BADANIE WŁASCIWOSCI FIZYKOCHEMICZNYCH KWASÓW NUKLEINOWYCH

BADANIE WŁASCIWOSCI FIZYKOCHEMICZNYCH KWASÓW NUKLEINOWYCH ROZPUSZCZALNOŚĆ KWASÓW NUKLEINOWYCH Kwasy nukleinowe mają charakter polianionowy, wynikający z bogactwa reszt fosforanowych w ich strukturze, dzięki którym mają odczyn kwasowy. Dlatego wolne kwasy nukleinowe dobrze rozpuszczają się w roztworach zasadowych, natomiast słabo w rozcieńczonych kwasach i w wodzie. Kwasy nukleinowe w wodnych roztworach tworzą koloidy, z których łatwo można je wytrącić odczynnikami odwadniającymi, np. etanolem, izopropanolem Właściwość ta wykorzystywana jest w metodach izolacyjnych do oczyszczania kwasów nukleinowych. Wykonanie: 1. Do 0,5 ml roztworu 0,1% DNA dodawać kroplami 0,1 M HCl aż do wytrącenia osadu kwasu nukleinowego. Następnie dodać kroplami 1 M NaOH, aż do ponownego rozpuszczenia osadu. 2. Do 0,4 ml roztworu DNA dodać 1 ml 95% etanolu. Zaobserwować wytrącanie się osadu kwasu nukleinowego TWORZENIE KOMPLEKSÓW KWASÓW NUKLEINOWYCH Z BIAŁKAMI Kwasy nukleinowe tworzą z białkami zasadowymi oraz niektórymi białkami obojętnymi połączenia kompleksowe. Do oddzielenia białka od kwasu nukleinowego stosuje sie nasycone roztwory NaCl. Wykonanie: Do szklanej krótkiej probówki dodać 1 ml 0.1% DNA oraz 300 μl 1 M CH3COOH a następnie 100 μl 3% roztworu BSA. Wytrąca sie osad kompleksowego połączenia białka z DNA. W celu rozpuszczenia osadu dodac 1 ml nasyconego roztworu NaCl. DEGRADACJA DNA POD WPŁYWEM CZYNNIKÓW FIZYCZNYCH I CHEMICZNYCH Do poniższych doświadczeń należy użyć prepratu genomowego DNA bakteryjnego zawieszonego w 150 μl buforu TE, pobrać z probówki typu eppendorf 10 μl DNA i zawiesić w 10 μl 0,1 N NaOH 1. Uszkodzenia mechaniczne DNA : Intensywnie pipetować 10 μl preparatu 20 razy używając mikropipety z żółtymi końcówkami. Pozostawić preparat w temperaturze pokojowej na ok. 1 godzinę. 2. Gotowanie DNA: Umieścić 10 μl przygotowanego preparatu DNA we wrzącej łaźni wodnej na 5 min. Pozostawić preparat w temperaturze pokojowej na ok. 1 godzinę. 3. Działanie nukleaz skórnych: Używając pipety automatycznej, umieścić 10 μl preparatu DNA na skórze dłoni na 1 min. Zebrać preparat do probówki eppendorfa i inkubować w 37 C przez 1 godzinę. 4. Działanie nukleaz ze śliny : Do 10 μl preparatu DNA dodać 2 μl śliny. Preparat inkubować w 37 C przez 1 godzinę. 5. Działanie kwasu: Do 10 μl preparatu DNA dodać 2 μl 0.25N HCl, delikatnie zamieszać i inkubować w 37 C przez 1 godzinę. 6. Działanie zasady: Do 10 μl preparatu DNA dodać 2 μl 0.25N NaOH, delikatnie zamieszać i inkubować w 37 C przez 1 godzinę Po zakończeniu inkubacji wszystkich preparatów przeprowadzić elektroforezę w żelu agarozowym (1-6) 1

