Zakażenia szpitalne. pod redakcją prof.dr hab.danuty Dzierżanowskiej

Zakażenia szpitalne pod redakcją prof.dr hab.danuty Dzierżanowskiej Rozdział 4. Suplement 4.4. Mechanizmy oporności na leki przeciwgrzybicze Ewa Romanowska.str.497 507 Wydawnictwo: α-medica press Bielsko Biała 2008

MECHANIZMY OPORNOŚCI DROŻDŻAKÓW NA LEKI PRZECIWGRZYBICZE WSTĘP W latach pięćdziesiątych ubiegłego wieku uzyskano pierwsze leki skuteczne w terapii zakażeń grzybiczych. Wiele potencjalnych miejsc docelowego działania antymikotyków posiada homologi o podobnej funkcji w tkankach gospodarza, zatem trudno jest zsyntetyzować takie leki przeciwgrzybicze, które nie wywołałyby działań ubocznych, w tym także toksycznych. Większość aktualnie stosowanych antymikotyków blokuje jeden z istotnych procesów, jakim jest synteza ergosterolu, głównego sterolu obecnego w błonie komórkowej grzybów. Wśród steroli, do których należy ergosterol, w tkankach zwierzęcych występuje cholesterol, do którego powinowactwo leków przeciwgrzybiczych jest około 100 razy mniejsze niż do ergosterolu. Stąd, leki przeciwgrzybicze, których mechanizm działania polega na blokowaniu ergosterolu, charakteryzują się potencjalną toksycznością narządową. Grzyby, podobnie jak większość patogenów człowieka, podlegają stałym zmianom ewolucyjnym, a ich zdolności adaptacyjne prowadzą między innymi do rozwoju lekooporności. Rozwój lekooporności na leki przeciwgrzybicze wiąże się ze stale wzrastającym ich zużyciem w terapii. Pierwsze doniesienia dotyczące oporności drożdżaków z rodzaju Candida na azole (ketokonazol) pojawiły się w latach osiemdziesiątych, wkrótce po pojawieniu się epidemii AIDS. Wiadomo bowiem, że chorzy na AIDS przewlekle przyjmują leki przeciwgrzybicze (flukonazol). OPORNOŚĆ NA LEKI PRZECIWGRZYBICZE PODZIAŁ OPORNOŚCI U GRZYBÓW Lekooporność na leki przeciwgrzybicze dzieli się na pierwotną, czyli naturalną, polegającą na oporności na określony mikotyk przed jego włączeniem do terapii oraz oporność wtórną, czyli nabytą, która rozwija się w odpowiedzi na ekspozycję na lek. Inny podział lekooporności na leki przeciwgrzybicze to: oporność in vitro i in vivo. Lekooporność in vitro jest pomiarem laboratoryjnym, zaś oporność in vivo oznacza stabilizację lub postęp zakażenia pomimo stosowania leku w terapii. 2

OPORNOŚĆ PIERWOTNA (naturalna) W tabeli 1 przedstawiono przykłady pierwotnej oporności grzybów na leki przeciwgrzybicze. Tabela 1. Pierwotna oporność in vitro na leki przeciwgrzybicze. LEK PRZECIWGRZYBICZY AMFOTERYCYNA B GRZBY NATURALNIE OPORNE Candida lusitaniae, Candida guilliermondii, Trichosporon beigelii, Aspergillus terreus, Aspergillus flavus (sporadycznie) Scedosporium sp.(szczególnie S. apiospermum), Pseudoallescheria boydii, Fusarium sp, Scopuliaropsis dermatiaceous FLUCYTOZYNA Candida albicans, non- albicans Candida, Cryptococcus neoformans, Aspergillus sp., grzyby dimorficzne FLUKONAZOL Candida dubliniensis, Candida krusei, Candida glabrata, Candida inconspicua, Candida norvegensis, Aspergillus sp. KASPOFUNGINA Trichosporon beigelli, Cryptococcus sp., Zygomycetes, Fusarium sp. OPORNOŚĆ WTÓRNA (nabyta) Lekooporność nabyta pojawia się jako skutek wielu procesów genetycznych oraz selekcji wariantu opornego pod wpływem stosowanego leczenia. MECHANIZMY OPORNOŚCI Candida spp. i non-candida spp. Mechanizmy nabytej lekooporności na leki antymykotyczne są złożone i różnorodne. W tabeli 2 przedstawiono najważniejsze grupy leków przeciwgrzybiczych, ich mechanizm działania oraz mechanizm oporności. Ryc.1 prezentuje schemat biosyntezy ergosterolu z zaznaczonymi miejscami działania leków. 3

