Biofilm, sieć wodociągowa, sekwencjonowanie, MIDI-FAME, Izabela BIEDROŃ *, Daniel WASILKOWSKI **, Teodora M. TRACZEWSKA * METODY IDENTYFIKACJI MIKROORGANIZMÓW BYTUJĄCYCH W BIOFILMACH SIECI WODOCIĄGOWEJ Błona biologiczna jest obecna w każdym systemie dystrybucji wody do picia. Jej obecność ma istotne znaczenie dla zdrowia publicznego, ponieważ może być ona siedliskiem wielu potencjalnie chorobotwórczych organizmów. Klasyczna metoda płytkowa daje bardzo ograniczone informacje na temat struktury gatunkowej organizmów zasiedlających sieć wodociągową. Zaletą zastosowania metod molekularnych jest możliwość wykrycia niechorobotwórczych gatunków, które mogą się rozmnażać w systemie dystrybucji wody. Praca przedstawia porównanie efektów identyfikacji wyizolowanego szczepu bakteryjnego z systemu dystrybucji wody do picia metodami klasycznymi, molekularnymi i biochemicznymi. 1. WSTĘP Mikroorganizmy są zdolne do życia i rozwoju w systemach dystrybucji wody. Tworzą skupiska na wewnętrznych powierzchniach rur- tak zwaną błonę biologiczną (biofilm) [4]. Macierz biofilmu stworzona jest przez wydzieliny komórek bakteryjnych, w skład których wchodzą polisacharydy, białka, tłuszcze, kwasy nukleinowe, enzymy oraz liczne metabolity. Kompleks składający się z mieszaniny tych substancji otrzymał nazwę zewnątrzkomórkowych polimerycznych substancji (EPS-extracellular polymeric substances). Mikroorganizmy zatopione w EPS mają łatwiejszy dostęp do substancji odżywczych i są chronione przed środkami dezynfekującymi. W obrębie * Politechnika Wrocławska, Instytut Inżynierii i Ochrony Środowiska, Zakład Biologii Sanitarnej i Ekotechniki, ul. Wybrzeże Wyspiańskiego 27, 50-370 Wrocław.. ** Uniwersytet Śląski, Wydział Biologii i Ochrony Środowiska, Katedra Biochemii, ul. Jagiellońska 28, 40-032 Katowice.
52 I. BIEDROŃ i in. błony biologicznej tworzą się lokalne gradienty ph i tlenu, dzięki czemu bytują tam mikroorganizmy o różnych preferencjach oddechowych i siedliskowych [4, 16].Obecność błony biologicznej może wpływać na pogorszenie jakości wody (smak, zapach) oraz być źródłem wtórnego skażenia mikrobiologicznego [6]. W błonie biologicznej rozwijają się mikroorganizmy psychrofilne- tworzące główny zrąb tej struktury, organizmy patogenne i potencjalnie patogenne oraz organizmy odpowiedzialne za intensyfikację procesów biokorozji [4, 5, 9]. Wyniki licznych badań wskazują, że około 95% wszystkich mikroorganizmów w systemach dystrybucji wody jest obecnych w postaci błony biologicznej [9]. Jednak dane na temat bioróżnorodności mikrobiologicznej biofilmu są znikome. Niewiele badań koncentruje się na identyfikacji bakterii w systemach wodociągowych. Monitoring i identyfikacja mikroorganizmów w tym środowisku opiera się głównie na izolacji drobnoustrojów metodą pośrednią- hodowla na podłożach mikrobiologicznych [11]. Stosowane metody mikrobiologii klasycznej pozwalają określić ogólną liczbę mikroorganizmów planktonicznych oraz skupiają się na organizmach wskaźnikowych, takich jak np. E.coli [6, 2]. Metody molekularne również nie są powszechnie stosowane w tej dziedzinie, przede wszystkim