygnałowi zielonemu (1G, gen BCR) (Rycina 2A). Równoległa analiza znakowanych sondą metafaz u pacjenta HG 277 potwierdziła obecność sygnału fuzyjnego na chromosomie Ph [der(22)] i brak sygnałów na zmienionym chromosomie 9 [der(9)]. Oznacza to utratę całego fragmentu fuzyjnego ABL/BCR ze zmienionego chromosomu 9, z zachowaniem fuzji BCR/ABL na chromosomie der(22). Kariotyp tej białaczki wykazywał obecność translokacji t(9;22) jako jedynej zmiany. W tych 4 przypadkach komórki ze znakowaniem nietypowym obserwowane były w 17% - 82% komórek badanej populacji. Pozostałe jądra interfazowe wykazywały wzór 2R2G, odpowiadający obecności dwu niezmienionych kopii genów ABL i BCR. Drugi typ znakowania 1Y1R2G zaobserwowano u dwóch kolejnych chorych: HG 263 i HG 469. Analiza jąder interfazowych wykazała występowanie tu jednego sygnału fuzyjnego, jednego sygnału czerwonego i dwu sygnałów zielonych (Rycina 2B). Obraz taki wskazywał obecność fuzji BCR/ABL na der(22), widocznej jako jeden sygnał kolokalizacyjny. Obserwowane dwa sygnały zielone odpowiadają: prawidłowemu genowi BCR (chromosom 22) i dystalnemu fragmentowi genu BCR, przeniesionemu na der(9) w rezultacie translokacji. Jeden sygnał czerwony odpowiada genowi ABL na prawidłowym chromosomie 9. Brak drugiego sygnału fuzyjnego jest efektem utraty proksymalnego obszaru regionu genu ABL (znakowanie czerwone) ze zmienionego chromosomu 9. Znakowanie takie wystąpiło w 41% (HG 263) i 83% (HG 469) badanych populacji szpiku, zaś pozostałe komórki wykazywały znakowanie 2R2G odpowiadające komórkom nieobciąŝonym fuzją BCR/ABL. W przypadku HG 276 badanie FISH wykazało przewagę (42%) komórek niosących wzór znakowania 1Y2G2R (Ryc. 2C). Komórki pozbawione fuzji (2G2R) stanowiły 18%, zaś pozostałe 40% komórek wykazywało 1 2 sygnałów czerwonych i zielonych, przy zachowaniu jednego sygnału fuzyjnego. Analiza metafaz tego przypadku wykazała, Ŝe występujące tu odstępstwo od typowego obrazu znakowania FISH nie wynika ze zmniejszenia liczby sygnałów pochodzących z poszczególnych genów, a z rozdzielenia jednego z sygnałów fuzyjnych na jego składowe (1G i 1R). Stwierdzony jeden sygnał kolokalizacyjny (1Y) zlokalizowany był na der(22) i odpowiadał fuzyjnemu genowi BCR/ABL. Drugi sygnał fuzyjny ABL/BCR uległ rozdzieleniu tak, Ŝe translokowany fragment genu BCR został przeniesiony na zmieniony chromosom 7 [der(7)], a sygnał czerwony genu ABL zaangaŝowanego w translokację pozostał na der(9). Obraz taki wynika z obecności translokacji złoŝonej pomiędzy trzema chromosomami t(7;9;22), stwierdzonej w badaniu kariotypowym (Ryc. 3). Sumaryczna liczba sygnałów BCR i ABL w komórce nie uległa w tym przypadku zmianie (po trzy zielone i czerwone), co wskazuje na brak utrat obszarów znakowanych, a co za tym idzie brak submikroskopowych delecji. W pozostałych 19 badanych przypadkach (Tab. 1B) wykazano obecność typowego wzoru znakowania (2Y1R1G), co wskazuje na fuzję BCR/ABL na chromosomie der(22), z zachowaniem fuzji ABL/BCR na zmienionym chromosomie 9, a więc bez delecji w obszarze fuzji ABL/BCR. Równolegle u wszystkich chorych przeprowadzona została analiza FISH z zastosowaniem sondy znakującej gen ASS (Tab. 1). W 6 przypadkach (pozycje 1 6) wystą-