Tabela 2. Leki przeciwgrzybicze, mechanizm ich działania oraz mechanizmy oporności wśród Candida spp. i non-candida spp. LEKI MECHANIZM DZIAŁANIA MECHANIZM OPORNOŚCI POLIENY Wiązanie i interakcje z ergosterolem oraz Zmienność w swoistych etapach biosyntezy ergosterolu Amfoterycyna B destabilizacja funkcji błony komórkowej grzyba; Zmniejszenie interkalacji leku z błoną komórki. Formy lipidowe i zwiększenie przepuszczalności błony komórkowej Zmienności w składzie steroli i fosfolipidów błony komórkowej liposomalne amfoterycyny wobec jedno i dwuwartościowych kationów, co Zwiększenie aktywności katalazy Liposomalna nystatyna prowadzi do śmierci komórki. ANALOGI Osłabienie syntezy kwasów nukleinowych poprzez Zmniejszenie przyswajania 5 fluorocytozyny PIRYMIDYNY tworzenie toksycznych, fluorowych Zmniejszenie tworzenia toksycznych antymetabolitów (FLUOROPIRYMIDYNY) antymetabolitów pirymidyny. Zmniejszenie ilości permeazy, deaminazy cytozyny lub 5 fluorocytozyna Flucytozynę dociera do wnętrza wrażliwej fosforybozlotransferazy uracylu flucytozyna komórki grzyba dzięki permeazie cytozyny; Dimorfizm genu FCY1 następuje jej deaminacja do aktywnej formy -5- fluorocytozyny (dzięki deaminazie cytozyny) która osłabia syntezę DNA i RNA. AZOLE flukonazol itrakonazol Hamowanie demetylazy 14 α lanosterolu cytochromu P450; akumulacja lanosterolu prowadząca do zaburzeń w błonie komórkowej. Wzmocnienie przepływu leków poprzez zwiększoną regulację genów transporterów lekowych; zwiększona transkrypcja genów CaMDR1, CDR1, CDR2. worykonazol posakonazol Zmienności w miejscu docelowego działania leków poprzez pojawienie się mutacji (mutacja w 14αdemetylazie P450), prowadząca do słabszego wiązania leku z miejscem docelowym Zmienności w określonych etapach biosyntezy ergosterolu. Nadekspresja miejsca docelowego; akumulacja alternatywnych steroli Mutacje punktowe w genie ERG11, mutacje genu ERG3, ECHINOKANDYNY kaspofungina mikafungina Hamowanie enzymu procesu syntezy ściany komórkowej syntazy β 1,3-glukanu, prowadzące do zwiększenia wrażliwości ściany komórkowej na lizę osmotyczną. zwiększona transkrypcja genu ERG11 NIEZNANE 4

Oporność na polieny. Mechanizmy oporności na polieny są gorzej poznane niż oporność na azole. Rozwój lekooporności na amfoterycynę B wśród izolatów klinicznych jest zjawiskiem niecodziennym. Niektórym badaczom udało się jednak opisać oporność in vitro. Istotą oporności są mutacje, które prowadzą do zmiany w strukturze glukanu ściany komórkowej, a tym samym do zaburzeń przepuszczalności dla amfoterycyny B. Inny mechanizm oporności na polieny polega na zmniejszeniu zawartości ergosterolu w błonie komórkowej grzybów i zastępowaniu go przez inne sterole, o mniejszym powinowactwie do polienów. Amfoterycyna B i inne polieny wiążą ergosterol błony komórkowej grzyba, czego efektem jest pojawianie się porów (dziur w błonie komórkowej) i wycieku zawartości cytoplazmy. Ważnym enzymem biorącym udział w biosyntezie ergosterolu w komórkach grzybów oraz biosyntezie cholesterolu ssaków jest zależna od cytochromu P450 demetylaza 14α-sterolu (P450DM). Oporność amfoterycyny B może być także wynikiem zaburzonej biosyntezy ergosterolu, skutkującym obniżeniem ilości ergosterolu. Zmiany w składzie fosfolipidów błony komórkowej grzyba także mogą mieć związek ze zmniejszeniem wrażliwości na polieny. Ogólne mechanizmy genetyczne determinujące oporność na polieny przeciwgrzybicze nie zostały wyczerpująco przebadane. Oporność na amfoterycynę B jest rzadka, ale została udokumentowana dla takich gatunków jak: Scedosporium prolificans, Pseudoallescheria boydii, Candida lusitaniae, Candida guillermondi oraz Candida tropicalis. Ryc.1 Schemat biosyntezy ergosterolu i miejsca docelowego działania leków przeciwgrzybiczych 5

Mechanizmy oporności na azole. Azole działają wyłącznie poprzez hamowanie syntezy ergosterolu zależnej od P450DM, co powoduje wzrost 24α-metylosteroli w komórce grzyba. W konsekwencji tych zaburzeń dochodzi do zahamowania czynności życiowych komórki grzyba. Najczęstszym mechanizmem oporności na azole jest, zmiana w składzie steroli błony komórkowej poprzez mutacje w 14α demetylazie cytochromu P450 (P450DM). Oporność na flukonazol została szeroko przebadana na poziomie molekularnym zwłaszcza wśród szczepów Candida albicans. Najczęstszymi mechanizmami oporności na azole są: zmiany polegające na czynnym usuwaniu leku z komórki (efflux) przez białka, tzw. transportery błonowe brak lub osłabienie penetracji leku powstałe w wyniku defektów przepuszczalności komórki drożdżaków w powiązaniu ze zmianami w składzie steroli i fosfolipidów defekty P450DM zmiany, jakim ulega lek wewnątrz komórki patogenu W przypadku pierwszego mechanizmu, zgodnie z opinią wielu naukowców, istotą oporności są zmiany w swoistych białkach transportowych, pełniących funkcję pompy ( drug efflux pumps). Białka te pełnią funkcję regulującą transport i determinują wpływ i wypływ leku z komórki. Innymi słowy, białka transportujące biorą udział w zależnym od energii mechanizmie przepływu. Ten mechanizm oporności na azole wydaje się dominować wśród Candida spp. Zidentyfikowano dwa geny BENr i CDR1 kodujące białka, mające swój związek z zależnym od energii przepływem leków. Nadekspresja białek kodowanych przez te geny powoduje wzrost wypływu antymykotyków u różnych gatunków grzybów. Mutacje w genach regulujących transport azoli do komórki prowadzą do rozwoju oporności na tę grupę leków. Zmiany genetyczne w komórce drożdżaków, a mianowicie zwiększona transkrypcja genów CaMDR1, CDR1, CDR2, prowadzą do wzmocnienia przepływu leków przez błonę komórkową. Wymienione geny są genami oporności lekowej, należącymi właśnie do rodziny genów transporterów ABCT. Inny mechanizm, to hamowanie demetylazy 14 α lanosterolu cytochromu P450. Doprowadza to do zaburzeń szlaku biosyntezy ergosterolu i powoduje akumulację lanosterolu prowadzącą do powstania zmian w błonie komórkowej, w tym akumulacji alternatywnych steroli. Mutacja punktowa w genie ERG11 oraz jego zwiększona transkrypcja, a także mutacja genu ERG3, 6