ze względu na problemy z pozyskaniem materiału badawczego [1]. Większość rozpoznanych do tej pory bakterii należy do typu Proteobacteria, Actinobacteria, Firmicutes i Bacteroidetes [9, 11]. Stwierdzono również, że wśród organizmów obecnych w sieci wodociągowej, zarówno wolno pływających jak i tworzących biofilm dominują przedstawiciele rodzaju Pseudomonas [4]. Analiza sekwencji 16S rdna zwiększa wiedzę o bioróżnorodności mikroorganizmów w sieci wodociągowej. Badania oparte na reakcji PCR wykazały również obecność licznych sekwencji, związanych z nowymi grupami bakterii [13]. Zaletą zastosowania metod molekularnych do analizy gatunkowej biofilmu jest możliwość wykrycia niechorobotwórczych gatunków, które mogą się rozmnażać w systemie dystrybucji wody [7]. Klasyczne metody hodowli mikroorganizmów pozwalają na izolację tylko 1-10 % wszystkich mikroorganizmów ze środowiska [12]. Takie mikroorganizmy znajdują się w stadium VBNC (ang. viable but nonculturable) czyli są żywe, ale niehodowlane [8 10; 18]. Jedną z metod pozwalającą na szczegółową analizę i określenie składu gatunkowego jest metoda MIDI-FAME opracowana przez firmę Microbial ID (Newark, USA) wdrożona do praktyki laboratoryjnej w 1985 roku [14]. Podstawą tej analizy jest założenie, że skład komórkowych kwasów tłuszczowych jest cechą charakterystyczną dla danego gatunku/rodzaju [17]. Analiza kwasów tłuszczowych znalazła swoje zastosowanie w charakterystyce mikroorganizmów zasiedlających różnorodne środowiska, jak: gleba, wody słodkie, morskie osady, ale również środowiska działalności urbanistycznej: takie jak sieci wodociągowe i systemy oczyszczania ścieków [15]. Obecnie istnieją komercyjne bazy danych, które zawierają listę ponad 300 różnych kwasów tłuszczowych i ich pochodnych. Obecnie biblioteka systemu MIDI
Metody identyfikacji mikroorganizmów bytujących w biofilmach sieci wodociągowej 53 Sherlock pozwala na identyfikację około 1500 gatunków bakterii i 200 gatunków drożdży [19]. W pracy przedstawiono próbę identyfikacji jednego szczepu wyizolowanego z biofilmu sieci wodociągowej przy zastosowaniu różnych metod analitycznych. 2. MATERIAŁY I METODY 2.1. IDENTYFIKACJA WYBRANEGO SZCZEPU METODAMI KLASYCZNYMI I TESTAMI BIOCHEMICZNYMI Badany szczep został wyizolowany z błony biologicznej wrocławskiej sieci wodociągowej i wysiany na następujące podłoża mikrobiologiczne: SS (Salmonella, Shigella), ENDO (drobnoustroje fermentujące laktozę) i, MacConkey (bakterie gramujemne fermentujące laktozę), BCYE (bakterie z rodzaju Legionella), King B (wstępna identyfikacja Pseudomonas aeruginosa), Kalinienko (mikroorganizmy heterotroficzne żelaziste), Jacobsen (bakterie tionowe), Tauson (bakterie desulfurykacyjne), Scotten (bezbarwne bakterie siarkowe), Winogradski (bakterie żelaziste) oraz podłoże do hodowli mikroorganizmów manganowych. Dodatkowo przeprowadzono barwienie Grama oraz analizę testem Enterotest16. Zestaw umożliwia przeprowadzenie identyfikacji szczepów za pomocą szesnastu testów biochemicznych.dodatkowo oznaczono betagalaktozydazę i oksydazę. 