Metabolizm Ksenobiotyków CYP450

Metabolizm Ksenobiotyków CYP450 1

Definicja Ksenobiotyk jest obcą substancją chemiczną znajdującą się w organizmie, który normalnie nie jest wytwarzany przez organizm lub oczekuje się, że będzie obecny w tym organizmie. Może również obejmować substancje obecne w znacznie wyższych stężeniach niż zwykle Przykłady - Leki, dodatki do żywności, zanieczyszczenia, insektycydy, chemiczne substancje rakotwórcze itp Dostają się do organizmu głównie z jedzeniem lub lekami Trzy główne drogi: jelito, płuca, skóra 2

Wnikanie ksenobiotyków do komórek Dyfuzja prosta - substancje lipofilowe, zależą od gradientu stężeń (wątroba - swobodnie przepuszczalne, duże pory w błonie komórkowej, najbardziej dotknięta zatruciem) Dyfuzja ułatwiona - transportery Aktywny transport - podstawowy, wtórny Endocytoza ksenobiotyki strukturalnie podobne do substratów fizjologicznych mogą wykorzystywać wszystkie dostępne systemy transportowe 3

Wydalanie ksenobiotyków z komórek podstawowy transport aktywny - potrzebuje energii: hydroliza ATP specjalne ATP-azy zwane ABC (kasety wiążące ATP) zlokalizowane w błonach komórkowych, eksportują ksenobiotyki z komórek do ECF MRP (białka odporności wielolekowej) podwyższona ekspresja powoduje oporność na leki 4

Wydalanie ksenobiotyków z organizmu chemicznie modyfikowane (bardziej polarne) ksenobiotyki są wydalane z moczem, żółcią, kałem lub potem substancje lotne przez płuca wydalanie do mleka ludzkiego czasami występują dekoniugacja jelitowa i wchłanianie zwrotne krążenie jelitowo-wątrobowe 5

Biotransformacja i detoksykacja Biotransformacja polega na konwersji lipofilowych substancji chemicznych do rozpuszczalnych w wodzie, katalizowana przez enzymy w wątrobie i innych tkankach W większości przypadków biotransformacja zmniejsza toksyczność ksenobiotyków Termin detoksykacja jest czasami używany dla nazywania wielu reakcji związanych z metabolizmem ksenobiotyków 6

Znaczenie biomedyczne Coraz częściej ludzie narażeni są na działanie różnych obcych substancji chemicznych - ksenobiotyków. Znajomość metabolizmu ksenobiotyków jest podstawą racjonalnego zrozumienia: - farmakologii i terapii - farmacji - toksykologii - leczenia raka i uzależnień od narkotyków Wszystkie te obszary obejmują podawanie ksenobiotyków lub narażenie na nie 7

Cele Biotransformacji 1. ułatwia wydalanie: przekształca związki lipofilowe w hydrofilowe 2. Detoksykacja / inaktywacja: przekształca substancje chemiczne w formy mniej toksyczne 3. Aktywacja metaboliczna: przekształca substancje chemiczne w bardziej toksyczne, aktywne formy lub przekształca nieaktywny lek w jego aktywną formę 8

Miejsca biotransformacji Wątroba Główne miejsce! Bogata w enzymy Działa na związki endogenne i egzogenne Pozajelitowe miejsca metabolizmu 1. Ściana jelita -Koniugacja siarczanowa -Esteraza i lipazy - ważne w metabolizmie proleków 2. Płuca, nerki, łożysko, mózg, skóra, nadnercza 9

Metabolizm Ksenobiotyków faza I 1. Hydroksylacja Monooksygenazy lub cytochrom P450 Hydroksylacja może zakończyć działanie leku 2. deaminacja, dehalogenacja, desulfuracja, epoksydacja, peroksygenacja i redukcja, hydroliza Cel: Wprowadzenie polarnych grup funkcyjnych w cząsteczkach - Zwiększenie polaryzację cząsteczki - Zapewnia miejsce do metabolizmu fazy II 10

Metabolizm Ksenobiotyków Faza II Koniugacja z kwasem glukuronowym, siarczanem, octanem, glutationem, aminokwasami Metylacja gólnym celem fazy II metabolizmu ksenobiotyków jest zwiększenie ich rozpuszczalności w wodzie (polarności), lub inaktywacja substancji aktywnych 11

Enzymy metabolizujące ksenobiotyki (XME) Faza 1 -Cytochromy P450 - Monooksygenazy flawinowe - Hydrolazy epoksydowe -Dehydrogenazy alkoholowe / aldehydowe - ksydazy monoaminowe - ksydaza ksantynowa Faza 2 Transferazy - Sulfotransferazy (ST) - UDP-glukuronozylotransferazy (UGT) - S-transferazy glutationowe (GST) 12

Cytochrom P450 nadrodzina enzymów hemowych (wiele izoform) może katalizować różne typy reakcji, głównie hydroksylację Człowiek: 18 rodzin, 43 podrodziny, 57 zsekwencjonowanych genów może być indukowany i hamowany występuje w większości tkanek (z wyjątkiem mięśni i erytrocytów) najwyższa ilość w wątrobie (ER) wykazują polimorfizm genetyczny (nietypowe biotransformacje) Nomenklatura: CYP1A2 rodzina podrodzina Indywidualne białko z danej podrodziny 13

Lokalizacja Cytochromu P450 14

15

16

Cytochrom P450 Są obecne w największej ilości w wątrobie i jelicie cienkim, ale prawdopodobnie są obecne we wszystkich tkankach W wątrobie i większości innych tkanek występują głównie w błonach gładkiej retikulum endoplazmatycznego W nadnerczach występują w mitochondriach, a także w retikulum endoplazmatycznym Różne hydroksylazy obecne w tym narządzie odgrywają ważną rolę w biosyntezie cholesterolu i steroidów 17

Cytochrom P450 Co najmniej sześć izoform cytochromu P450 jest obecnych w retikulum endoplazmatycznym ludzkiej wątroby działa na ksenobiotyki i związki endogenne P450 metabolizuje niektóre powszechnie stosowane rozpuszczalniki, a także składniki występujące w dymie tytoniowym, z których wiele jest uznanych za rakotwórcze Większość izoform cytochromu P450 jest indukowalna Indukcja cytochromu P450 ma ważne implikacje kliniczne, ponieważ jest to biochemiczny mechanizm interakcji leku 18

Cytochrom P450 Niektóre izoformy cytochromu P450 (np. CYP1A1) są szczególnie zaangażowane w metabolizm wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych (PAH) i pochodnych Z tego powodu były wcześniej nazywane aromatycznymi hydroksylazami węglowodorowymi (AHH) Enzym ten jest ważny w metabolizmie PAH i w karcynogenezie indukowanej przez te związki 19

20

Cytochrom P450 Niektóre cytochromy P450 występują w postaciach polimorficznych (izoformach genetycznych), z których niektóre wykazują niską aktywność katalityczną CYP2A6 biorący udział w metabolizmie nikotyny do konityny, zidentyfikowano trzy allele, typ dziki i dwa nieaktywne allele soby z allelami zerowymi, które mają upośledzony metabolizm nikotyny, są najwyraźniej chronione przed uzależnieniem od tytoniu ponieważ ich stężenie nikotyny we krwi i mózgu pozostaje dłużej podwyższone Spekuluje się, że hamowanie CYP2A6 może być nowym sposobem zapobiegania i leczenia palenia 21

Induktory oraz inhibitory CYP450 niektóre ksenobiotyki indukują syntezę CYP - zwiększa się zdolność metaboliczna CYP jeśli podawany lek + induktor, oba metabolizowane przez tę samą izoformę CYP i lek jest metabolizowany szybciej, lek jest mniej skuteczny niektóre ksenobiotyki hamują CYP najczęstsza izoforma - CYP3A4 - metabolizuje ponad 120 różnych leków farmaceutycznych inhibitorami CYP3A4 są np. antybiotyki makrolidowe, grejpfrut (furanokumaryny), ketokonazol jeśli podawany inhibitor + lek, zwiększony poziom leku, przedawkowanie, działania niepożądane 22

Budowa cytochromu P450 cytochrom P450 zawiera trzy kofaktory i dwa enzymy: NADPH + H +, FAD, hem reduktaza NADPH: CYP (oddziela elektrony i protony) i hydroksylaza cytochromu P450 Lipidy są również składnikami systemu cytochromu P450 Preferowanym lipidem jest fosfatydylocholina, która jest głównym lipidem znajdowanym w błonach retikulum endoplazmatycznego 23

Mechanizm hydroksylacji CYP Utworzenie grupy hydroksylowej monooksygenaza: jeden atom z cząsteczki 2 jest włączany do substratu pomiędzy C i H (R-H R-H ) Drugi atom + 2H z NADPH2 dają wodę R-H + 2 + NADPH + H+ R-H + H2 + NADP+ 2 e - + 2 H+ 24

Mechanizm hydroksylacji CYP 25

REAKCJE FAZY I 26

Hydroksylacja Główną reakcją jest hydroksylacja dpowiedzialne za nią enzymy nazywane są monooksygenazami i cytochromem P450 Hydroksylacja przez CYP450 zachodzi w substratach endogennych i egzogennych Retikulum endoplazmatyczne: skwalen, cholesterol, kwasy żółciowe, desaturacja FA, prostaglandyny, ksenobiotyki Mitochondria: hormony steroidowe 27

Przykład hydroksylacji 28

29

Monooksygenazy flawinowe NADP H2 FM FM + FAD FAD FM FADHH NADP+ NADPH + H+ FM nie są indukowalne i są konstytutywne FM FADH2 NADP + 2 X X Monooksygenazy zawierające FAD (FM) utleniają nukleofilowe heteroatomy azotu, siarki i fosforu różnych ksenobiotyków Znajdują się we frakcji mikrosomalnej wątroby, nerek i płuc FM FADHH NADP+ FADHH is 4a-hydroperoxyflavin FADHH is 4a-hydroxyflavin 30

Przykładowe reakcje FM FM N N CH3 N excretion CH3 N nicotine-1'-n-oxide nicotine FM CH3 N 2-acetylaminofluorene (2-AAF) caricnogen N-hydroxy-2-AAF N CH3 H H 31

Epoksydy Epoksydy są wysoce reaktywne i mutagenne lub rakotwórcze, mogą tworzyć się w fazie I (CYP / CX) Hydrolaza epoksydowa (EH) przekształca je w znacznie mniej reaktywne dihydrodiole U ssaków występuje 5 różnych form EH: 1. Mikrosomalna hydrolaza epoksydowa (meh) 2. Rozpuszczalna hydrolaza epoksydowa (seh) 3. Hydrolaza epoksydowa cholesterolu 4. Hydrolaza LTA4 5. Hydrolaza Hepoxilin meh i seh hydrolizują ksenobiotyczne epoksydy, podczas gdy 3 ostatnie hydrolazy działają na endogenne substraty 32

Inne (niemikrosomalne) reakcje fazy I Hydroliza w osoczu przez esterazy (suksametonium przez cholinesterazę) Alkohol i dehydrogenaza aldehydowa w cytozolu wątroby (etanol) ksydaza monoaminowa w mitochondriach (tyramina, noradrenalina, dopamina, aminy) ksydaza ksantynowa (6-merkaptopuryna, produkcja kwasu moczowego) Enzymy dla poszczególnych substratów (hydroksylaza tyrozynowa, dekarboksylaza dopa itp.) 33

Niemikrosomalne reakcje oksydacji MA katalizuje oksydacyjną deaminację monoamin Tlen jest używany do usuwania grupy aminowej z cząsteczki, co powoduje powstanie odpowiedniego aldehydu i amoniaku MA są związane z zewnętrzną błoną mitochondriów w większości typów komórek w organizmie Należą do rodziny białek flawinowych zawierających oksydoreduktazy aminowe RCH2NH2+2+H22 RCH+NH3+H2 34

Reakcje hydrolizy Hydrolizują (dodaje wodę do) estry i amidy oraz ich izostery Enzymy: hydrolazy nie-mikrosomalne C2H CH3 esterase C2H H H R1 R2 Name Susceptibility to Hydrolysis C Ester Highest C S Thioester C R2 + Carbonate C N Amide N Carbamate N N Ureide CH3 ASA R1 Kwas acetylosalicylowy Lowest 35

REAKCJE FAZY II 36

37

Glukuronidacja najczęstsza reakcja sprzęgania. Kwas UDP-glukuronowy (UDPGA) jest donorem glukuronylu UDP-glukuronylo-transferazy (UGT), obecne zarówno w retikulum endoplazmatycznym (ER), jak i cytozolu, są katalizatorami Cząsteczki takie jak 2-acetyloaminofluorena (substancja rakotwórcza), anilina, kwas benzoesowy, meprobamat (środek uspokajający), fenol i wiele steroidów są wydalane jako glukuronidy Glukuronid może być przyłączony do grup tlenowych, azotowych lub siarkowych substratów 38