prowadzą do pojawienia się mutacji w P450DM. Wiąże się to z późniejszym, słabszym wiązaniem leku z miejscem docelowym. Mimo że ekspresja białek- transporterów błonowych, odpowiedzialnych za przepływ leku, uważana jest za najważniejszy mechanizm oporności, pojedynczy mechanizm nie jest wyłącznie odpowiedzialny za powstanie oporności na leki wśród grzybów. Oporność może być wynikiem wielu genetycznych bądź fenotypowych adaptacji i może być charakterystyczna dla określonego gatunku. W dodatku, brak wrażliwości na jeden azol może, lecz nie zawsze musi przełożyć się na oporność krzyżową na inne leki w tej klasie. Oporność wieloazolowa pojawia częściej wśród szczepów cechujących się ekspresją genu CDR1. W odróżnieniu od bakterii, grzyby nie są zdolne do przenoszenia genów oporności z jednego gatunku na drugi. Rozprzestrzenianie oporności jest więc znacznie wolniejsze i zależy w pewnym stopniu od wpływu terapii na indukowanie mutacji, bądź ujawnienie wcześniej tłumionych genów oporności wewnątrz danego szczepu grzybów. Jak wspomniano wcześniej, główną tarczą w komórkach grzybów, na który działają azole, jest cytochrom P450 (Erg11p) biorący udział w procesie demetylacji cząsteczki lanosterolu w pozycji 14α. Etap ten jest niezbędny do biosyntezy ergosterolu, utrzymującego prawidłowe funkcje błony komórkowej grzybów. Hamowanie aktywności Erg11p przez azole prowadzi do wyczerpywania i akumulacji 14-α- metylowych steroli (lanosterol i 14-α-metylo-3-6-diol). Oba procesy doprowadzają do śmierci komórki, jednak nie u wszystkich gatunków grzybów. Azole wyższych generacji (itrakonazol oraz nowe, jak: worykonazol i posakonazol) wywierają efekt grzybobójczy nawet u Cryptococcus neoformans i Aspergillus fumigatus. 7

Ryc.2. Schemat czterech mechanizmów oporności wtórnej wśród drożdżaków eksponowanych na działanie azoli. I - Nadekspresja CYP51A1: wyższe stężenia azoli są potrzebne do związania wszystkich cząsteczek CYP51A1 obecnych w komórkach; II - Mutcja CYP51A1: zmiana struktury miejsca aktywnego CYP51A1 obniża powinowactwo do azoli; III - Wzmocniony wypływ azoli z komórki; wielolekowe transportery wypływu należące do dwóch rodzin (transportery ABC i MF-Main Facilitators) ulegają nadekspresji i następuje zmniejszenie stężenia azoli wewnątrz komórki; IV - Zmiana szlaku biosyntezy ergosterolu: Δ 5,6 desaturaza sterolu kodowana przez ERG3, katalizuje tworzenie toksycznego metabolitu 14α-metylergosta-8,24(28)-dien- 3β,6α-diolu z 14α-metylfekosterolu, który akumuluje się w następstwie hamowania CYP51A1. 8