2.2. IDENTYFIKACJA WYBRANEGO SZCZEPU METODAMI MOLEKULARNYMI Izolacja genomowego DNA została przeprowadzona z użyciem zestawu Extractme DNA Bacteria z zastosowaniem odrębnych protokołów dla bakterii gramujemnych i gramdodatnich. Kontrola jakości wyizolowanego DNA została przeprowadzona w 1% żelu agarozowym. Następnie otrzymany produkt poddano amplifikacji ze starterami 9F 5 -GAG TTT GAT CCT GGC TCA G-3 ; 1512R 5 -ACG GCT ACC TTG TTA CGA CTT-3. 25 µl mieszaniny reakcyjnej zawierało 0,5 µl wyizolowanego DNA, 2,5 µl 10xbuforu PCR (100mM Tris-HCl, ph = 9, 15 mm MgCl 2 i 500 mm KCl), po 1 µl każdego startera (10 µm), 1 µl dntp, 0,25 U polimerazy TaqI i sterylną wodę dejonizowaną. Reakcja PCR została przeprowadzona według poniższego schematu (Tab.1):
54 I. BIEDROŃ i in. Tab.1. Zestawienie wyników analizy mikrobiologicznej badanego szczepu Etap Temperatura [⁰C] Czas trwania [s] Liczba cykli Początkowa denaturacja 95 300 1 Denaturacja 95 60 Hybrydyzacja 52 60 30 Elongacja 72 120 Elongacja 72 240 1 Otrzymany fragment o wielkości około 1500 pz mieści się w rejonie genu kodującego podjednostkę rybosomalną 16S. Mieszaninę reakcyjną rozdzielono w 1,5% żelu agarozowym, w celu kontroli jakości amplifikowanego produktu. Następnie produkt PCR został wycięty z żelu i oczyszczony zestawem ExtractMe DNA Gel-Out. Otrzymane produkty PCR zostały zsekwencjonowane przy użyciu analizera 3730 XL DNA. Uzyskane wyniki zostały analizowane z wykorzystaniem bazy danych NCBI oraz programu BLAST i CLC DNA Workbench 6. 2.3. IDENTYFIKACJA METODĄ MIDI-FAME W celu izolacji kwasów tłuszczowych odważano 40-45 mg hodowli bakteryjnej w probówkach firmy Pyrex o objętości 30 ml. Do próbki wprowadzano 1 ml odczynnika R1 (mieszanina 45 g NaOH, 150 ml wody destylowanej, 150 ml CH 3 OH), a następnie mieszano przez 10-20 sekund. Saponifikacja, prowadzi do lizy komórek bakteryjnych i uwolnienia z lipidów kwasów tłuszczowych oraz przekształcenia ich w sole sodowe. Następnie zawartość probówek ogrzewano w łaźni wodnej o temperaturze 100⁰C przez 30 minut. Po tym czasie próbki ochładzano, a następnie dodano 2 ml odczynnika R2 (325 ml 6 N HCl, 275 ml CH 3 OH), co prowadziło do powstania lotnych pochodnych estrów metylowych uwolnionych kwasów tłuszczowych (FAMEs). Po dodaniu odczynnika R2 próby mieszano przez 10-20 sekund i inkubowano ponownie w łaźni wodnej o temperaturze 80⁰C przez 10 minut. Ekstrakcji dokonano przez wprowadzenie do probówek 1,25 ml odczynnika R3 (200 ml C 6 H 14, 200 ml CH 3 OC(CH 3 ) 3 ) i delikatne mieszanie ich zawartości przez 10 minut. Na tym etapie następuje przeniesienie FAMEs z fazy wodnej (dolnej) do organicznej (górnej). Po rozdzieleniu się faz zbierano górną fazę organiczną i przenoszono do nowych probówek. Próbki przemywano 3 ml odczynnika R4 (10,8 g NaOH, 900 ml H 2 O (d) ), w celu usunięcia wolnych, niezmetylowanych kwasów tłuszczowych i delikatnie mieszano przez 5 minut. Kiedy pojawiała się emulsja dodawano kilka kropli nasyconego roztworu chlorku sodu i ponownie delikatnie mieszano. Górną fazę organiczną, zawierającą ekstrakt kwasów tłuszczowych, przenoszono do szklanych naczynek chromatograficznych o objętości 2 ml.
