Genetyczne podobieństwo opornych na wankomycynę szczepów Enterococcus faecium izolowanych z materiału klinicznego

MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2010, 62: 297-302 Andrzej Młynarczyk 1, Wanda Grzybowska 2, Agnieszka Mrówka 2, Stefan Tyski 2,3, Grażyna Młynarczyk 1 Genetyczne podobieństwo opornych na wankomycynę szczepów Enterococcus faecium izolowanych z materiału klinicznego 1 Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego Kierownik: prof. dr hab. med. G. Młynarczyk 2 Zakład Antybiotyków i Mikrobiologii Narodowego Instytutu Leków Kierownik: prof. dr hab. farm. S. Tyski 3 Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego Kierownik: prof. dr hab. farm. S. Tyski Badano występowanie genów vana, vanb, vand, vane i vang metodą PCR u wankomycyno-opornych szczepów Enterococcus faecium izolowanych z materiału klinicznego pochodzącego z wybranych oddziałów Szpitala Dzieciątka Jezus w Warszawie oraz ustalono podobieństwo szczepów metodą analizy polimorfizmu restrykcyjnych fragmentów genomowego DNA za pomocą (RFLP) - PFGE Drobnoustroje z rodzaju Enterococcus występują jako normalna mikroflora jelitowa u ludzi i zwierząt, a także w glebie, pożywieniu, wodzie i roślinach. Ziarenkowce te również stanowią jeden z wiodących czynników zakażeń szpitalnych. Przyczyną tak szerokiego rozpowszechnienia enterokoków jest ich oporność na trudne warunki środowiska, a także wysoka gatunkowa oporność na wiele antybiotyków powszechnie stosowanych w szpitalach (12). Od pojawienia się w 1988 roku oporności enterokoków na antybiotyki z grupy glikopeptydów (VRE) (Vancomycin Resistant Enterococcus), lub GRE (Glycopeptide Resistant Enterococcus), wciąż wzrasta częstość izolacji VRE od chorych hospitalizowanych (10, 11, 12, 13). U Enterococcus sp.opisano 8 fenotypów oporności na glikopeptydy. Określono je jako VanA, VanB, VanC, VanD, VanE, VanG, VanL i VanM (1, 2, 4, 7, 12, 18). Fenotyp VanM opisano w 2010 roku u E faecium (18). Jest on uwarunkowany, podobnie jak VanA, VanB i VanD, modyfikacją prekursora peptydoglikanu (UDP-Mur-NAc-pentapeptydu), polegającą na zastąpieniu w pentapeptydzie końcowej D-Ala-D-Ala przez depsipeptyd D-Ala-D-Lac (5, 7, 12, 18). Operon VanM składa się z sekwencji genów IS1216-vanRM- -vansm-vanym-vanhm-vanm-vanxm (18). Warunkuje on wysoki poziom oporności na wankomycynę i teikoplaninę. Ligaza VanM kodowana jest przez sekwencję 1032 bp i zawiera 343 aminokwasy (18).

298 A.Młynarczyk i inni Fenotypy VanC, VanE, VanG i VanL, są wynikiem zastąpienia w UDP-Mur-NAc- pentapeptydzie końcowej D-Ala-D-Ala przez dipeptyd D-Ala-D-Ser (6, 9, 12, 17). Oporność typu vanc ma charakter oporności gatunkowej, jest warunkowana przez geny chromosomalne i występuje u Enterococcus gallinarum (vanc1), Enterococcus casseliflavus (vanc2 i vanc4), Enterococcus flavescens (vanc3) (3, 17), pozostałe są opornościami nabytymi, których geny zlokalizowane są w plazmidach w obrębie transpozonów lub w chromosomie. Wśród E. faecalis i E. faecium o fenotypach VRE i GRE najczęściej spotykanym jest VanA, a znacznie rzadziej VanB (12, 16). W niniejszej pracy analizie poddano szczepy z gatunku E. faecium wyizolowane od chorych z trzech oddziałów szpitalnych o bardzo różnej specyfice, a mianowicie Oddziału Intensywnej Terapii (, OIT), Oddziału Urologicznego (oddział zabiegowy) oraz Oddziału Internistycznego (oddział