Glukuronidacja 39

40

Sulfatacja Niektóre alkohole, aryloaminy i fenole są siarczanowane Inne reakcje siarczanowania biologicznego to siarczanowanie steroidów, glikozaminoglikanów, glikolipidów i glikoprotein Donorem siarczanu jest 3-fosforan adenozyny-5-fosfosiarczan (PAPS) Prowadzi do powstania nieaktywnych rozpuszczalnych w wodzie metabolitów 41

Sprzęganie z Glutationem Glutation (γ-glutamylo-cysteinyloglycina) jest tripeptydem składającym się z kwasu glutaminowego, cysteiny, i glicyny Detoksykuje związki electrofilowe 42

Mechanizm sprzęgania z glutationem Grupy glutamylowe i glicynylowe należące do glutationu są usuwane przez specyficzne enzymy grupa acetylowa (z acetylo-coa) jest dodawana do grupy aminowej pozostałego ugrupowania cysteinylowego Powstały związek jest kwasem merkapturowym, koniugatem L -acetylocysteiny, który jest następnie wydalany z moczem 43

Acetylacja Reakcja katalizowana przez acetylotransferazy obecne w cytozolu różnych tkanek, zwłaszcza wątroby Ważne dla leków z pierwszorzędowymi grupami aminowymi Lek izoniazyd, stosowany w leczeniu gruźlicy, podlega acetylacji Acetylacja NIE zwiększa rozpuszczalności w wodzie detoksykacja lub inaktywacja leku isoniazid 44

Metylacja Tylko neiktóre ksenobiotyki podlegają metylacji przez metylotransferazy S-adenozylometionina jest dawcą grupy metylowej Klucz do biosyntezy wielu związków. Ważne w inaktywacji fizjologicznie aktywnych amin biogennych, neuroprzekaźników jak noradrenalina, dopamina, serotonina, histamina Niewielki udział w metabolizmie leków Metylacja NIE zwiększa rozpuszczalności w wodzie Większość produktów metylowanych jest nieaktywna 45

46

Sprzęganie z aminokwasami z glicyną, tauryną Ksenobiotyki z grupami -CH są substratami przykład endogenny: sprzężone kwasy żółciowe koło 76% aspiryny jest metabolizowane przez sprzęganie aminokwasów Kwas salicylowy, koniugat glicyny kwasu salicylowego, jest głównym metabolitem aspiryny 47

48

49

50

51

Aktywacja proleków 52

KANCERGENEZA 53

PAH (aromatyczne węglowodory policykliczne) w środowisku PAH mogą powstawać w wyniku: - niepełnego spalania materii organicznej, takiej jak węgiel, drewno, olej, benzyna i olej napędowy - produkcji koksu, spaliny pojazdów i samolotów - palenia papierosów - wędzenia wędlin PAH występują także w naturalnych złożach paliwa Niektóre PAH wykorzystuje się do produkcji leków, barwników, tworzyw sztucznych i pestycydów Naturalne źródła PAH obejmują wulkany i pożary naturalne Przykłady obejmują Benzo (a) piren i Benzo (b) fluoranten 54

Mechanizm powstawania - rodniki powstałe w wyniku pirolizy węglowodorów między 500 a 800 C w strefie płomienia z niewystarczającą ilością 2 - Fragmenty C1 i C2 łączą się w środowisku redukującym, tworząc skondensowane związki aromatyczne - przy chłodzeniu, WWA skraplają się na istniejących cząstkach - ich rozkład odzwierciedla ich różną stabilność termodynamiczną w płomieniu z niedoborem 2 55

Działanie PAH Wykazano, że niektóre PAH powodują: raka Przewlekłe zapalenie oskrzeli Problemy skórne Alergie Płód jest bardziej narażony i podatny na: późnienie wzrostu Niska waga po urodzeniu Mały obwód głowy Niski IQ Uszkodzenie DNA Zakłócenie układów hormonalnych 56

Metabolity PAH H H (+) benzo[a]pyrene 7,8-oxide benzo[a]pyrene H (-) benzo[a]pyrene 7,8-dihydrodiol H (+) benzo[a]pyrene 7,8-dihydrodiol-9,10-epoxide ULTIMATE CARCINGEN GST/GSH CYP/PHS CYP/PHS EH CYP/PHS DNA Phase II and excretion GS HN H inactive (excreted) N HN N N DNA H H H H BaP-N2-dG DNA adduct H inactive Phase II 57