Innym, całkiem odmiennym mechanizmem oporności jest tworzenie przez patogeny grzybicze biofilmów na syntetycznych lub naturalnych powierzchniach. Biofilmy zorganizowane są jako gęste sieci zróżnicowanych komórek, na których może tworzyć się podłoże zewnątrzkomórkowej matrix. Stanowią fizyczną barierę przed skuteczną penetracją antymykotyków, co może tłumaczyć to, że komórki grzybów osadzone w tych strukturach mogą stać się oporne na ich działanie. Pomiar wrażliwości na leki przeciwgrzybicze w biofilmach Candida albicans lub Candida dubliniensis wykazał wysokie wartości MIC azoli i amfoterycyny. Jak opisano w przypadku Candida albicans, ekspresja genów odpowiedzialnych za rozwój lekooporności także może być zmieniona w biofilmach. Może przyczynić się do wysokiej oporności na azole mierzonej w populacji komórek biofilmu. Powinniśmy mieć na uwadze to, że biofilmy Candida mogą tworzyć się na każdym protetycznym materiale i mogą być powodem opóźnionego klirensu i powstawania oporności klinicznej w odpowiedzi na dany lek. Doprowadza to do niepowodzeń w terapii i konieczności usunięcia cewnika (lub innego materiału) w przypadku kandydemii, nawet gdy uważamy, że odpowiedzialny za infekcję gatunek Candida jest w pełni wrażliwy na lek in vitro. Oporność na echinokandyny. Mechanizmy lekooporności na echinokandyny nie zostały ostatecznie poznane, ze względu na krótkie stosowanie antymykotyków z tej grupy w terapii przeciwgrzybiczej. Brak aktywności kaspofunginy wobec Cryptococcus neoformans może być wynikiem niewielkiego powinowactwa leku do docelowego enzymu, jakim jest syntaza glukanu. Ostatnio odnotowano także zmniejszoną wrażliwość na kaspofunginę w izolatach klinicznych Candida albicans i Candida krusei. Mechanizm oporności w tym przypadku był identyfikowany jako mutacja w genie determinującym syntazę 1,3-β-D-glukanu, miejsce docelowego działania kaspofunginy w ścianie komórkowej grzyba. Późniejsze obserwacje wykazały, że niektóre szczepy Candida albicans, in vitro, są oporne na kaspofunginę, jednak mechanizm nie został wyjaśniony. (Thomas R. Rogers 2002; David A. Stevens i wsp. 2004) MECHANIZMY OPORNOŚCI Aspergillus spp. Grzyby pleśniowe są wrażliwe na polieny (deoksycholan amfoterycyny B, jego formy lipidowe, nystatyna i jej forma liposomalna), niektóre trójazole (itrakonazol, worykonazol, posakonazol), echinokandyny (kaspofungina, mikafungina, anidulafungina), alliloaminy 9

(terbinafina). W Tabeli 3 przedstawiono poznane mechanizmy oporności jakie można zaobserwować u najczęściej występującego patogenu pleśniowego Aspergillus fumigatus. W Tabeli 4 przedstawiono mechanizmy lekooporności reprezentowane przez inne niż Aspergillus fumigatus gatunki pleśni. 10

Tabela 3. Leki przeciwgrzybicze, mechanizm działania oraz mechanizmy oporności Aspergillus fumigatus powstałe w odpowiedzi na działanie lekami. leki. LEK MECHANIZM DZIAŁANIA MECHANIZM OPORNOŚCI POLIENY Amfoterycyna B Formy lipidowe Grzybobójczy Interakcja z ergosterolem Interkalacja błony grzybiczej, co prowadzi do wzrostu przepuszczalności kationów jedno- i dwuwartościowych, powodując śmierć komórki grzyba. Alternatywny mechanizm poprzez oksydację błony komórkowej grzyba Zmniejszenie dostępu AMB do miejsca wiązania leków w błonie grzyba - Zmiana składu ergosterolu i zmniejszona interkalacja - Zwiększenie sztywności ściany komórkowej? Zmniejszenie szkód oksydacyjnych: - Nadekspresja katalaz i supertlenkowej dysmutazy A. fumigatus? - Środowisko beztlenowe? Liposomalna nystatyna AZOLE itrakonazol worykonazol posakonazol(w trakcie badań) ECHINOKANDYNY Kaspofungina Mikafungina Anidulafungina w trakcie badań) ALLILAMINY Terbinafina Hamowanie P-450 14-a-DM (ERG11), akumulacja lanosterolu, co prowadzi do zaburzeń funkcjonalnych błony komórkowej grzyba Hamowanie syntezy glukanu ściany komórkowej, co prowadzi do wrażliwości na lizę osmotyczną Grzybostatyczny Hamowanie epoksyazy skwalenu (Erg1), prowadząc do wyczerpywania ergosterolu i akumulacji toksycznych pośredników steroli Zwiększenie przepływu leków Nadekspresja enzymu docelowego Zmniejszenie powinowactwa do miejsca wiążącego Zwiększenie regulacji homeostatycznych szlaków odpowiedzi na stres (HSP90, kalcyneuryny) Egzogenny import cholesterolu (obrona przed utratą ergosterolu) Zwiększenie regulacji homeostatycznych szlaków odpowiedzi na stres (HSP90, kalcyneuryny) Nadekspresja miejsca docelowego? Zwiększenie regulacji genów kodujących syntazę β-glukanu Nadekspresja genów biorących udział w transporcie składników ściany komórkowej? Zwiększenie effluksu? Nadekspresja miejsca docelowego (Erg1) Nadekspresja mono-oksygenazy salicylanu (degradacja leku) 11