Częstość delecji submikroskopowego obszaru fuzji ABL/BCR 107 piła utrata jednego sygnału sondy ASS, równoznaczna z delecją tego regionu. Odsetek komórek z delecją ASS stwierdzony w tym doświadczeniu, odpowiadał odsetkowi komórek z fuzją BCR/ABL, wykazanemu w badaniu sondą BCR/ABL na tym samym materiale. W przypadku HG 276 analiza jąder interfazowych, znakowanych sondą ASS wykazała obecność obydwu sygnałów tego genu we wszystkich ocenianych jądrach i potwierdziła brak delecji ABL/BCR w tym przypadku. Obecność dwu sygnałów z genu ASS, a więc brak delecji tego obszaru wykazano równieŝ u pozostałych 19 pacjentów (Tab. 1B), gdzie znakowanie sondą BCR/ABL wykazało typowy wzór fuzyjny 2Y1G1R. DYSKUSJA Równoległe zastosowanie sondy znakującej szeroki obszar fuzyjny BCR/ABL, z sondą znakującą minimalny obszar delecji, gen ASS, wykonane w niniejszej pracy, miało na celu zweryfikowanie danych dotyczących częstości i typu delecji submikroskopowych w regionie fuzji ABL/BCR w przewlekłej białaczce szpikowej. Obecność produktu chimerycznego genu BCR/ABL, zlokalizowanego na zmienionym chromosomie 22, jest kluczową przyczyną powstania przewlekłej białaczki szpikowej, a jego obecność jest stwierdzana w komórkach szpiku wszystkich pacjentów z CML. Funkcja drugiego produktu fuzyjnego, genu ABL/BCR powstającego na zmienionym chromosomie 9, nie jest ostatecznie wyjaśniona, jednak uwaŝa się, Ŝe jego znaczenie w procesie karcinogenezy jest niewielkie (15). Submikroskopowe delecje w regionie fuzji ABL/BCR są zjawiskiem towarzyszącym fuzji BCR/ABL w części przypadków przewlekłej białaczki szpikowej. Dotyczą one fragmentów o wielkości od kilku kpz do kilku mpz (5, 8). Dotychczas publikowane dane, wykazują dość duŝe rozbieŝności w ocenie częstości występowania tej cechy. W róŝnych laboratoriach światowych określono odsetek przypadków z delecją ABL/BCR w zakresie od 9% do 30% wszystkich zdiagnozowanych CML (4 6, 10, 15 17). Wyniki prac wielu autorów wskazują, Ŝe delecje w regionie fuzyjnym ABL/BCR powstają równocześnie z zajściem translokacji t(9;22). Delecja taka nie jest więc zmianą wtórną, pojawiającą się w trakcie progresji, a częstość jej występowania nie jest zaleŝna od stadium choroby. Wiarygodność tej tezy wynika z licznych obserwacji, ujawniających jednorodność populacji komórek Ph+ pod względem statusu delecji obszaru ABL/BCR. Nie stwierdza się u jednego pacjenta jednoczesnego występowania metafaz Ph+ z delecjami i metafaz Ph+ bez delecji (5 8). Pojedyncze doniesienia o przypadkach, gdzie delecje w obrębie regionu fuzji ABL/BCR są wykrywane w trakcie progresji choroby, nie są dostatecznie udokumentowane i wskazują raczej na niedostatki techniczne metody we wcześniejszej fazie badań (9, 16). W 77% przypadków badanej grupy 26 chorych nie stwierdzono cech delecji w obszarze fuzji, znakowanej sondami dla genów ABL i BCR. Jednocześnie wykazano u tych pacjentów obecność dwu kopii genu ASS. Podobne wyniki wykazujące brak