Salmonella, Shigella Bakterie fermentujące laktoze Gramujemne drobnoustroje fermentujące laktozę Bakterie z rodzaju Legionella Pseudomonas aeruginosa Bakterie żelaziste - heterotrofy Bakterie tionowe Bakterie desulfurykacyjne Bezbarwne bakterie siarkowe Bakterie żelaziste Bakterie manganowe Metody identyfikacji mikroorganizmów bytujących w biofilmach sieci wodociągowej 55 Otrzymaną mieszaninę estrów metylowych kwasów tłuszczowych (FAMEs) rozdzielano z użyciem chromatografu gazowego Hawlett-Packard 6890, z kapilarną kolumną fenylo-metylo-krzemionkową i detektorem płomieniowo-jonizacyjnym FID. Do identyfikacji kwasów wykorzystano oprogramowanie Sherlock firmy MIDI Inc. w wersji 6.1. 3. WYNIKI BADAŃ 3.1. IDENTYFIKACJA METODAMI KLASYCZNYMI W wyniku barwienia Grama, badany szczep został określony jako gramujemna pałeczka, posiadająca zdolność fermentacji laktozy Wyniki posiewów na podłoża różnicujące i wybiórcze zebrano w tabeli 2. Na podłożu ENDO zaobserwowano wzrost metalicznych kolonii, morfologicznie podobnych do kolonii E.coli. Odnotowano również wzrost badanego szczepu na podłożu BCYE, co może wskazywać, że badany organizm należy do rodzaju Legionella. Badany szczep utlenia mangan oraz wykazuje cechy żelazistych heterotrofów. Tab.2. Zestawienie wyników analizy mikrobiologicznej badanego szczepu Badany szczep - + + + - + - - - - + Na podstawie testu biochemicznego stwierdzono, że badany szczep przeprowadza dekarboksylację lizyny i ornityny oraz rozkłada mocznik. Ponadto wykorzystuje cytrynian sodu jako jedyne źródło węgla, wykazuje również aktywność oksydazową. Zastosowana tradycyjna metoda hodowli i identyfikacji na podłożach mikrobiologicznych oraz podstawowe testy biochemiczne nie pozwoliły na określenie gatunku ani rodzaju badanego szczepu.
56 I. BIEDROŃ i in. 3.2. IDENTYFIKACJA METODAMI MOLEKULARNYMI Na podstawie otrzymanych sekwencji produktu PCR, została przeprowadzona analiza przy użyciu bazy danych NCBI. Najwyższą punktację trafności dopasowania sekwencji miały szczepy Tetrathiobacter kashmirensis, Advenella incenata i Alcaligenes sp (Rys.1, 2). z podobieństwem sekwencji 99%. Niejednoznaczność przyporządkowania gatunkowego wynika z bardzo wysokiego stopnia podobieństwa genu 16S tych gatunków. Rys.1. Wyniki analizy programem NCBI BLAST dla badanego szczepu zamplifikowanego w rejonie 16S z wykorzystaniem startera forward. Rys.2. Wyniki analizy programem NCBI BLAST dla badanego szczepu zamplifikowanego w rejonie 16S z wykorzystaniem startera reverse. Ze względów na brak jednoznacznego przyporządkowania gatunkowego, otrzymane sekwencje zostały porównane z sekwencjami regionu 16S rdna gatunków wskazanych przez NCBI przy użyciu programu CLC DNA Workbench 6. W wyniku analizy porównawczej wyszczególniono różnice w sekwencji wykluczające Alcaligenes sp. (niezgodność w obrębie 3 nukleotydów) i T. kachmirensis (niezgodność w obrębie 2 nukleotydów) (Rys.3). Rys.3. Przykładowy fragment analizy programem CLC Workbench 6 z zaznaczoną jedną różnicą w sekwencji regionu 16S rdna między gatunkiem T. kachmirensis. a badanym szczepem. Badany szczep można przypisać do gatunku A. incenata. Należy jednak pamiętać, że różnica kilkunukleotydowa nie daje 100% pewności przyporządkowania gatunkowego, gdyż może ona wynikać ze zmienności genetycznej w tym regionie typowej dla danego gatunku.