Tabela 4. Mechanizmy oporności innych niż Aspergillus fumigatus gatunków pleśni. GATUNEK Aspergillus flavus Aspergillus terreus Aspergillus niger Aspergillus nidulans MECHANIZMY OPORNOŚCI Zwiększenie czynnego usuwania leków z komórki (zwiększona transkrypcja genu AflMDR1) Zmiany składu ściany komórkowej grzyba powiązane a opornością na AMB (prawdopodobna rola 1,3-α-glukanu?) Zmniejszenie składu steroli w błonie komórkowej prowadzi do powstania oporności na AMB HSP prowadzi do powstania oporności na echinokandyny Nadekspresja 14αDM włączonej w rozwój oporności NADPH- reduktaza cytochromu P450 (Cpr) może odgrywać rolę w powstawaniu oporności, prawdopodobnie poprzez zmianę składu ściany komórkowej Genetycznie wrażliwy model grzyba. Mechanizm oporności podobny jak u A. fumigatus Dosyć często obserwuje się kliniczną oporność na amfoterycynę B w trakcie terapii inwazyjnej aspergilozy (IA). Zaobserwowano to szczególnie w zakażeniach powodowanych przez Aspergillus terreus. Uważa się, że w błonie komórkowej tego patogenu jest znacznie mniej ergosterolu będącego celem działania polienów, niż w przypadku Aspergillus fumigatus. Zarówno pierwotna, jak i wtórna oporność na amfoterycynę B została zaobserwowana także w szczepach Aspergillus fumigatus, lecz warto dodać, że nie istnieje żadne powiązanie pomiędzy wrażliwością tego gatunku in vitro, a skutecznością in vivo. Stąd też oszacowanie prawdziwej oporności jest bardzo trudne. Mechanizmy oporności na amfoterycynę B u Aspergillus fumigatus nie zostały opisane w szczegółach. Częściej obserwuje się rozwój oporności podczas długotrwałej terapii azolami, które skutecznie doprowadzają do selekcji bardziej opornych szczepów. Poza tym, amfoterycyna B hamuje wzrost komórek grzybów poprzez interakcje fizyko-chemiczne, a nie hamowanie enzymów. Molekularne mechanizmy oporności Aspergillus fumigatus na trójazole i echinokandyny przedstawia Ryc. 3. 12

Ryc.3. Molekularne mechanizmy oporności Aspergillus fumigatus wobec triazoli i echinokandyny. 13

Odkryto, że istnieje znaczny nadmiar genów kodujących transportery przepływu u Aspergillus fumigatus. Uważa się, że jego genom zawiera co najmniej 49 genów rodziny transporterów ABC i 278 genów nadrodziny głównych czynników ułatwiających (MFS- Major Family Facilitators). Wśród klinicznych i laboratoryjnych szczepów Aspergillus fumigatus opornych na itrakonazol, zaobserwowano zwiększony wypływ, spowodowany wewnątrzkomórkowym stężeniem tego leku. Xiong i wsp. opisali nowy mechanizm oporności u Aspergillus fumigatus. Obecność surowicy lub cholesterolu w testowanym przez nich roztworze spowodowała znaczne osłabienie aktywności in vitro itrakonazolu wobec Aspergillus fumigatus. Jest to być może powiązane ze zdolnością importu i przyłączania przez ten patogen egzogennego cholesterolu do błony plazmatycznej w warunkach tlenowych. Ta akumulacja cholesterolu w błonie plazmatycznej może kompensować zanik ergosterolu po terapii triazolami, co stanowi mechanizm przetrwania Aspergillus fumigatus eksponowanych na te leki. Inny, nowy mechanizm oporności wykorzystuje HSP90 (białko szoku termicznego), molekularny chaperon, którego rola polega na składaniu, transporcie i dojrzewaniu kluczowych białek regulatorowych w warunkach indukowanego stresu. Odkryto, że rola HSP90 w oporności na leki pośredniczy w ścieżce kalcyneuryny. Wpływa to na wirulencję patogennych grzybów i umożliwia ich komórkom tolerowanie leków blokujących biosyntezę ergosterolu. Obecność inhibitorów HSP90 jest w stanie pokonać oporność u Candida albicans i Aspergillus terreus na azole i echinokandyny w warunkach in vivo. PODSUMOWANIE. STRATEGIE DOTYCZĄCE ZAPOBIEGANIA POWSTAWANIA OPORNOŚCI WŚRÓD PATOGENNYCH SZCZEPÓW GRZYBÓW. W odróżnieniu od bakterii, dla których istnieją wystandaryzowane metody do określenia wartości MIC i ustalone wartości MIC służące do interpretacji badań wrażliwości, w diagnostyce mikologicznej pozostają one nadal w sferze propozycji, badań i dość często mają charakter kontrowersyjny. Istnieją dwa typy lekooporności pierwotna i wtórna. Różne gatunki grzybów, a także różne szczepy tego samego gatunku cechują się odmienną wrażliwością. Antymykotyk użyty do eradykacji wrażliwego patogenu może zmienić florę 14

fizjologiczną gospodarza pozwalając tym samym na replikację mniej wrażliwego na leki przeciwgrzybicze szczepu. Najważniejszym czynnikiem powodującym powstanie oporności wśród grzybów jest wzrost użycia leków stosowanych w leczeniu grzybic układowych. Ze względu na ciężkość infekcji grzybiczych oraz trudności izolacji niektórych patogenów i ich identyfikacji, zdajemy sobie sprawę, że zmniejszanie użycia antymykotyków może nie być najlepszym rozwiązaniem narastania lekooporności. Należy się zatem skupić na optymalnej terapii i przede wszystkim na odpowiednim dawkowaniu leków przeciwgrzybiczych. Wydaje się, że słuszną strategią jest ograniczenie stosowania leków przeciwgrzybiczych stosowanych w leczeniu grzybic układowych podczas leczenia np. grzybicy skóry, czy błon śluzowych. W ten sposób zostanie zminimalizowany wpływ na fizjologiczną florę grzybiczą. Kliniczne niepowodzenie, będące odpowiedzią na terapię przeciwgrzybiczą może być wynikiem oporności mikrobiologicznej, bądź oporności klinicznej. Ta ostatnia związana jest z takimi czynnikami, jak:. farmakokinetyką leku (dawka, penetracja, stabilność, wiązanie z białkami, interakcja z innymi lekami, indywidualny wpływ na pacjenta) odpowiedzią immunologiczną pacjenta i/lub stanem zaawansowania choroby podstawowej właściwym postępowaniem z pacjentem (drenaż ropni, obecność cewników, zastawek) lokalizacją i ciężkością zakażenia zjadliwością patogenu i jego interakcją z organizmem gospodarza i lekami przeciwgrzybiczymi. Na zakończenie należy wspomnieć, że nie bez znaczenia w zapobieganiu rozprzestrzeniania się opornych szczepów pomiędzy pacjentami jest przestrzeganie odpowiednich zasad bezpieczeństwa i higieny wśród personelu medycznego, rodzin pacjentów i samych pacjentów. 15