108 B. PIEŃKOWSKA-GRELA i wsp. delecji genu ASS u chorych z typową fuzją zanotowała Aoun i in. w grupie 152 chorych na przewlekłą białaczkę szpikową (17). W badanej przez nas grupie pacjentów 27% wykazało nietypowy wzór znakowania w odczycie z sondy BCR/ABL. U jednego chorego równoległa analiza metafaz znakowanych sondami i ujawniających prąŝki G wykazała, Ŝe brak drugiego sygnału fuzyjnego (ABL/BCR) wynika z obecności translokacji złoŝonej. W rezultacie translokacji t(7;9;22), materiał niosący dystalny fragment regionu genu BCR, translokowany w warunkach typowych na der(9), został tu przeniesiony na chromosom 7, na der(9) pozostał zaś proksymalny fragment genu ABL. W tym przypadku nietypowe znakowanie nie było związane z utratą sekwencji obszaru ABL/BCR i nie stwierdzono tam utraty genu ASS. W 23% przypadków analiza jakości i liczby sygnałów genów ABL i BCR wykazała obecność submikroskopowej delecji z obszaru fuzji ABL/BCR. We wszystkich tych przypadkach utracie jednego sygnału fuzyjnego, towarzyszyła równoczesna utrata jednej kopii genu ASS. W 67% przypadków z obecnością submikroskopowej delecji obserwowano znakowanie 1Y1R1G, wskazujące na utratę całego genu fuzyjnego ABL/BCR z chromosomu der(9). Znacznie rzadziej (33%) notowano wzór znakowania 1Y1R2G, wynikający z utraty fragmentu regionu genu ABL, z zachowaniem przeniesionego na der(9) dystalnego regionu genu BCR. Populacji komórek Ph+ z submikroskopową delecją towarzyszyły komórki prawidłowe w obszarze badanych genów, to jest wykazujące obecność dwu kopii genów ABL, BCR i ASS. Takie komórki stanowiły od 5% do 83% badanej populacji. Wysoki odsetek komórek prawidłowych stwierdzono u pacjentów, którzy w trakcie leczenia uzyskali częściową remisję cytogenetyczną. Wzór znakowania FISH w przypadkach z delecją nie jest jednolity. U większości pacjentów dochodzi do utraty sekwencji po obydwu stronach punktu pęknięcia na der(9), tj. zarówno sekwencji pochodzącej z chromosomu 9, jak i przeniesionej z chromosomu 22 (wzór 1Y1R1G). DuŜo rzadziej tracony jest wyłącznie fragment chromosomu 9 (znakowanie 1Y1R2G), a w pojedynczych tylko przypadkach notowane są delecje obejmujące tylko region pochodzący z chromosomu 22 (5, 6, 8, 17). Tak zróŝnicowany obraz powoduje trudności z jednoznaczną oceną. RozbieŜność publikowanych wyników moŝna korelować z trudnościami detekcji bądź interpretacji uzyskanych sygnałów FISH lub/i stosowania róŝnego typu sond dla oceny delecji. Cytowane powyŝej badania opierają się w większości na analizie wyników znakowania przy uŝyciu translokacyjnych sond D-FISH BCR/ABL, stosowanych rutynowo w diagnostyce CML. Definicja utraty sygnału jest w tych przypadkach wypadkową jakości preparatu, czułości stosowanych systemów detekcji i parametrów technicznych systemów analizy obrazu, a takŝe od doświadczenia oceniającego badacza. Tak więc zastosowanie sondy ASS w przypadkach wątpliwych bądź trudnych do interpretacji jest, w świetle uzyskanych przez nas wyników, dobra technika uzupełniającą. Dotychczasowe dostępne dane wskazują na istotną rolę rokowniczą delecji w obrębie fuzji ABL/BCR u chorych z CML leczonych interferonem alfa, natomiast dane dotyczące znaczenia tego parametru w terapii imatinibem nie są w pełni zgodne. Pacjenci