ELEKTROFOREZA W ŻELU AGAROZOWYM Elektroforeza jest zjawiskiem wędrówki molekuł obdarzonych ładunkiem w polu elektrycznym. Elektroforezę stosuje się do rozdzielania i wizualizacji takich biomolekuł jak białka i kwasy nukleinowe, ale również mniejszych peptydów. W ogólnym ujęciu o szybkości migracji molekuł w polu elektrycznym decyduje natężenie pola elektrycznego, wypadkowy ładunek molekuły, jej wielkość oraz kształt, a także lepkość środowiska. Elektroforeza żelowa, w odróżnieniu od elektroforezy kapilarnej, realizowana jest w żelu otrzymanym na drodze polimeryzacji odpowiednich substancji. Żel pełni rolę sita molekularnego. Innymi słowy, duże molekuły, posiadając mniejszą swobodę poruszania się w strukturach żelu, migrują wolniej niż ma to miejsce w przypadku molekuł mniejszych. Białka najczęściej poddaje się analizie elektroforetycznej w żelach poliakrylamidowych. Wykonanie: 1. Odważyć 1 g agarozy do elektroforezy kwasów nukleinowych do kolby stożkowej o objętości 100 ml. 2. Dodać 100 ml buforu TBE (1x stężony) i dokładnie rozpuszczać agarozę ogrzewając w mikrofalówce przez 2 min. Energicznie mieszać zawartość, co około 0.5 min w miarę możliwości nie dopuszczając do wrzenia. 3. Ochłodzić roztwór agarozy do temp. ok. 50 60 o C, dodać 3 μl bromku etydyny. Dokładnie wymieszać. 4. Złożyc podstawę na żel z grzebieniem do formowania studzienek. Powoli wylać żel na podstawę i odczekać do zastygnięcia ok. 30 40 min. 5. Wyjąć grzebień i umieścić podstawę wraz z żelem w aparacie do elektroforezy. 6. Wlać do aparatu ok. 500 ml buforu TBE (1x). Rys. 1 Wylewanie żelu agarozowego 7. Wymieszaj próbki DNA w przygotowanych wcześniej dołkach z parafilmu z buforem obciążającym (6X stężonym). Barwniki buforu obciążającego pozwala także śledzić położenie migrujących w żelu prób podczas elektroforezy. Pobierz 10 μl badanego preparatu DNA i dodaj 2 μl buforu obciążającego 8. Próbki DNA nakładać pipetą z jednorazową końcówką wymieniając ją za każdym razem kiedy nakładamy próbki. Przed nałożeniem na żel należy wymieszać dokładnie mieszaninę trakcyjną z barwnikem wciągając i wyciągając pipetkę całą zawartością próbki. Należy unikać dostania się do próbki bąbli powietrza gdyż może to uniemożliwić nałożenie próbki do studzienek. 9. Nabrać część mieszaniny z barwnikiem DNA (ok. 10 μl) do jednorazowej końcówki i delikatnie włóż końcówkę do dołka żelu ( dołek żelu powinien być widoczny patrząc pod kątem poprzez bufor). Powoli naciskając tłoczek wypuścić próbkę do dołka. 10. Niezwłocznie po nałożeniu próbek podłącz żel do zasilacza czerwony kabelek podłącz do + zasilacza i elektrody na dole żelu tzn. po przeciwnej stronie co dołki a czarny do - i elektrody na górze żelu ( po tej stronie co dołki). Po prawidłowym podłączeniu aparatu wokół elektrod powinny gromadzić się pęcherzyki gazu, które świadczą o przepływie prądu a nałożone próbki będą przesuwać się w dół żelu migrując od - do + 2

11. Rozwijać elektroforezę do uzyskania odpowiedniego rozdziału tj. dojścia barwnika do czoła żelu przy napięciu 120 V. Uwaga: Bromek etydyny ma działanie mutagenne. Używać rękawic ochronnych. Dłuższa ekspozycja na światło UV może spowodować oparzenia i uszkodzenie wzroku. Używać okularów ochronnych lub osłony. Przygotowanie żelu i elektroforezę prowadzić pod nadzorem prowadzących ćwiczenia.. Rys 2 Nakładania próbek na żel agarozowy WYKRYWANIE SKŁADNIKÓW DNA Celem ćwiczenia jest wykazanie występowania w DNA/RNA puryn, rybozy/deoksyrybozy i reszty fosforanowej. WYKRYWANIE PURYN Puryny wykrywane są w preparacie DNA doprowadzonym do ph 4, ponieważ w tym środowisku wodorosiarczan(iv) sodu (NaHSO3) (kwaśny siarczyn sodu) redukuje jony Cu2+ do jonów Cu+. Nowo powstałe jony miedzi(ii) (miedziowe) tworzą nierozpuszczalne sole z purynami. Daje to w probówce zawierającej purynę opalizujący, żółtawy osad. Porównać z z zabarwieniem uzyskanym w preparacie kontrolym z 0,1% roztworem adeniny Przygotować 3 probówki i postępować wg schematu zamieszczonego w tabelce poniżej: (ważna jest kolejność dodawania odczynników): Odczynniki (ml) 1 2 3 H2O 1,0 - - Hydrolizat RNA ph4-1,0 - Preparat kontrolny 0,1 % adenina - - 1,0 0,25 M CuSO4 0,2 0,2 0,2 Nasycony roztwór NaHSO3 0,2 0,2 0,2 Zanotować wynik obserwacji WYKRYWANIE RESZT FOSFORANOWYCH W środowisku kwaśnym jony fosforanowe (V) reagują z molibdenianem amonowym tworząc żółty fosforomolibdenian amonu. Porównać z zabarwieniem uzyskanym w preparacie kontrolym z 5% kwasem ortofosforowym. Przygotować 3 probówki i postępować wg schematu zamieszczonego w tabelce: Odczynniki (ml) 1 2 3 3