PIŚMIENNICTWO 1. Bille J. Mechanisms and clinical significance of antifungal resistance. Int. Journal of Antim. Agents. 16, S331-S333, 2000. 2. Chamilos G., Kontoyiannis D. P.: update on antifungal drug resistance mechanisms of Aspergillus fumigatus. Drug Resistance Updates 8 (2005), S344-S358. 3. Chen J., Houmin L., Ruyou L., Dinfang B., Zhe W.: Mutations in the cyp51agene and susceptibility to itraconazole in Aspergillus fumigatus serially isolated from a patient with lung aspergilloma. J. Antimicrob. Chemoter. 55,S31-S37, 2005 4. Coven L. E., Lindquist S.: Hsp90 potentiates the rapid evolution of new traits: drug resistance in diverse fungi. Science 309, S2185-S2189, 2005. 5. Cowen L. E.: Predicting the emergence of resistance to antifungal drugs. Federation of European Microbiological Societies Microbiology Letters 204 (2001) 1-7. 6. da Silva Ferreira M. E., Capellaro J. L., dos Reis Marquez E., Malavazi I., Perlin D., Park S. I wsp.: In vitro evolution of itraconazole resistance in Aspergillus fumigatus involves multiple mechanisms of resistance. Antimicrob. Agents Chemioter., 48, S4405-S4413, 2004. 7. Dannaoui E., Meletiadis J., Tortorano A. M., Symoens F., Nolard N., Viviani M. A., Piens M. A., Lebeau B., Verweij P. E., Grillot R., RBGA Network: Susceptibility testing of sequential isolates of Aspergillus fumigatus recovered from treated patients. Journal of Medical Microbiology, 53, S129- S134, 2004. 8. Denning D. W., Venkateswarlu K., Oakley K. L., Anderson M. J., Manning N. J., Stevens D. A., Warnock D. W., Kelly S. L.: Itraconazole resistance in Aspergilus fumigatus. Antimicrob. Agents Chemother., 41, S1364-S1368, 1997b. 9. Denning D. W., Warn P.: Dose range evaluationof liposomal nystatin and comparisons with amphotericin B and amphotericin B lipid complex in temporarily neutropenic mice infected wih an isolate of Aspergillus fumigatus with reduced susceptibility to amphotericin B. Antymicrob. Agents Chemother., 43, S2592-S2599., 1999. 10. Diaz-Guerra T. M., Mellado E., Cuena-Estrella M., Rodriguez-Tudela J. L.:A point mutation in the 14alpha- sterol demethylase gene cyp51a contributes to itraconazole resistane in Aspegillus fumigatus. Antimicrob. Agents Chemother, 47, S1120-S1124, 2003. 11. Dzierżanowska Danuta Zkażenia grzybicze wybrane zagadnienia. Pod red Danuty Dzierżanowskiej. Wyd α-medica Press, 2006, S92-125. 12. Espinel-Ingroff A.: Clinical Relevance of Antifungal Susceptibility Testing and Antifungal Resistance. Clinical Microbiology Newsletter vol.22, No. 18, September 15, 2000, S137-S140. 13. Garcia-Effron G., Mellado E., Alcazar-Fuoli L., Buitrago M. J., Cuenca-Estrella M., Rodriguez J. L.: Role of Aspergillus fumigatus 14-alpha sterol demetylase (Cyp51b) gene on cell growth and viability, antifungal susceptibility and sterol composition. In 45 th Interscience Conference on Antimcrobial Agents and Chemotherapy (ICAAC),, Washington, DC, USA, Abstract#M-1591, 2005. 14. Gardiner R. E., Souteropoulos P., Park S., Perlin D. S.:Characterization of Aspergillus Fumigatus mutants with reduced susceptibility to caspofungin. Med. Mycol.43, S2999-S305, 2005. 15. Groll A. H., Kolve H.:Antifungal agents: in vivo susceptibilitytesting, pharmacodynamics, and prospects for combination therapy. European Journal of Infectious Diseases, 23, S256-S270, 2004. 16. Hachem R. Y., Kontoyiannis, D. P., BoktourM R., Afif C., Cooksley C., Bodey G. P. I wsp., Aspergillus terreus: an emerging amphotericin B- resistant opportunistic mold in paients with hematologic malignancies. Cancer 101, S1594-1600, 2004. 17. Hapala I., Klobucnikova V., Mazanova K., Kohut P.: Two mutants selectively resistant to polyenes reveal distinct mechanisms of antifungal activity by nystatin and amphotericin B. Biochem. Soc. Trans., 33, S1206-S1209, 2005. 18. Kartonis N., Nielsen J., Douglas C. M.: Caspofungin: the first in a new class of antifungal agents. Drug Resistance Update, 6, S197-S218, 2003. 19. Kelly S. L., Lamb D. C., Taylor M., Corran A. J., Baldwin B. C., Powderly W. G.: Resistance to amphotericin B associated with defective sterol delta 8-7 isomerase in Cryptococcus neoformans strain from an AIDS patient. FEMS Microbiol. Lett., 122, S39-S42, 1994. 20. Klepser M. E., Ernst E. J., Pfaller M. A.: Update on antifungal resistance. Trends in Microbiology vol. 5, No. 9, September 1997 S372-S375. 21. Kontoyiannis D. P., Bodey G. P.: Invasive Aspergillosis in 2002: an update. European Journal of Clinical Microbiology Infectious Disease vol. 21, S161-S172, 2002. 16