Częstość delecji submikroskopowego obszaru fuzji ABL/BCR 109 z obecnością delecji w regionie ABL/BCR są bardziej oporni na chemioterapię i leczenie interferonem, co skutkuje krótszym czasem przeŝycia (4 7, 10). Natomiast terapia inhibitorami kinaz tyrozynowych częściowo znosi niekorzystny wpływ rokowniczy tego parametru. Niektóre obserwacje korelują jednak tę cechę z pojawianiem się progresji choroby czy oporności wtórnej (10, 11). Mimo nierozstrzygniętych wątpliwości European Leukemia Net uznał obecność delecji za czynnik zagroŝenia, dlatego teŝ wskazano oznaczanie obecności lub braku tej aberracji u wszystkich pacjentów z CML za istotne przed podjęciem leczenia. Wydaje się, Ŝe zastosowanie sondy D-FISH BCR/ABL jest wystarczające, aby taką delecję wykryć. Równoczesne zastosowanie sond znakujących geny BCR, ABL i ASS w badanej grupie nie wykazało dalszych przypadków z delecją, nie wykrytych rutynowo stosowaną sondą D-FISH. Na podstawie przeprowadzonego badania moŝna sądzić, Ŝe standardowo wykorzystywana technika D-FISH w pełni wykrywa przypadki obcią- Ŝone źle rokującą delecją w obszarze chimerycznego genu ABL/BCR. Zastosowanie dodatkowego znakowania sondą ASS jest wskazane jedynie w przypadkach wątpliwych, przy zmiennej liczbie sygnałów i braku analizy prąŝkowej, a takŝe w trakcie monitorowania pacjentów ze stwierdzoną delecją w obszarze fuzji ABL/BCR. PIŚMIENNICTWO 1. Bentz M, Cabot G, Moos M, Speicher MR, Ganser A, Lichter P, Dohner H. Detection of chimeric myeloid and acute lymphoblastic leukemia by in situ hybridization. Blood, 1994; 8: 1922-1928. 2. Hagemeijer A, Bartram CR, Smit EME, van Agthoven AJ, Bootsma D. Is the chromosomal region 9q34 always involved in variants of the Ph1 translocation? Cancer Genet Cytogenet, 1984; 13: 1-16. 3. Preizner W, Sacha T, Salamanczuk Z, Pienkowska-Grela, Haus O, Hellmann A. Standard postępowania diagnostycznego i terapeutycznego u chorych z przewlekłą białaczką szpikową w Polsce w roku 2007. Acta Hematologica Polonica, 2007; 30: 107-122. 4. Sinclair PB, Nacheva ER, Leversha M, Telford N, Chang J, Reid A, Bench A, Champion K, Huntly B, Green AR. Large deletions at the t(9;22) breakpoint are common and may identify a poor-prognosis subgroup of patients with chronic myeloid leukemia. Blood, 1999, 95(3): 738-744. 5. Cohen N, Rozenfeld-Granot G, Hardan I, Brok-Simoni F, Amariglio N, Rechavi G, Trakhtenbrot L. Subgroup of patients Philadelphia-positive chronic myelogenous leukemia characterized by a deletion of 9q proximal to ABL gene: expression profiling, resistance to interferon therapy, and poor prognosis. Cancer Genet Cytogenet, 2001; 128: 114-119 6. Huntly BJP, Reid AG, Bench AJ, Campbell LJ, Telford N, Shepherd P, Szer J, Prince M, Turner P, Grace C, Nacheva EP, Green AR. Deletions of the derivative 9 occur at the time of the Philadelphia translocation and provide a powerful and independent prognostic indicator in chronic myeloid leukemia. Blood, 2001; 98(6): 1732-1738. 7. Kolomietz E, Al-Maghrabi J, Brennan S, Karaskowa J, Minkin S, lepton J, Squire JA. Primary chromosomal rearrangements of leukemia are frequently accompanied by extensive submicroscopic deletions and may lead to altered prognosis. Blood, 2001; 97(11): 3581-3588. 8. Storlazzi CT, Giorgina S, Anelli L, Albano F, Pastore D, Zagaria A, Rocchi M, Liso V. Breakpoint characterization of der(9) deletions in chronic myeloid leukemia patients. Genes Chromosomes Cancer, 2002; 35: 271-276.