Zawartość kwasów tłuszczowych [%] Metody identyfikacji mikroorganizmów bytujących w biofilmach sieci wodociągowej 57 3.3. IDENTYFIKACJA METODĄ MIDI-FAME 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Komórkowe kwasy tłuszczowe Nienasycone Prostołancuchowe Inne Wyk. 1. Zawartość komórkowych kwasów tłuszczowych. Stwierdzono, iż największy procent komórkowych kwasów tłuszczowych stanowiły kwasy nienasycone (61,20 %), spośród nich najwięcej wyizolowano16:1 ω7c/16:1 ω6c(33,76 %) i 18:1 ω7c (24,19 %). Natomiast wśród nasyconych kwasów tłuszczowych dominował prostołańcuchowy kwas 16:0 (25,48 %) (Wyk.1.).Analiza porównawcza wyizolowanych FAMEs z bazą Sherlock przypisała badany szczep do gatunku Pectobacterium-carotovorum-carotovorum z pradopodobieństwem równym 0,5659 lub do Pantoea-agglomerans-GC subgroup C (indeks prawdopodobieństwa =0,4791). 4. WNIOSKI Szczep Advenella incenata jest stosunkowo słabo poznanym gatunkiem bakterii. Szczep ten należy do rodziny Alcaligenacea, subklasy ẞ-Proteobacteria. Analiza kwasów tłuszczowych, jak również testy biochemiczne pokrywają się z danymi literaturowymi, [3]. Jednak brak danych odnośnie tego mikroorganizmu w bazie danych Sherlock jak i również w książce kodów uniemożliwiło jego bezpośrednią identyfikację tymi metodami. Przeprowadzone analizy potwierdzają założenia Kormasa [7] i Martiny ego [11], że na dzień dzisiejszy posiadamy bardzo ograniczoną wiedzę odnośnie ekosystemów tworzących się w sieciach wodociągowych. Praca wykonana w ramach projektu MNiSW pt. Bioróżnorodność i kinetyka tworzenia obrostów biologicznych na materiałach technicznych nr rej.: NN523 751004.
58 I. BIEDROŃ i in. LITERATURA [1] BERRY D., XI C., RASKIN L., Microbial ecology of drinking water distribution system, Current Opinion in Biotechnology, 2006, Vol. 17, 297-302. [2] BURTSCHER M., ZIBUSCHKA F., MACH R., LINDER G., FARNLEITNER A., Heterotrophic plate count vs. in situ bacterial 16S rrna gene amplicon profiles from drinking water reveal completely different communities with distinct spatial and temporal allocations in a distribution net, Water SA, 2009, Vol. 35, 495-504. [3] COEYNE T., VANLAERE E., SAMYN E., FALSEN E., LARSSON P., VANDEMME P., Advenella incenata gen. nov., sp. nov., a novel member of the Alcaligenaceae, isolated from varius clinical samples, IJSEM, 2005, Vol. 55, 251-256. [4] DOUTERELO I., SHARPE R., BOXALL J., Influence of hydraulic regimes on bacterial community structure and composition in an experimental drinking water distribution system, Water Research, 2013, Vol. 47, 503-506. [5] ELHARIRY H., GHERBAWY Y., EL-DEEB B., ALTALHI A., Molecular Identification and Biofilm-Forming Ability of Culturable Aquatic Bacteria in Microbial Biofilms Formed in Drinking Water Distribution Networks, Geomicrobiology Journal, 2012, Vol. 29, 561-569. [6] HENNE K., KAHLISCH L., BRETTAR I., HOFLE M., Analysis of structure and composition of bacterial core communities in mature drinking water biofilms and bulk water of citywide network in germany, Applied and Environmental Microbiology, 2012, Vol. 78, 3529-3538. [7] KORMAS K., NEOFITON C., PACHIADAKI M., KOUFOSTATHI E., Changes of the bacerial assemblages throughout an urban drinking water distribution