Pierwszą reakcją jest epoksydacja. W przypadku benzo (a) pirenu produktem jest odpowiedni epoksyd 7,8, który z kolei podlega hydrolazom epoksydowym tworząc stereoizomeryczne dihydrodiole Są one następnie przekształcane w epoksyd 7,8-dihydrodiol9,10. Końcową oksydazą jest cytochrom P-450 (CYP1A1). Epoksyd diolu może występować w 4 postaciach stereoizomerycznych, z których kluczowym produktem rakotwórczym jest benzo (a) piren-r-7, t-8-diol-t-9,10-epoksyd Epoksydy PAH można następnie sprzęgać z GSH. Ta koniugacja jest uważana za prawdziwą reakcję detoksykacji i 58 pośredniczy w niej transferaza glutationowa (GSTM1)

Epoksydy, które nie są skoniugowane z GSH, są przekształcane w fenole i diole. Te metabolity PAH są jednak czasami niewystarczająco polarne, aby mogły być wydalane, a zatem są sprzężone z kwasami glukuronowymi lub siarkowymi, aby umożliwić wydalenie prócz koniugacji hydroksylowane pochodne PAH mogą podlegać wielu reakcjom utleniania i hydroksylacji. bejmują one konwersję fenoli do epoksydów fenolowych, a następnie difenole i triole, diole do tetrolów i epoksydów diolowych oraz triole do triolepoksydów i pentoli 59

Aflatoksyna Aflatoksyny są naturalnie występującymi mikotoksynami wytwarzanymi przez wiele gatunków grzybów Aspergillus. Można je znaleźć na spleśniałych orzeszkach ziemnych, ryżu, kukurydzy i innych uprawach. Aflatoksyna B1 jest najsilniejszym czynnikiem rakotwórczym dla wątroby. Aspergillus fungus that procues aflatoxin Aspergillus fungus on corn 60

Metabolizm Aflatoksyn isolated e -rich double bond * electrophilic * * CH3 EH GST/GSH * * H GS DNA * NH2 N * DNA CH3 some DNA activity CH3 ULTIMATE CARCINGEN aflatoxin * H * CYP/PHS H NH N N CH3 inactive (excreted) H * * CH3 AFB1 N7-DNA adduct 61

N-Hydroksylacja AAF N-Hydroksylacja AAF jest pierwszym etapem przemian w kierunku pojawienia się czynnika rakotwórczego 62

Dalszy metabolizm N-HydroxyAAF powoduje raka N-Hydroxy AAF przechodzi metabolizm II fazy do ostatecznego czynnika rakotwórczego. Szlak glukuronidu jest również zaangażowany w karcynogenezę 63

Tytoń 64

Tytoń podczas palenia papierosów: temperatura około 900o C suszony tytoń ulega niepełnemu spalaniu nikotyna częściowo przechodzi w dym, częściowo rozkłada się Nikotyna: 0,9 mg / papieros. Smoła: 11 mg / papieros. 65

Tytoń Dym papierosowy zawiera - wolna zasada nikotynowa - wiąże się z receptorami w mózgu - C - wiąże się z hemoglobiną, dając karbonylohemoglobinę (niedokrwienie tkanki) - tlenki azotu - mogą generować reaktywne rodniki - wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne (PAH) (piren, chryzen, benzo [a] piren ), główne składniki smoły - inne substancje (N2, C2, HCN, CH4, estry ) 66

67

Toksyczne efekty ksenobiotyków 1. uszkodzenie komórek (cytotoksyczność) 2. reaktywne formy ksenobiotyku mogą wiązać się z białkiem, zmieniając jego antygenowość. Mówi się, że ksenobiotyk działa jak hapten 3. uważa się, że reakcje aktywnych chemicznie czynników rakotwórczych z DNA mają ogromne znaczenie w karcynogenezie chemicznej 68

Czynniki wpływające na metabolizm ksenobiotyków Wiek Ludzie starsi mają mnie wydajny metabolizm Płeć Związana z różnicami hormonalnymi Dziedziczenie Różnice genetyczne mogą wpływać na ilość i wydajność enzymów biotransformacji Stany chorobowe Choroby wątroby, nerek, jelit i serca 69