niezabiegowy). MATERIAŁ I METODY Szczepy bakteryjne. Do badań przeznaczono 20 wankomycyno-opornych szczepów E.faecium.Były to wszystkie szczepy VRE wyhodowane w Katedrze i Zakładzie Mikrobiologii Lekarskiej WUM w latach 2005 2008 z trzech analizowanych oddziałów szpitalnych. Enterokoki były wstępnie identyfikowane przy zastosowaniu systemu API 20 STREP (biomerieux, Francja) lub Vitek 2 (biomerieux, Francja) oraz oznaczano wrażliwość tych szczepów na antybiotyki przy pomocy ATB ENTERO (biomerieux, Francja) lub Vitek 2. Oporność na wankomycynę i teikoplaninę potwierdzano przy użyciu E-testów (AB BIODISK, Szwecja). Poprawność identyfikacji gatunku badanych szczepów sprawdzano za pomocą reakcji PCR dla genów ligazy ddl wg (8). Stosowano startery dla genu ddl (E.faecium): F1(+)5 -GCAAGGCTTCTTAGAGA-3 ; F2(-)5 -CATCGTGTA AGCTAACTT C-3. Uzyskiwano produkt reakcji PCR o wielkości 550 bp.wankomycyno-oporne E. faecium były zamrażane i przechowywane w temp. -72 C. Wykrywanie genów oporności przy zastosowaniu PCR. Całkowite DNA izolowano i oczyszczano przy użyciu Genomic DNA Prep Plus kit (A&A Biotechnology, Gdańsk, Polska). Zastosowano procedurę zgodną z zaleceniami producenta. Reakcję PCR przeprowadzano przy zastosowaniu starterów wg (8, 9, 10) i zgodnie z protokołami amplifikacji dla poszczególnych genów. Stosowane sekwencje starterów przedstawiono Tabela 1. Sekwencje starterów stosowane do wykrywania genów ligazy w reakcji PCR Gen ligazy Sekwencje starterów Wielkość produktu reakcji vana A 1-5 -GGGAAAACGACAATTGC-3 732 bp A 2-5 -GTACAA TGCGGCCGTTA-3 vanb B 1-5 -ATGGGAAGCCGATAGTC-3 635 bp B 2-5 -GATTTCGTTC CTCGACC -3 vand D 1-5 -TAAGGCGCTTGCATATACCG-3 461 bp D 2 : 5 -TGCAGCCAA GTATCCGGTAA-3 vane E 1 : 5 -TGTGGTATCGGAGCTGCAG-3 513 bp E 2 : 5 -GTCGATT CTCGCTAATCC -3 vang G 1 : 5 -CGGTTGTGCCGTACTTGGC-3 G 2 : 5 -GGGTAAAGCCATAGTCTGGGGC-3 810 bp

Wankomycynooporne E. faecium 299 w Tabeli I. Produkty reakcji PCR były analizowane w elektroforezie jednokierunkowej w żelu agarozowym. Ustalanie podobieństwa szczepów metodą RFLP-PFGE. Wysokocząsteczkowe genomowe DNA badanych izolatów immobilizowane w agarozie trawiono enzymem restrykcyjnym SmaI a następnie rozdzielano elektroforetycznie w 1% agarozie przy użyciu CHEF III (BioRad, USA) stosując: temp. 14 o C, napięcie 6 V/cm, czas elektroforezy 23 godz., czas pulsu od 1s do 25s. Żele barwiono roztworem bromku etydyny, fotografowano i analizowano za pomocą programu komputerowego Molecular Analyst (BioRad, USA). Dendrogramy utworzono z wykorzystaniem algorytmu obliczeniowego Dice a przy współczynniku tolerancji 1,5%. WYNIKI Przedmiotem badań było 20 wankomycyno-opornych szczepów E. faecium wyhodowanych od chorych z 3 wybranych oddziałów szpitalnych w latach 2005-2008. Przynależność gatunkową oraz genotyp oporności weryfikowano metodą PCR. U wszystkich szczepów E. faecium wykazano obecność genu ligazy vana oraz brak obecności genów vanb, vand, vane i vang. Badane szczepy E. faecium, wykazywały dość duże zróżnicowanie genetyczne. Na podstawie analizy komputerowej, ustalono stopień ich podobieństwa na 61,2% do %. Oceniając łącznie wszystkie 20 szczepów E. faecium pochodzących z 3 różnych oddziałów szpitalnych w okresie 4 lat (2005-2008), u 14 szczepów wykazano podobieństwo na poziomie 79,5% identyczności. W tej grupie 12 szczepów było wyhodowanych od chorych z Oddziału Intensywnej