110 B. PIEŃKOWSKA-GRELA i wsp. 9. Xinth PT, Vu HA, Nghia H, Binh NT, Be TV, Binh TV, Tokunaga K, Sato Y. Coexintence of Philadelphia chromosome positive cells with and without der(9) deletion in a patient with chronic myelogenous leukemia. Cancer Genet Cytogenet, 2006; 164: 122-127 10. Lee YK, Kim YR, Min HC, Oh BR, Kim TY, Kim YS, Cho HI, Kim HC, Lee YS, Lee DS. Deletions of any part of the BCR or ABL gene on the derivative chromosome 9 is a poor prognostic marker in chronic myeligenous leukemia. Cancer Genet Cytogene,t 2006; 166: 65-73. 11. Huntly BJP, Guilhot F, Reid AG, Vassiliou G, Hennig E, Franke C, Byrne J, Brizard A, Niederwieser D, Freeman- Edward J, Cuthbert G, Bown N, Clark RE, Nachewa EP, Green AR, Deininger MWN. Imatinib improves but not fully reverse the poor prognosis of patients with CML with derivative chromosome 9 deletions. Blood, 2003; 102(6): 2205-2212. 12.Quintas-Cardama A, Kantarjian H, Talpaz M, O Brien S, Garcia-Manero G, Verstovsek S, Rios MB, Hayes K, Glassman A, Bekele BN, Zhou X, Cortes J. Imatinib mesylate therapy may overcome the poor prognosis significance of deletions of derivative chromosome 9 in patients with chronic myelogenous leukemia. Blood, 2005; 105(6): 2281-2285. 13.Hehlman R, Hochhaus A, Baccarani M. Chronic myeloid leukaemia. Lancet, 2007; 370: 342-350. 14.ISCN 2005:An International System for Human Cytogenetic Nomenclature, Shaffer L.G., Tommerup N. (eds);s. Karger, Basel 2005 15. Loncarevic IF, Römer J, Starke H, Heller A, Bleck C, Ziegler M, Fiedler W, Liehr T, Clement JH, Claussen U. Heterogenic molecular basis for loss of ABL1-BCR transcription: deletions in der(9)t(9;22) and variants of standard t(9;22) in BCR-ABL1-positive chronic myeloid leukemia. Genes Chromosomes Cancer, 2002; 34: 193-200. 16. Lee DS, Lee YS, Yun YS, Kim YR, Jeong SS, Lee YK, She CJ, Yoon SS, Shin HR, Kim Y, Cho HI. A study of the incidence of ABL gene deletions on derivative chromosome 9 in chronic myelogenous leukemia by interphase in situ hybridization and its association with desease progression. Genes Chromosomes Cancer, 2003; 37: 291-299. 17. Aoun P, Wiggins M, Pickering D, Foran J, Rasheed H, Pavletic SZ, Sanger W. Interphase fluorescence in situ hybridization studies for the detection of 9q34 deletions in chronic myelogenous leukemia: a practical approach to clinical diagnosis. Cancer Genet Cytogenet, 2004; 154: 138-143. Praca wpłynęła do Redakcji 25.05.2007 r. i została zakwalifikowana do druku 16.01.2008 r. Adres Autora: Samodzielna Pracownia Cytogenetyki Centrum Onkologii im M. Skłodowskiej-Curie ul. Roentgena 5 02-781 Warszawa renatawr@coi.waw.pl