OGÓLNA CHARAKTERYSTYKA WYBRANYCH SZCZEPÓW DROŻDŻY I PLEŚNI WYIZOLOWANYCH Z SADU ŚLIWOWEGO Paweł Satora, Tadeusz Tuszyński Katedra Technologii Fermentacji i Mikrobiologii Technicznej Akademia Rolnicza, al. 29 listopada 46, 31-425 Kraków e-mail: psatora@ar.krakow.pl; rrtuszyn@cyf-kr.edu.pl WSTĘP W naturalną fermentację moszczów i zacierów owocowych zaangażowane są liczne gatunki drożdży i pleśni występujące na powierzchni owoców. Cały proces rozpoczynają najczęściej drożdże dzikie należące do rodzajów Kloeckera i Hanseniaspora oraz inne o niższej aktywności fermentacyjnej tj. Candida i Pichia. Mikroorganizmy te giną przy podwyższonym stężeniu etanolu. W takim środowisku zaczynają przeważać szczepy z gatunku Saccharomyces cerevisiae, o większej tolerancji na alkohol i jednocześnie posiadające zdolność do jego produkcji (Gafner, 1996; Sipiczki, 2001). Wytwarzane przez drobnoustroje związki chemiczne tj. alkohole, kwasy organiczne, związki karbonylowe, estry i inne, w sposób bezpośredni wpływają na bukiet smakowo-zapachowy produktu finalnego. Przykładem procesu fermentacji spontanicznej owoców śliwy Węgierki Zwykłej jest Śliwowica Łącka. Napój ten, o mocy zwykle powyżej 70% obj., posiada charakterystyczny, wyraźnie owocowy aromat. Wytwarzany jest poza obrotem ewidencjonowanym, w okolicach Łącka od wielu dziesiątek lat, a technologia produkcji przekazywana jest z pokolenia na pokolenie. Prawidłowy dobór szczepów i odpowiednie ich zestawienie tak, aby wytwarzały naturalny, symbiotyczny układ ekologiczny, pozwoliłoby uzyskać kulturę, która w warunkach przemysłowych tworzyłaby korzystne metabolity w odpowiednich ilościach, co z kolei byłoby gwarancją wysokiej i powtarzalnej jakości śliwowicy. Niniejsza praca jest kontynuacją badań mających za zadanie scharakteryzowanie mikroflory występującej w sadzie śliwy Węgierki Zwykłej z okolic Łącka, skąd owoce są wykorzystywane do produkcji Śliwowicy Łąckiej. Celem analiz było określenie zdolności fermentacyjnych wybranych szczepów drożdży i pleśni wyizolowanych z sadu śliwowego. W przefermentowanych roztworach modelowych badano przyrost biomasy, zawartość etanolu oraz innych ubocznych produktów fermentacji, które w procesie destylacji mogą przechodzić do destylatu.
METODYKA Wstępnej selekcji mikroorganizmów dokonano przy pomocy odpowiednich testów z wykorzystaniem różnych cukrów (Barnett, Payne, 1986). Do dalszych analiz użyto 5 szczepów fermentujących: - Candida famata - Candida pulcherrima - Candida edax - Hansenula anomala - Rhizopus nigricans - Aureobasidium sp. Kultury Rhizopus sp., Aureobasidium sp., Candida famata i Candida pulcherrima zostały wyizolowane z powierzchni owoców, Hansenula anomala z gleby, a szczep Candida edax z powietrza. Fermentację prób prowadzono w roztworach modelowych zawierających 10% roztwór glukozy (Romano i in., 1996). Nastaw wyjaławiano i zachowując warunki sterylne szczepiono dwudniową kulturą drożdży lub pleśni. Materiał szczepienny dodawany był w ilości 5 oczek ezy na 100 ml nastawu. Fermentację prób prowadzono w kolbach stożkowych o pojemności 300 ml, zabezpieczonych rurkami fermentacyjnymi (10 dni, temp. pokojowa). W przefermentowanych przez powyższe szczepy roztworach modelowych, badano przyrost biomasy, stopień wykorzystania źródła węgla, zawartość etanolu oraz niektóre komponenty składu jakościowego i ilościowego uzyskanych destylatów (chromatografia gazowa) tj. metanol, 1-propanol, butanol, izo-butanol, izo-pentanol, pentanol, heksanol, aldehyd octowy, aceton, kwas mrówkowy, kwas octowy, kwas propionowy, mrówczan etylu i octan etylu (Fabre i in., 1995). WYNIKI Badane szczepy mikroorganizmów charakteryzowały się zróżnicowanymi właściwościami fermentacyjnymi. Stosunkowo wysokiemu przyrostowi biomasy (Candida edax 0,73 g s.m./g zużytego cukru) towarzyszyła bardzo niska produkcja etanolu (0,15 g/100 ml nastawu). Pozostałe szczepy wytwarzały znacznie mniej biomasy, średnio około 0,2 g s.m./g zużytego cukru, natomiast charakteryzowały się lepszymi zdolnościami fermentacyjnymi (Candida pulcherrima 1,12 g etanolu/100 ml nastawu, Aureobasidium sp. 1,03 g/100 ml).