system, Environ. Monit. Assess, 2010, Vol. 165, 27-38. [8] KOZDRÓJ J., Microflora of technogenous wastes characterized by fatty acid analysis, Appl. Environ. Microbiol., 2000, Vol. 60, 149-156. [9] LIN W., YU Z., CHEN X., LIU R., ZHANG H., Molecular characterization of natural biofilms from household taps with different materials: PVC, stainless steel, and cast iron in drinking water distribution system., Appl. Microbiol. Biotechnol., 2012, published online. [10] LITTLEFIELD-WYER J.G., BROOKS P., KATOULI M., Application of biochemical fingerprinting and fatty acid methyl ester profiling to assess the effect of the pesticide Atradex on aquatic microbial communities, Environ. Pollut., 2008, Vol. 153, 393-400. [11] MARTINY A., ALBRECHTSEN H., ARVIN E., MOLIN S., Identification of Bacteria in Biofilm and Bulk Water Samples from a Nonchlorinated Model Drinking Water Distribution System: Detection of a Large Nitrite Oxidizing Population Associated with Nitrospira spp., Applied and Environmental Microbiology, 2005, Vol. 71, No. 12, 8611-8617. [12] PIOTROWSKA-SEGET Z., MROZIK A., Signature lipid biomarker (SLB) analysis in determining changes in community structure of soil microorganisms, Pol. J. Environ. Stud., 2003, Vol. 12, 669-675. [13] REVETTA R., MATLIB R., SANTO DOMINGO J., 16S rrna gene sequence analysis of drinking water using RNA and DNA extracts as targets for clone library development, Curr. Microbiol., 2011, Vol. 63, 50-59. [14] SASSER M., Identification of bacteria by gas chromatography of cellular fatty acids, MIDI Technical Note 101 Microbial ID, Inc., Newark, DE. USA, 1990. [15] TIMKE M., WANG-LIEU N., ALTENDORF K., LIPSKI A., Fatty acid analysis and spoilage potential of biofilms from two breweries, Journal of Applied Microbiology, 2005, Vol. 99, 1108-1122. [16] WINGENDER J., FLEMMING H., Biofilms in drinking water and their role as reservoir for pathogen, International Journal of Hygiene and Environmental Health., 2011, Vol. 214, 417-423.
Metody identyfikacji mikroorganizmów bytujących w biofilmach sieci wodociągowej 59 [17] ZELLES L., Fatty acid patterns of phospholipids and lipopolysaccharides in the characterization of microbial communities in soil: a review, Biol. Fertil. Soils, 1999, Vol. 29, 111-129. [18] ZHANG S.,YU X., SHI X., WEI B., YE L.,., PLFA profiles of drinking water biofilters with different acetate and glucose loadings, Ecotoxicology, 2009, Vol. 18, 700-706. [19] www.midi-inc.com METHODS FOR IDENTIFICATION OF BACTERIA FOUND IN BIOFILMS FROM DRINKING WATER DISTRIBUTION SYSTEM Biofilms exist in every drinking water distribution system. Its presence is important for public health, because it can be habitat for many of potentially pathogenic microorganisms. Classic plate count method gives very limited information about biodiversity of microorganisms inhabiting water supply network. The use of more advanced techniques (molecular identification, MIDI-FAME) give ability to detect nonpathogenic species which can reproduce in the water distribution system. This paper presents a comparison of the effects of the different identification methods (classical, molecular and biochemical) of the microorganism isolated from the drinking water distribution system.