Terapii (OIT), a dwa z Oddziału Urologicznego. W obrębie tej grupy można wyszczególnić 3 podgrupy: A, B i C. Podgrupa A obejmowała 4 szczepy od chorych z OIT: 65, 87, 75 i 76, o stopniu podobieństwa 93,8%. Szczepy 65 i 87 były izolowane w 2005 roku i wykazują % podobieństwa, a szczepy 75 i 76 były izolowane w 2006 roku i wykazują między sobą również % podobieństwa (Ryc.1). Podgrupa B, obejmowała 5 szczepów również od chorych z OIT: 173, 176, 181, 201 i 202 o stopniu podobieństwa 93,3%. Szczepy 201 i 202 izolowano w 2007 roku a szczep 181 w 2008 roku. Te trzy szczepy wykazują między sobą % podobieństwa. Natomiast szczepy 173 i 176 izolowane były w 2008 roku i wykazują między sobą 97,7% podobieństwa. Do podgrupy C zaliczono 2 szczepy: 145 i 213, o stopniu podobieństwa 93,3%. Szczep 145 był izolowany od chorego na Oddziale Urologii w maju 2007 roku, a szczep 213 od chorego na Oddziale Internistycznym w listopadzie 2008 roku. Wyniki analizy podobieństwa badanych szczepów zostały przedstawione na ryc. 1. DYSKUSJA Największe podobieństwo wykazywały szczepy E. faecium o fenotypie VRE pochodzące od chorych z OIT. Wśród 20 badanych szczepów aż 11 pochodziło z tego oddziału, a 10 z nich wykazywało co najmniej 79,5% podobieństwa. Wśród szczepów izolowanych od różnych pacjentów były również wykazujące % podobieństwa. Wskazuje to na duże prawdopodobieństwo przeniesienia szczepu VRE wśród chorych hospitalizowanych na

300 A.Młynarczyk i inni Dice (Opt:0.50%) (Tol 1.5%-1.5%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-.0%] RFPL RFPL 65 70 75 80 85 90 95 65 68.8 82.1 86.4 85 93.8. 199. 38. 65. 87. 75. 76. 208. 118 UR 63 79.5 93.3 93.3 97.3. 145. 213. 173. 176. 181 UR 61.2 67.1 74.3 87.8. 201. 202. 124. 218. 226. 185. 165 UR Ryc 1. Analiza podobieństwa wankomycyno-opornych szczepów E. faecium wyhodowanych w latach 2005-2008 od chorych z Oddziału Intensywnej Terapii (), Oddziału Urologicznego (UR) i Kliniki Internistycznej (). tym oddziale. Do grupy 14 szczepów o podobieństwie 79,5% można zaliczyć również dwa szczepy z Oddziału Urologicznego i jeden z Oddziału Internistycznego, ale podobieństwo między nimi nie przekraczało 95%. Pozostałe szczepy VRE, a więc cztery z Oddziału Internistycznego oraz jeden szczep z OIT i jeden z Oddziału Urologicznego wykazywały wzory trawienia SmaI wskazujące na ich wystepowanie spradyczne. W tym samym szpitalu rozprzestrzenienie się szczepów VRE analizowano we wcześniejszych pracach poczynając od 1998 roku, i tak w latach 1998 2003 były to wyhodowania sporadyczne, a niewielki wzrost zanotowano w latach 2003-2004 (9 16 szczepów VRE w skali całego szpitala) (15). Począwszy od 2005 roku gwałtownie wzrastała częstość izolacji szczepów VRE. Wzrost ten dotyczy głównie Oddziału Chirurgii i Oddziałów Transplantologii (13, 14). Od chorych z innych oddziałów wyhodowania mają nadal charakter sporadyczny. Jednocześnie obserwuje się wzrost częstości izolacji E. faecium i jednocześnie spadek udziału E. faecalis w izolatach VRE. W 2005 roku na 44 wyizolowane szczepy VRE, 30 należało do gatunku E. faecium, a 3 do gatunku E. faecalis (15). Zwraca uwagę w naszych badaniach, że wszystkie szczepy VRE izolowane z oddziałów innych niż transplantologiczne, należały do gatunku E. faecium i zawierały gen vana. Szczepy pochodzące z innych oddziałów niż OIT, wykazywały małe podobieństwo w analizie RFLP-PFGE.