H2O 0,1 - - 0,1 % DNA - 0,1 - Roztwór kontrolny 5% kw ortofosforanowy - - 0,1 Molibdenian amonu w 1,5 M H2SO4 1,0 1,0 1,0 Inkubować w temp. 100 o C 15-20 min. Zanotować wynik obserwacji. WYKRYWANIE RYBOZY METODA BIALA Pentozy w środowisku stężonego kwasu solnego ulegają odwodnieniu i powstaje z nich furfural, który z orcynolem w obecności jonów żelaza(iii) (żelazowych) tworzy zielony produkt. Ryboza połączona z zasadami purynowymi bierze udział w tej reakcji, a związana z pirymidynami nie. Reakcja ta pozwala odróżnić DNA od RNA gdyż deoksyryboza reaguje z odczynnikiem orcynowym 10-krotnie słabiej, dlatego przyjmuje sie, że DNA w próbie Biala daje wynik ujemny. Przygotować 4 probówki i postępować wg schematu zamieszczonego w tabelce: Odczynniki (ml) 1 2 3 4 H2O 0,1 - - - 0,1 % DNA - 0,1 - - 0,1% RNA - - 0,1 - Roztwór kontrolny (0,1% arabinoza ) - - - 0,1 5 kropli 10% roztworu orcyny 2-3 krople 2-3 krople 2-3 krople 2-3 krople w etanolu 0,1% FeCl3 w stężonym HCl 1,0 1,0 1,0 1,0 Inkubować w temp. 100 o C 15-20 min. Zanotować wynik obserwacji. JAKOŚCIOWE OZNACZANIE DEZOKSYRYBOZY Preparat DNA-proteiny w odczynniku Dische go (stęż. H2SO4, lodowaty CH3COOH i dwufenyloamina) w temperaturze 100 C ulega hydrolizie, następnie deoksyryboza tworzy z dwufenyloaminą produkt kondensacji o barwie niebiesko filoetowej. RNA zawierający ryboze oraz deoksyryboza zwiazana w nukleotydach pirymidynowych dają wynik ujemny w tej reakcji. Przygotować 3 probówki i postępować wg schematu zamieszczonego w tabelce: Odczynniki (ml) 1 2 2 H2O 0,1 - - 0,1 % DNA - 0,1-0,1 % RNA - - 0,1 Odczynnik Dische go Uwaga: substancja żrąca i brudząca! 0,5 0,5 0,5 Inkubacja w temp. 100 C 15-20 min. Zanotować wynik obserwacji. 4