Cechą charakterystyczną destylatów uzyskanych z nastawów fermentowanych przez Candida pulcherrima i Hansenula anomala była wysoka zawartość octanu etylu (25 i 27 mg/l). Odmienny skład jakościowy i ilościowy destylatów stwierdzano w przypadku odfermentowania zacierów z udziałem Candida famata wyróżniały się obecnością butanolu i heksanolu oraz podwyższoną ilością mrówczanu etylu (2,6 mg/l). Wśród metabolitów Candida edax dominował kwas octowy (43,7 mg/l) i metanol (10,8 mg/l), jednocześnie inne związki, charakterystyczne dla procesu fermentacji, występowały w stosunkowo małych ilościach. Pleśnie Aureobasidium sp. i Rhizopus nigricans, w stosunku do badanych drożdży, wytwarzały znacznie mniej estrów i więcej alkoholi fuzlowych, z przeważającym udziałem propanolu.
Produkcja etanolu i biomasy 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 EtOh w g/g cukru Biomasa w g/g cukru 0,2 0,1 0 Candida famata Candida pulcherrima Candida edax Hansenula anomala Rhizopus nigricans Aureobasidium sp.
Produkcja fuzli 60 50 Stężenie [mg/l] 40 30 20 Candida famata Candida pulcherrima Candida edax Hansenula anomala Rhizopus nigricans Aureobasidium sp. 10 0 Propanol Izo-butanol Butanol Izo-penatnol Pentanol Heksanol
Produkcja innych produktów ubocznych 350 300 Stężenie [mg/l] 250 200 150 100 Candida famata Candida pulcherrima Candida edax Hansenula anomala Rhizopus nigricans Aureobasidium sp. 50 0 Aldehyd octowy Octan etylu Metanol Kwas octowy
WNIOSKI 1. Mikroorganizmy użyte do fermentacji roztworów modelowych (Candida famata, Candida pulcherrima, Hansenula anomala, Rhizopus nigricans, Aureobasidium sp) wytwarzają etanol oraz inne związki lotne i mają bezpośredni wpływ na skład chemiczny destylatów. Rodzaj mikroorganizmu istotnie determinuje zarówno ilość, jak i jakość powstających związków. 2. Drożdże Candida pulcherrima i pleśń Aureobasidium sp. wykazują stosunkowo wysoką zdolność odfermentowywania cukrów, wytwarzają odpowiednie ilości etanolu i mogą być stosowane do fermentacji zacierów owocowych, szczególnie śliwkowych. 3. Szczep Candida edax jest typowym przykładem drożdży paszowych. Przejawia się to intensywną biosyntezą biomasy oraz kwasu octowego. LITERATURA 1. Barnett J., Payne R.W. 1986. Yeast: characteristic and identification. Cambridge University Press, Cambridge. 2. Fabre C.E., Duviau V.-J., Blanc P.J., Goma G. 1995. Identification of volatile flavour compounds obtained in culture of Kluyveromyces marxianus. Biotechnol. Let. 17 (11), 1207-1212. 3. Gafner J. 1996. Die Hefeflora im Rebberg und wahrend der Weinbereitung. Agrarforschung 3 (8), 373-376. 4. Romano P., Suzzi G., Domizio P., Fatichenti F. 1996. Secondary products formation as a tool for discriminating non-saccharomyces wine strains. Antonie van Leeuwenhoek 74, 1-4. 5. Sipiczki M. 2001. Analysis of yeast derived from natural fermentation in Tokaj winery. Antonie van Leeuwenhoek 79, 97-105.