22. Kontoyiannis D. P., Lewis R. E., Sagar N., Prince R. A., Rolston K. V.: Itraconazole- amphotericin B antagonism in Aspergillus fumigatus: an E-test based strategy. Antymicrob. Agents Chemother., 44, S2915-S2918, 2000. 23. Kontoyiannis D. P., Lewis R. E.: Antifungal drug resistance of pathogenic fungi. Lancet, 359, S1135- S1144, 2002. 24. Kontoyiannis D. P.: Why prior flucoazole use is associatd with an increased risk of invasive mold infections in immunosupressed hosts: an alternative hypothesis. Clin. Infect. Dis., 34, S1281-S1283, 2002. 25. Lamb D., Kelly D., Kelly S.: Molecular aspects of azole antifungal action and resistance. Drug Resistance Update, 2, S390-S402, 1999. 26. Langfelder K., Gattung S., Brakhage A. A.: A novel method used to delete a new Aspergillus fumigatus ABC transporter gene. Current Genet., 41, S268-S274, 2002. 27. Lewis R. E., Prince R. A., Chi J., Kontoyinnis D. P.: Itraconazole preexposure attenuates the efficacy of subsequent amphotericin B therapy in murine model of acute invasive pulmonary aspergillosis. Antimicrob. Agents Chemother., 46, S3208-S3214, 2002. 28. Lionakis M. S., Lewis R. E., Torres H. A., Albert N. D., Raad I. I., Kontoyiannis D. P.: Increased frequency of non- fumigatus Aspergillus species in amphotericin B- or triazole- pre- exposed cancer patients with positive cultures for Aspergilli. Diagn. Microbiol. Inect. Dis., 52, S15-S20, 2005a. 29. Lupetti A., Danesi R., Campa M., Del Tacca M., Kelly S.: Molecular basis of resistance to azole antifungals. Trends in Molecular Medicine, vol.8, No:2, February 2002. 30. Manavathu E. K., Cutright J. L., Chandrasekar P. H.: In vivo resistance of laboratory- selected Aspergillus fumigas isolate to amphotericin B. Antimicrob. Agents Chemother., 49, S428-S430, 2005. 31. Manavathu E. K., Cutright J. L., Loebenberg D., Chandrasekar P. H.: A comparative study of the in vitro susceptibilities of clinical and laboratory-selected resistant isolates of Aspergillus spp. to amphotericin B, itraconazole, voriconazole and posaconazole (SCH 56592). J. Antimicrob. Chemother., 46, S229-S234, 2000. 32. Manavathu E. K., Vazquez J. A., Chandrasekar P. H.: Reduced susceptibility in laboratory selected mutants of Aspergillus fumigatus to itraconazole due to decreased intracellular accumulation of the antifungal agent. International Journal of Antimicrobial Agents, 12, S213-S219, 1999b. 33. Mann P. A., Parmegiani R. M., Wei S. Q., Mendrick C. A., Li X., Loebenberg D. i wsp.: Mutations in Aspergillus fumigatus resulting in reduced susceptibility to posaconazole appear to be restricted to a single amino acid in the cytochrome P450 14alpha- demethylase. Antimicrob. Agents Chemother., 47, S557-S581, 2003. 34. Melado E., Garcia- Effron G., Alcazar- Fuoli L., Cuenca- Estrella M., Rodriguez- Tudela J. L.: Substitutions at methionine 220 in the 14alpha- sterol demethylase (Cyp51a) of Aspergillus fumigatus are responsible for resistance in vitro to azole antifungal drugs. Antimicrob. Agents Chemother., 48, S2747-S2750, 2004. 35. Mellado E., Alcazar- Fuoli L., Garcia- Effron G., Cuenca- Estrella M., Rodriguez- Tudela J. L.: Functional analysis of Aspergillus fumigatus C-5 sterol desaturases (ERGA and ERGB) genes. In: 45 th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy (ICAAC), Washington, DC, USA, Abstract# M-1590, 2005b. 36. Moore C. B., Sayers N., Mosquera j., Slaven J., Denning D. W.: Antifungal drug resistance in Aspergillus. J. Infect., 41, S203-S220, 2000a. 37. Moore C. B., Walls C. M., Denning D. W.: In vitro activity of the new triazole BMS-207147 against Aspergillus species in comparison with itraconazole and amphotericin B. Antimicrob. Agents. Chemother.,44, S441-S443, 2000b. 38. Nascimento A. M., Goldman G. H., Park S., Marras S. A., Delmas G., Oza U. i wsp.: Multiple resistance mechanisms among Aspergillus fumigatus mutants with high-level resistance to itraconazole. Antimicrob. Agents Chemother., 47, S1719-S1726, 2003. 39. Odds F. C., Brown A. J., Gow N. A.: Antifungal agents: mechanisms of action Trends Microbiol., vol. 11, S279-S299, 2003. 40. Paterson P. J., Seaton S., Prentice H. G., Kibbler C. C.: Treatment failure in invasive aspergillosis: susceptibility of deep tissue isolates following treatment with amphotericin B. J. Antimicrob. Chemother., 52, S873-S876, 2003. 41. Patterson T. F.: New agents for treatment of invasive aspergillosis. Clin. Infect. Dis., 35, S367-S369, 2002. 42. Rogers T. R.: Antifungal drug resistance: does it matter? International Journal of Infectious Diseases, vol. 6, Supplement 1, 2002. 43. Rogers T. R.: Antifungal drug resistance: limited data, dramatic impact? International Journal of Antimicrobial Agents 27S (2006) S7-S11. 17

44. Sanglard D. Resistance of human fungal pathogens to antifungal drugs. Current Opinion in Microbiology, S379-S385, 2002. 45. Sanglard D., Ischer F., Calabrese D., de Micheli M., Bille J.: Multiple resistance mechanisms to azole antifungals in yeast clinical isolates. Drug Resist. Updat., 1, S255-S265, 1998. 46. Schaffner A., Bohler A.: Amphotericin B refractoryaspergillosis after itraconazole: evidence of significant antagonism. Mycoses, 36, S421-S424, 1993. 47. Slaven J. W., Anderson M. J., Sanglard D., Dixon G. K., BilleJ., Roberts I. S., Denning D. W.: Increased expression of a novel Aspergillus fumigatus ABC transporter gene, atrf, in te presence of itraconazole I an itraconazole resistant clinical isolate. Fungal Genet. Biol., 36, S199-S206, 2002. 48. Steinbach W. J., Perfect J., Schell W. A., WalshT. J., Benjamin D. K.: In vitro analyses, animal models, and 60 clinical ases of invasiveaspergillus terreus infection. Antimicrob. Agents Chemother., 48, S3217-S3225, 2004b. 49. SteinbachW. J., Benjamin D. K., Kontoyiannis D. P., Perfect J. R., Lutsar I., Marr K. A. i wsp.: Infections due to Aspergillus terreus: a multicenter retrospective analysis of 83 cases. Clin. Infect. Dis., 39, S192-S198, 2004a. 50. Sterling T. R., Merz W. G.: Resistance to amphotericin B: emerging clinical and microbiological patterns. Drug Resist. Updat., 1, S161-S165, 1998. 51. Stevens, D. A., Espiritiu, S., Parmar R.: Paradoxical effect of Caspofungin: Reduced Activity against Candida albicans at High Drug Concentrations. Antim. Agents and Chemother., vo.. 48, No.9, S3407- S3411, Sept. 2004. 52. Sutton D. A., Sanche S. E., Revankar S. G., Forthergill A. W., Rinaldi M. G.: In vitro amphotericin B resistance in clinical isolates of Aspergillus terreus, with a head- to-hesd comparison to voriconazole. J. Clin. Microbiol., 37, S2343-S2345, 1999. 53. Takasuka T., Sayers N. M., Anderson M. J.,Bendow E. W., Denning D. W.: Aspergillus fumigatus catalases: cloning of an Aspergillus nidulans catalase homologue and evidence for at least three catalases. FEMS Immunol. Med. Microbiol., 23, S125-S133, 1999. 54. Tekaia, F., Latge, J. P.: Aspergillus fumigatus: saprophyte or pathogen? Curr. Opin. Microbiol. 8, S385- S392, 2005. 55. Verweij, P. E., Oakley, K. L., Morrissey, J., Denning, D. W.: Efficacy of LY303366 against amphotericin B- susceptible and resistant Aspergillus fumigatus in a murine modelof invasive aspergillosis. Antimicrob. Agents Chemother. 42, S873-S878, 1998a. 56. Walsh, T. J., Petraitis, V., Petraitiene, R., Field-Ridley, A., Sutton, D., Ghannoum, M., et al.: Experimental pulmonary aspergillosis due to Aspergillus terreus: pathogenesis and treatment of an emerging fungal pathogen resistant to amphotericin B. J. Infect. Dis. 188, S305-S319, 2003. 57. Warnock, D. W., Arthington-Skaggs, B. A., Li, R. K.: Antifungal drug susceptibility testing and resistance in Aspergillus. Drug Resist. Updat. 2, S326-S334, 1999. 58. White, T. C., Marr, K. A., Bowden, R. A.: Clinical, cellular and molecular factors that contribute to antifungal drug resistance. Clin. Microbiol Rev., 11, S382-S402, 1998. 59. Xiong, Q., Hassan, S. A., Wilson, W. K., Han, X. Y., May, G. S., Tarrand, J. J., Matsuda, P. T.: Cholesterol import by Aspergillus fumigatus and its influence on antifungal potency of sterol biosynthesis inhibitors. Antimicrob. Agents. Chemother., 49, S518-S524, 2005. 60. Zaoutis T. E., Benjamin D. K., Steinbach W. J.: Antifungal treatmet n pediatric patients. Drug Resistance Updates S235-S245, 2005. 18