ELEKTROFOREZA BIAŁEK W ŻELU POLIAKRYLAMIDOWYM Elektroforeza żelowa białek jest powszechnie wykorzystywaną techniką w praktyce laboratoryjnej. Jest nieocenionym narzędziem w ocenie obecności określonego białka (lub białek) w mieszaninie, a także jego czystości, czy wreszcie przy określaniu profilu białkowego różnego typu próbek. Białka analizuje się na drodze elektroforezy w różnych wariantach tej techniki, w zależności od pożądanego wyniku, rodzaju próbki itd. W elektroforezie natywnej analizowane są białka w ich naturalnej, niezdenaturowanej formie. Częściej jednak stosowana jest elektroforeza w warunkach denaturujących, kiedy to ruchliwość białek w żelu jest niezależna od kształtu formy natywnej. Dodatkowo stosuje się inne modyfikacje, do których należy elektroforeza dwukierunkowa, pozwalająca na uzyskanie lepszego rozdzielenia białek. SDS-PAGE Jedną z najpowszechniej wykorzystywanych technik w analizie białek jest SDS-PAGE (ang. SDS poliacrylamide gel electrophoresis). Jest to proces rozdzielenia elektroforetycznego w warunkach denaturujących z wykorzystaniem SDS, czyli dodecylosiarczanu sodu. SDS-PAGE jest techniką, która pozwala w pełni uniezależnić proces rozdzielania białek od ich kształtu i ładunku elektrycznego. Dzięki temu uzyskiwany wynik jest stosunkowo prosto interpretowany na podstawie zależności drogi, jaką przebyło białko w żelu, od jego masy molekularnej. Mechanizm SDS-PAGE Przygotowanie próbek do analizy SDS-PAGE wymaga dodatku specjalnego buforu zawierającego w swym składzie SDS i substancję redukującą, a także denaturacji termicznej białek (poprzez ogrzanie do 95-100 C przez kilka minut). SDS jest detergentem jonowym, który niszczy oddziaływania niekowalencyjne decydujące o przestrzennej strukturze molekuły białkowej. Efekt denaturacji jest zapewniany definitywnie przez ogrzewanie próbki do wysokiej temperatury. Zawarty w buforze czynnik redukujący, na przykład DTT (ditiotreitol), odpowiada za niszczenie mostków dwusiarczkowych w strukturach białek. Ponadto, obecność SDS uniezależnia szybkość migracji molekuł od ich ładunku, ponieważ ten anionowy detergent warunkuje nadanie wszystkim białkom dużego ujemnego ładunku. W efekcie działania powyższych czynników białka poruszają się w żelu w kierunku elektrody dodatniej z szybkością zależną jedynie od ich wielkości. Przygotowanie próbek do elektroforezy: Bufor do próbek (2 x stężony) - przepis wg mercka(hefera): - 0,5 M TRIS-HCl o ph 6,8 (stężenie końcowe 0,125 M) - 4% SDS (siarczan dodecylu sodu) - 20 %glicerol - bromofenol blue (dodawać kroplami do uzyskania odpowiedniego granatowego koloru) Bufor do elektroforezy (5x stężony) : - 25mM Tris - 192 mm glicyna - 0.1% SDS (ph 8.3) 5

Przebieg elektroforezy Odpowiednio przygotowane próbki nanosi się na pionową płytkę żelu poliakrylamidowego, do zagłębień zwanych studzienkami - sporządzony wcześniej żel umieszczony jest w specjalnej aparaturze w środowisku buforu o odpowiedniej sile jonowej oraz ph. Próbki białkowe zawierają glicerol co sprawia, że nie wydostają się one ze studzienek żelowych, a raczej opadają na ich dno. Wówczas, po przyłożeniu napięcia, rozpoczyna się migracja molekuł w strukturach żelu. Najczęściej stosuje się tak zwany system nieciągły. W tym systemie żel przygotowywany jest w ten sposób, że białko najpierw wędruje w jego górnej części o mniejszym stopniu usieciowania, gdzie próbka ulega zagęszczeniu (żel zagęszczający). W dolnej części natomiast stopień usieciowania żelu jest większy i to tam następuje właściwe rozdzielenie mieszaniny białkowej na poszczególne frakcje zależnie od masy molekularnej (żel rozdzielający). Różnica w stopniu usieciowania żelu uzyskiwana jest poprzez różną zawartość czynników sieciujących. Im więcej poliakrylamidów i czynników warunkujących polimeryzację, tym gęstsze sito molekularne żelu wtedy też proces migracji jest wolniejszy, ale możliwe staje się efektywne rozdzielenie mieszanin mniejszych biomolekuł. O długości procesu elektroforezy decyduje także wysokość przyłożonego napięcia. Im większe napięcie pomiędzy elektrodami, tym szybszy rozdział elektroforetyczny. Należy jednak pamiętać, że zwykle szybka elektroforeza pod wyższym napięciem wiąże się z niekorzystnym przegrzewaniem buforu elektroforetycznego i niższą rozdzielczością uzyskanego elektroforegramu. 6

Wizualizacja Po zakończeniu procesu rozdzielania elektroforetycznego, żel poddaje się wybarwieniu. Jednym z częściej stosowanych barwników jest Coomassie Brilliant Blue (CBB), tym nie mniej większą czułość obserwuje się przy wykorzystaniu metody barwienia srebrem. Po wybarwieniu żelu, uzyskiwany jest obraz w postaci prążków. Każdemu prążkowi, o ile jest rozróżnialny, odpowiada białko o określonej masie molekularnej. Do interpretacji wyników niezwykle przydatny jest tak zwany marker masy, który przed elektroforezą nanosi się do jednej ze studzienek, obok próbek. Markery dostępne są komercyjnie i zawierają w swym składzie białka o ściśle określonej masie molekularnej na tej podstawie można wnioskować o wielkości białek z sąsiednich próbek. Żel poliakrylamidowy po elektroforezie może także posłużyć do elektrotransefru uwięzionych w nim białek na specjalną błonę, a w następstwie tego do specyficznej detekcji tych białek z wykorzystaniem przeciwciał w metodzie Western blotting. 7