Wankomycynooporne E. faecium 301 A. Młynarczyk, W. Grzybowska, A. Mrówka, S. Tyski, G. Młynarczyk Genetic similarity of vancomycin resistant strains of Enterococcus faecium isolated from clinical specimens SUMMARY Twenty vancomycin resistant E.faecium strains (VRE) isolated from patients of three different hospital wards in 2005 2008 were examined. The strains originated from patients of intensive therapy, urological and internistic wards. The chosen wards differ significantly in their specificity. In all cases the presence of o vana and lack of vanb, vand, vane and vang genes and were found. Strains were compared by using RFLP-PFGE, the reference method for molecular typing of VRE. One group including fourteen strains showing similarity higher than 79.5% was distinguished. This group was divided into subgroups. The greatest similarity was found among strains from patients of intensive therapy ward. Two subgroups of strains showing similarity more than 93.3%, of four strains each were identified. The similarity between these two subgroups was 79.5%. Most strains from other two wards showed less than 79.5% similarity and they could be recognised as not related. Only one strain from internal ward and two strains from urologic ward were similar in 82.1 86.4% to one of subgroups of strains originated from intensive therapy. PIŚMIENNICTWO 1. Boyd DA, Willey BM, Fawcett D i inni. Molecular characterization of Enterococcus faecalis N06-0364 with low-level vancomycin resistance harboring a novel D-Ala-D-Ser gene cluster, vanl. Antimicrob Agents Chemother 2008; 2: 2667-72. 2. Boyd DA, Du T, Hizon R i inni. VanG-type vancomycin-resistant Enterococcus faecalis strains isolated in Canada. Antimicrob. Agents Chemother 2006; 50: 2217-21. 3. Clark NC, Teixeira LM, Facklam RR, Tenover F. Detection and differentiation of vanc-1, vanc-2, and vanc-3 glycopeptide resistance genes in enterococci. J Clin Microbiol 1998; 36: 2294-7. 4. Dahl KH, Simonsen GS, Olsvik O, Sundsfjord A. Heterogeneity in the vanb gene cluster of genomically diverse clinical strains of vancomycin-resistant Enterococci. Antimicrob. Agents Chemother 1999, 43: 1105-10. 5. Depardieu F, Perichon B, Courvalin P. Detection of the van alphabet and identification of enterococci and staphylococci at the species level by multiplex PCR. J Clin Microbiol 2004; 42:5857-60. 6. Depardieu, F, Bonora MG, Reynolds PE, Courvalin P. The vang glycopeptide resistance operon from Enterococcus faecalis revisited. Mol Microbiol 2003; 50: 931-48. 7. Depardieu F, Reynolds PE, Courvalin P. VanD-type vancomycin-resistant Enterococcus faecium 10/96A. Antimicrob. Agents Chemother 2003, 47, 7-18. 8. Dutka-Malen S, Evers S, Courvalin P. Detection of glycopeptide resistance genotypes and identification to the species level of clinically relevant enterococci by PCR. J Clin Microbiol 1995; 33: 24-7. 9. Fines M, Perichon B, Reynolds P i inni. VanE a new type of acquired glycopeptide resistance in Enterococcus faecalis BM4405. Antimicrob Agents Chemother 1999; 43: 2161-64 10. Grzybowska W, Młynarczyk A, Mrówka A i inni. Molecular epidemiology of vancomycin-resistant Enterococcus faecalis among patients of transplantology wards. Transpl Proc. 2009; 41(8): 3256-7. 11. Młynarczyk A, Grzybowska W, Mrówka A i inni. Molecular epidemiology of vancomycin-resistant Enterococcus faecium infecting recipients of solid organs in the transplant surgery ward in 2005 and 2006. Transpl Proc 2009; 41: 3261-3.

302 A.Młynarczyk i inni 12. Młynarczyk A, Młynarczyk B, Kmera-Muszyńska M i inni. Mechanisms of the resistance and tolerance to beta-lactam and glycopeptide antibiotics in pathogenic gram-positive cocci Mini-Rev Med Chem 2009; 9: 1527-37. 13. Młynarczyk G, Grzybowska W, Młynarczyk A i inni. Significant increase in the isolation of glycopeptide-resistant Enterococci from patients hospitalized in the transplant surgery ward in 2004-2005. Transpl Proc 2007; 39:2883-5. 14. Młynarczyk G, Grzybowska W, Młynarczyk A i inni. Occurrence of glycopeptide-resistant Enterococci in transplant medicine wards in 2001-2005. Transpl Proc 2007; 39: 2886-9. 15. Młynarczyk G, Grzybowska W, Młynarczyk A i inni. Oporność na glikopeptydy szczepów Enterococcus spp. izolowanych w latach 1998-2005 od chorych hospitalizowanych. Med Dośw Mikrobiol 2006; 58: 19-25. 16. Shirano M, Takakura S, Yamamoto M i inni. Regional spread of vana- or vanb-positive Enterococcus gallinarum in hospitals and long-term care facilities in Kyoto prefecture. Japan Epidemiol Infect 2010; 1: 1-7. 17. Watanabe S, Kobayashi, N, Quiñones D i inni. Genetic diversity of the low-level vancomycin resistance gene vanc-2/vanc-3 and identification of a novel vanc subtype (vanc-4) in Enterococcus casseliflavus. Microb Drug Resist 2009; 15: 1-9. 18. Xu X, Lin D, Yan G i inni. vanm, a new glycopeptide resistance gene cluster found in Enterococcus faecium. Antimicrob Agents Chemother 2010; 54: 4643-7. Otrzymano: 26 X 2010 r. Adres Autora: 02-004 Warszawa, ul. Chałubińskiego 5, Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego