Wspó³czesne pogl¹dy na mechanizmy dzia³ania steroidów w astmie

Wspó³czesne pogl¹dy na mechanizmy dzia³ania steroidów w astmie TERAPIA Czêœæ I molekularne podstawy przeciwzapalnego dzia³ania leków steroidowych Lek. med. Marek Kokot ALTANA Pharma Kierownik ds. nauki Current opinion on molecular mechanisms of steroids activity in asthma S u m m a r y In comprehensive review current opinion on molecular mechanisms of steroids activity in asthma was presented. The role of transcription factors in priming and supporting of allergic inflammation and their direct interactions with glucocorticoid receptor was described. Glucocorticoid receptor (GR) is an important element of subtle system of transcription factors dynamic balance, responsible for the body immunological homeostasis. The role of intracellular system of the protein kinases in signals transduction pathways and inflammatory cells activation was described. It s connection to nuclear factors function, and involvement in post- transcriptional regulation of genes expression, was underlined. New data concerning modulation of that system by steroids were presented. It was noted that steroids beyond regulatory effects on gene expression may reveal so called rapid or non- genomic pharmacological effects. Beside still poor knowledge of mentioned effects it seems them to be an important part of steroids anti-inflamatory activity. Multidirectional steroids pharmacological effects makes them currently an irreplaceable drugs in allergic disorders therapy, asthma included.... W krótkim przegl¹dzie przedstawiono wspó³czesne pogl¹dy na mechanizmy dzia³ania steroidów w astmie na poziomie komórkowym i molekularnym. Opisano rolê pozaj¹drowych czynników transkrypcyjnych w promowaniu i podtrzymywaniu zaplenia alergicznego oraz ich bezpoœrednie oddzia³ywania z receptorem GR. Przedstawiono receptor GR jako jeden z wa nych elementów subtelnej równowagi uk³adu czynników transkrypcyjnych odpowiedzialnych za utrzymanie homeostazy immunologicznej ustroju. Wskazano na rolê uk³adu kinaz w przewodzeniu i regulowaniu informacji wewn¹trz komórek zapalenia, ich wp³yw na funkcjonowanie ró nych czynników transkrypcyjnych i post- transkrypcyjn¹ regulacjê ekspresji genów pro- zapalnych. Przedstawiono nowe dane, z których wynika, e steroidy mog¹ wp³ywaæ modyfikuj¹co na ten system. Zaznaczono równie, e steroidy obok regulacji ekspresji genów wykazuj¹ szybkie niegenomiczne efekty farmakologiczne. Chocia s¹ s³abo poznane, wydaj¹ siê mieæ istotne znaczenie dla przeciwzapalnego dzia³ania leków steroidowych. Wielokierunkowe dzia³ania steroidów sprawiaj¹, e s¹ one obecnie lekami nie do zast¹pienia w terapii chorób alergicznych, w tym astmy oskrzelowej. W praktyce klinicznej leki steroidowe narz¹dach i tkankach, i to na wielu poziomach od u ywane s¹ g³ównie w celu hamowania proliferacji i ró nicowania niektórych komórek, a procesów zapalnych. Tak te dzieje siê po regulacjê ich aktywnoœci metabolicznej i prow terapii astmy oskrzelowej, gdzie przewlek³e, gramowan¹ œmieræ (2). wziewne podawanie steroidów jest podstawowym Dlatego tak istotnym wydaje siê poznanie i niezbêdnym sposobem postêpowania (GINA procesów regulacyjnych zale nych od steroidów, 2004) (1). Nale y przy tym pamiêtaæ, e steroidy aby jeszcze skuteczniej hamowaæ procesy reguluj¹ wiele procesów fizjologicznych w licznych zapalne, a jednoczeœnie w jak najmniejszym S³owa kluczowe : terapia astmy, mechanizm dzia³ania sterydów, receptor GR, czynniki transkrypcjne Key words : therapy of asthma, mechanism of steroids activity, receptor GR, transcription factors ALERGIA 3(25)/2005 21

stopniu naruszaæ homeostazê ustroju. antygeny, zw³aszcza bakterii G(-) i innych Do niedawna niewiele wiadomo by³o na temat czynników zakaÿnych (HAV), czêsto zwi¹zanych z molekularnych podstaw farmakodynamiki leków zaka eniami oro-fekalnymi (4,5,6). steroidowych, a tzw. klasyczna teoria sprowa- W wyniku takiej ekspozycji uk³ad immunodzaj¹ca efekt glukokortykoidu do aktywowania logiczny dziecka nabywa³by poprzez wykszta³cejednych i hamowania innych genów choæ ogólnie nie odpowiednio ukierunkowanych pul dojrza³ych s³uszna, okaza³a siê ogromnym uproszczeniem. komórek dendrytycznych i od nich zale nych limfocytów T regulatorowych, tolerancji na Zapalenie i regulacja procesów zapalnych. alergeny. Jednoczesne nabywanie odpornoœci na Odpornoœæ i zapalenie s¹ procesami antygeny bakteryjne, zwi¹zanej z aktywacj¹ uk³adu fizjologicznymi zapewniaj¹cymi integralnoœæ limfocytów Th1, poprzez IFN- oraz IL-6 dodatkowo naszego ustroju. Niedobory w tym zakresie (choæ prawdopodobnie nie jest to mechanizm prowadz¹ do masywnej inwazji patogenów lub decyduj¹cy), t³umi¹ reakcjê typu Th2 (7,8). innych czynników uszkadzaj¹cych i odwrotnie Jeœli z jakiegoœ powodu uk³ad komórka nieprawid³owa lub te nadmierna odpowiedÿ dendrytyczna prekursor limfocyta T- limfocyt zapalna, prowadzi do uszkodzenia tkanek. Efektem CD4+25+ jest niewydolny, przy jednoczeœnie silnej tych zaburzeñ jest choroba, a nawet œmieræ ekspozycji i odpowiedzi typu Th2 na antygen, organizmu. dochodzi do nadmiernej nadwra liwej reakcji Astma oskrzelowa jest przyk³adem nieprawid³oalergenem. przy nastêpnym kontakcie ze specyficznym wej i nadmiernej odpowiedzi immunologicznej Rozwój astmy najczêsciej wymaga z nastêpowym przewlek³ym zapaleniem uszkadzauszkodzenia do³¹czenia siê mechanizmu spustowego w postaci j¹cym drogi oddechowe. Wyra a siê ono w zawirusowe. nab³onka oskrzeli przez zaka enie burzonej regulacji procesów ró nicowania, W póÿniejszym okresie obserwuje siê proliferacji, aktywnoœci i wreszcie apoptozy nabywanie kolejnych uczuleñ oraz ci¹g³¹ komórek bior¹cych udzia³ w wytwarzaniu perpetuacjê przewlek³ego procesu zapalnego alergicznego procesu zapalnego (1). w drogach oddechowych podczas ekspozycji na Jednym z kluczowych elementów regulacji alergeny, na które organizm zosta³ wczeœniej odpowiedzi immunologicznej w astmie, który na uczulony (9). poziomie komórkowym dzia³a nieprawid³owo, jest Warto dodaæ, e podobny mechanizm braku funkcjonalny defekt limfocytów T regulatorowych nadzoru immunologicznego ze strony Treg wobec (Treg) CD4+25+, a byæ mo e nawet komórek tym razem limfocytów Th1, przy utracie tolerancji prezentuj¹cych antygen (APC antigen presenting dla w³asnych antygenów tkankowych, zale nych cells) (3). od komórek DC nale ¹cych do puli zwi¹zanej W ten sposób dochodzi do braku nadzoru nad z tzw. odpornoœci¹ wrodzon¹ (innate immunity), limfocytami Th2 i ogólnie znanych konsekwencji, prowadzi do powstawania chorób z autoagresji w postaci rozwoju alergii i przewlek³ego (10). eozynofilowego zapalenia oskrzeli. Obecnie coraz Przedstawiona powy ej koncepcja jest prób¹ wiêcej danych sugeruje, ze czynnoœciowa rozwiniêcia na gruncie immunologii, teorii przewaga uk³adu Th2 ma charakter konstytutywny, higienicznej powstawania alergii. Podkreœla ona wrodzony, a prawid³owe dojrzewanie uk³adu rolê czynników œrodowiskowych, a jej przes³anki immunologicznego w pierwszych latach ycia maj¹ mocne Ÿród³o w wynikach licznych, ogólnie wymaga odpowiedniej ekspozycji ustroju na silne znanych obserwacji epidemiologicznych 1 RYCINA Komórki dendrytyczne i ich rola w róznicowanieulimfocytów T antygen DC-Th1 Th p IL-12 Th1 IFN-g DC-Tr1 Th p IL-10 Tr1 IL-10 Niedojrza³a komórka dendrytyczna DC DC-Th2 Th p Komórka DC dojrza³a IL-4 Th2 IL-4 IL-13 Komórki dendrytyczne (DC dendritic cells) dojrzewaj¹ w kierunku ró nych fenotypowo populacji o rozdzielonych zdolnoœciach do aktywacji naiwnych prekursorów komórek T (Thp). Komórki DC, które wytwarzaj¹ du e iloœci IL-12 (DC-Th1) bêd¹ preferencyjnie nasila³y ró nicowanie komórek Th1. Komórki dendrytyczne, które promuj¹ naiwne komórki Thp do transkrypcji IL-4, bêd¹ preferencyjnie nasila³y dojrzewanie komórek Th2. Czêœæ komórek DC mo e wydzielaæ IL-10 (DC-Tr1) prowadz¹c do wytworzenia puli limfocytów regulatorowych Treg. (12) 22 ALERGIA 3(25)/2005

wskazuj¹cych na œcis³y zwi¹zek czêstoœci nie bodziec docieraj¹cy do komórki np. czynnik pojawiania siê alergii z nadmiernie sterylnymi wzrostowy uruchamia kaskadê fosforylacji. Jej warunkami ycia (11). Trzeba podkreœliæ, e ostatnim ogniwem jest fosforylacja przez kinazê obecnie coraz wiêcej danych generowanych JNK (patrz poni ej) podjednostki c-jun. Aktywna w labo rato riac h immu nolo gów zdaj e siê podjednostka przemieszcza siê do j¹dra gdzie potwierdzaæ tê koncepcjê. ³¹czy siê z podjednostk¹ c-fos i nastêpnie nasila transktrypcjê genów pro-zapalnych podlegaj¹cych Rola pozajadrowych czynników regulacji przez AP-1. (13,14) transkrypcyjnych w regulacji procesów zapalnych. NFATc i ekspresja genu IL-4 Badania ostatnich dziesiêciu lat nie Ekspresja IL-4 na poziomie transkrypcji pozostawiaj¹ w¹tpliwoœci, e na poziomie subj¹drowych regulowana jest przez rodzinê czynników komórkowym g³ównymi regulatorami procesów zale nych od wapnia. Jest to tak zwany zapalnych s¹ bia³ka poœrednicz¹ce zwane czynnik j¹drowy aktywowanych komórek T (NFATpozaj¹drowymi czynnikami transkrypcyjnymi. nuclear factor of activated T cells). Czynnik, który Poœrednicz¹ one w przekazywaniu (transdukcji) pozostaje w cytoplazmie jest aktywowany poprzez informacji docieraj¹cej do komórki z zewn¹trz defosforylacjê przy udziale fosfatazy klcineuryny (np.tnf, czynniki wzrostowe; EGF, TGF ) na i przemieszcza siê do j¹dra komórkowego. Dzia³a genotyp, a efektem ich dzia³ania mo e byæ jak koaktywator maksymalnie nasilaj¹c transkryp- zarówno hamowanie jak i nasilanie ekspresji cjê IL-4 w komórkach TH2 (12). okreœlonych genów (13). Takich bia³ek w komórce s¹ najprawdopodobi ró nicowanie komórek immunologicznych STAT-6, GATA 3 niej setki, a ich dodatkow¹ cech¹ jest to, e nie tylko wchodz¹ w interakcje z DNA komórkowym, Czynnik j¹drowy STAT-6 (signal transducer and ale równie pomiêdzy sob¹ (cross-talk). activator of transcription) jest czynnikiem Pewn¹ wspóln¹ cech¹ czynników trankrypcyjnaiwnych komórek Thp, które nie wydzielaj¹ inicjuj¹cym ró nicowanie prekursorowych, nych jest ich dimeryczna struktura (po³¹czenie dwóch bia³ek), co nie pozostaje bez znaczenia jeœli cytokin, w kierunku dojrza³ych komórek Th2. chodzi o powinowactwo do czêœci promotorowch Stymulacja limfocyta prekursorowego (IL-4?), regulowanych przez nie genów. Ponadto zazwykinazy Jak (rodzina Janus), dimeryzacji prowadzi do fosforylacji czynnika STAT-6 przez czaj tylko jedna podjednostka ma w³aœciwoœci aktywizacji transkrypcji. i translokacji do j¹dra komórkowego, gdzie W regulacji procesów odpornoœciowych, w tym aktywuj¹ geny, których ekspresja zale y od IL-4: ILzwi¹zanych z astm¹, czynnikami transkrypcyjnymi 4R (receptor dla IL-4), IgE, FcR, MCH II. Drugim o podstawowym znaczeniu s¹ j¹drowy czynnik kluczowym regulatorem ró nicowania i aktywnoœci kappa B (NF B nuclear factor B), czynnik AP-1 komórek Th2 jest czynnik GATA-3, którego (activation protein 1), jak równie czynnik j¹drowy ekspresja w tych komórkach w przeciwieñstwie do aktywowanych komórek T (NFATc nuclear factor limfocytów Th1 jest bardzo wysoka. Hamowanie of activated T cells), przekaÿnik sygna³u i aktywator ekspresji GATA-3 poci¹ga za sob¹ spadek transkrypcji STAT-6 i GATA-3 (14). produkcji wszystkich cytokin profilu Th2, a szczególnie IL-5. Antagonistyczn¹ cz¹steczk¹ Uk³ad NF B / I B w stosunku do GATA-3 jest bia³ko T-bet. (16, 17, NF B jest powszechnie obecnym czynnikiem 18). transkrypcyjnym, który nasila zapaln¹ i immunologiczn¹ odpowiedÿ komórek. Jest hetrodimerem Rola uk³adu kinaz seryna / treonina sk³adaj¹cym siê z bia³ka p50 i transkrypcyjnie Jest to drugi i równie wa ny obok czynników aktywnej podjednostki p65 (inna nazwa spotykana transkrypcyjnych uk³ad przewodzenia i regulacji w literaturze RelA). W formie nieaktywnej sygna³ów w komórce zapalnej. Jego elementy poszczególne sk³adowe utrzymywane s¹ w cyto- zosta³y omówione w dalszej czêœci opracowania. plazmie dziêki bia³ku ochronnemu I B. Sygna³ Tutaj nale y jedynie zwróciæ uwagê, e obydwa zewnêtrzny na przyk³ad. TNF, docieraj¹c do uk³ady (czynniki traskrypcyjne, kinazy bia³kowe), komórki ³¹czy siê z odpowiednim receptorem pozostaj¹ ze sob¹ we wzajemnym powi¹zaniu. b³onowym zwi¹zanym z uk³adem kinazy tyrozynoczynników transkrypcyjnych, z nastêpow¹ ich Fosforylacja niektórych bia³ek prekursorów dla wej. Kaskada fosforylacji aktywuje w koñcu kinazê bia³ka inhibitorowego B IKK, która z kolei aktywizacj¹, odbywa siê dziêki dzia³aniu enzymów fosforyluje bia³ko ochronne I B, które ulega uk³adu kinaz seryna / treonina. I tak na przyk³ad od³¹czeniu. Podjednostki p50 i p65 ulegaj¹ pre-aktywacja receptora GR przez agonistów translokacji do j¹dra komórkowego i ³¹cz¹ siê receptora beta adrenergicznego (BAR) przebiega w aktywny heterodimer. Tam przy wspó³udziale poprzez jego fosforylacjê z udzia³em enzymów koaktywatorów transkrypcji (CPB CREB binding rodziny MAP kinazy. Analogicznie aktywacja proteine) odnajduj¹ odpowiednie miejsce wi¹zania czynnika GATA-3 odbywa siê dziêki kinazie p38 z DNA (trans- aktivation biding element) i nasilaj¹ (19). transkrypcjê genu pro- zapalnego np. GM-CSF (tab.1) (13,14,15). Mechanizmy dzia³ania steroidu w komórce 1. Regulacja transkrypcji genów przez GR AP-1 a. bezpoœredni wp³yw na transkrypcjê Pocz¹tek aktywizacji AP-1 jest bardzo podobny b. oddzia³ywanie bezpoœrednie typu bia³kojak w przypadku NF B. W tym przypadku podob- bia³ko ( cross-talk ) z innymi czynnikami ALERGIA 3(25)/2005 23

1 TABELA transkrypcyjnymi receptory dla mineralokortykoidów, estrogenów, c. regulacja procesów remodelingu hormonów tarczycy, kwasu retinoidowego i wita- (przebudowy) chromatyny miny D (12). 2. Post-trankrypcyjna regulacja ekspresji genów Receptory GR kodowane s¹ przez pojedynczy przez GR gen po³o ony w regionie 5q31p. Sk³ada siê on z 9 a wp³yw na transport i metabolizm mrna oraz exonów, z tym, e jedynie exony 2-9 odpowiadaj¹ translacjê bezpoœrednio za kodowanie bia³ka, natomiast 3. Nie- genomiczne, szybkie efekty steroidowe. promotor mo e wystêpowaæ w trzech ró nych postaciach (1A, 1B i 1C). Ich znaczenie nie jest do Receptor glukokortykoidowy GR koñca wyjaœnione. jako czynnik transkrypcyjny Alternatywny splicing jest odpowiedzialny za Glukokortykoidy wykazuj¹ wielorakie efekty wystêpowanie u ludzi dwóch izoform receptora w odniesieniu do licznych komórek. Produkowane hgr i hgr. Klasyczny receptor (hgr ) sk³ada przez korê nadnerczy w odpowiedzi na stres i bior¹ siê z 777 aminokwasów, natomiast izoforma. jest udzia³ w istotnych procesach fizjologicznych takich krótsza od strony C terminalnej i liczy 734 jak regulacja metabolizmu glukozy, bia³ek, lipidów, aminokwasy. wp³ywaj¹ na rozwój komórek i ich zaprogramowan¹ Konstytutywnie izoforma hgr, w przeciwieñœmieræ, a tak e, a mo e przede wszystkim, s¹ jednym z kluczowych elementów regulacji stwie do formy, wystêpuje w j¹drze komórkowym procesów zapalenia i odpowiedzi immunologiczi jest pozbawiona mo liwoœci wi¹zania steroidów. nej, bêd¹c ich naturalnym supresorem (12) Jej fizjologiczna rola jest nadal przedmiotem Wiêkszoœæ efektów dzia³ania glukokorykosterojej nasilon¹ ekspresjê w niektórych przypadkach kontrowersji, niemniej coraz czêœciej podkreœla siê idów na poziomie komórkowym ujawnia siê poopornoœci na glukokortykosteroidy. Ponadto przez interakcje naturalnego hormonu, b¹dÿ jego syntetycznego odpowiednika, z receptorem GR. wykazano, e takie cytokiny pro- zapalne jak TNF Receptor GR nale y do nad- rodziny i IL-1 zwiêkszaj¹ ekspresjê hgr (12,27). receptorów j¹drowych, która obejmuje równie Struktura recptorów GR Receptor GR posiada modularn¹ strukturê, Wybrane cytokiny prozapalne i ich czynniki transkrypcyjne (15) w której mo na wyró niæ trzy zasadnicze obszary; N-koñcow¹ domenê transaktywacyjn¹, centraln¹ domenê wi¹ ¹c¹ DNA i C-koñcow¹ domenê wi¹ ¹c¹ ligandy. Domena transaktywacyjna (AF-1) pozwala na oddzia³ywanie aktywowanego receptora z innymi czynnikami transkrypcyjnymi i koaktywatorami transkrypcji. Domena centralna wraz z tzw. palcami cynkowymi decyduje o docelowym miejscu wi¹zania na DNA, o dimeryzacji receptora (obszar tzw. pêtli dimeryzacyjnej ) oraz aktywacji lub represji transkrypcji. Wreszcie domena wi¹ ¹ca ligandy u ycza swoich miejsc wi¹ ¹cych dla hormonu (kortyzol), leku (np. izomaœlan cyklezonidu), bia³ka ochronnego hsp90 i hsp70 i koaktywatorów receptora (12,27). Podstawowe mechanizmy dzia³ania GR Receptory GR bior¹ udzia³ we wszystkich procesach regulowanych przez glukokortykosteroidy. W komórkach nie zwi¹zanych z uk³adem odpornoœciowym (od hepatocytów, poprzez komórki nab³onka, a do neuronów) receptory glukokortykosteroidowe reguluj¹ liczne geny koduj¹ce enzymy zwi¹zane g³ównie z metabolizmem wêglowodanów, aminokwasów, hormonów, ich receptorów, bia³ek ostrej fazy i innych bia³ek osocza (21,27). W komórkach odpornoœciowych oraz komórkach zapalenia alergicznego hamuj¹ nadekspresjê pro- zapalnych cytokin i wp³ywaj¹ na procesy proliferacji, apoptozy oraz nabywania kompetencji immunologicznych przez te komórki (np. hamowanie poprzez cross-talk GATA-3). Receptory GR reguluj¹ ekspresjê wymienionych genów poprzez cztery zasadnicze mechanizmy: 1. bezpoœrednie aktywowanie transkrypcji poprzez oddzia³ywanie z tzw. glukokortykoidowym miejscem wi¹zania GRE (glucukortycoid responsive element) w czêœci 24 ALERGIA 3(25)/2005

promotorowej podlegaj¹cego regulacji przez Wiele innych, poza wymienionymi, koaktywasteroid genu. torów bierze udzia³ w przebudowie chromatyny 2. hamowanie docelowego genu w podobnym jak j¹drowej. Zespó³ bior¹cych udzia³ w ca³ym opisano powy ej, bezpoœrednim mechanizmie procesie koaktywatorów decyduje o selektywnej poprzez ³¹czenie z tzw negatywnym GRE trankrypcji okreœlonego genu (12) (ngre). Wiêkszoœæ efektów metabolicznych, równie 3. poœrednie regulowanie transkrypcji genów tych odpowiedzialnych za efekty niepo ¹dane poprzez oddzia³ywanie z innymi czynnikami towarzysz¹ce terapii przeciwzapalnej, zwi¹zanych transkrypcyjnymi (cross-talk). jest z dzia³aniem glukokortykosteroidów zgodnie 4. wp³yw na procesy remodelingu chromatyny z opisanym powy ej mechanizmem. i hamowanie intensywnoœci transkrypcji genów Nieliczne, pozytywne w sensie kontroli zapalenia, efekty zale ne od tego mechanizmu to Aktywacja i translokacja receptora GR transkrypcja bia³ka I B, lipokortyny 1 i BAR Pierwszy etap transmisji informacji przez GR ( adrenergic receptor) (12,13,14). jest podobny zarówno w komórkach zapalenia jak i innych tkankach. W sytuacji braku hormonu (leku) Bezpoœrednia represja aktywnoœci genów receptor hgr rezyduje w cytoplazmie komórki przy udziale GR jako z³o ony kompleks wraz z bia³kiem ochronnym Receptor GR mo e w pewnych sytuacjach hsp 90 (heat shock protein) i hsp 70, immunofilin¹ hamowaæ transkrypcjê genów poprzez tzw. p59 i fosfoprotein¹ p23. Bia³ko ochronne hsp 90 negatywne GRE (ngre) w dwóch mechautrzymuje GR w stanie konformacyjnym nizmach. Pierwszy z nich zak³ada konkurencyjne charakteryzujacym siê wysokim powinowactwem ³¹czenie zdimeryzowanej cz¹steczki GR z miejdo ligandu i sta³¹ retencj¹ w cytoplazmie. scem wi¹zania innych czynników transkrypcyjnych. Przy³¹czenie odpowiedniego agonisty (kortyzol lub W ten sposób regulowana jest aktywnoœæ genów steroid przeciwzapalny) indukuje uwolnienie bia³ka koduj¹cych osteokalcynê i prolaktynê (12). hsp 90 z nastêpow¹ zmian¹ konformacyjn¹ Spadek stê enia osteokalcyny w surowicy jest prowadz¹c¹ do translokacji kompleksu do j¹dra miêdzy innymi czu³ym wskaÿnikiem systemowego komórkowego (27). dzia³ania steroidów wziewnych. Drugi mechanizm opiera siê na bezpoœredniej Bezpoœrednia aktywacja bliskoœci wi¹zania dimeru GR i czynnika trankrypcji genów przez GR transkrypcyjnego AP-1 na DNA. W takiej sytuacji W j¹drze komórkowym, aktywowany, zwi¹zany powstaj¹ warunki dla oddzia³ywania receptora GR z hormonem receptor GR ³¹czy siê w pary z jedn¹ z podjednostek AP-1, bia³kiem c-jun. Na tej (dimeryzacja). Wydaje siê, ze dimeryzacja jest drodze dochodzi do represji genów np. dla pro- preferowana w sytuacji niskich stê eñ ligandu, co opiomelanokortyny, czy te hcrh, czego klinicznoodpowiada³oby fizjologicznemu podstawowemu biochemicznym wyk³adnikiem jest zahamowanie wydzielaniu kortyzolu. Kluczowe znaczenie dla produkcji kortyzolu. Prwdopodobnie równie tego procesu ma zestaw aminokwasów tworz¹cych represja genów dla receptora typu 1 VIP (type 1 tzw. pêtlê dimeryzacyjn¹ (D-loop) Punktowa vasoactive intestinal polypeptide receptor) i mutacja w jej obrêbie (A458T) powoduje ca³kowit¹ insuliny, odbywa siê zgodnie z jednym z wymieutratê wp³ywu sterydu na metabolizm tkankowy, nionych mechanizmów. (12) podczas gdy wiêkszoœæ efektów przeciwzapalnych pozostaje zachowana lub wrêcz nasilona (21,28). Poœrednia represja aktywnoœci genów Aktywowany dimer wi¹ e siê za pomoc¹ palcy przy udziale GR cynkowych ze spiral¹ DNA. Domena wi¹ ¹ca Receptor glukokortykoidowy mo e równie DNA receptora rozpoznaje palindromiczn¹ hamowaæ aktywacjê genów w sposób niezale ny sekwencjê nukleotydow¹ zwan¹ GRE (patrz od bezpoœredniego oddzia³ywania z DNA. powy ej), zazwyczaj zlokalizowan¹ w czêœci Odbywa siê to poprzez bezpoœrednie promotorowej (obszar cis- regulacyjny) genów odzia³ywanie bia³ko-bia³ko (cross-talk) receptorów podlegaj¹cych bezpoœredniej regulacji przez GR z innymi pozaj¹drowymi czynnikami steroid. GRE ró ni siê w zale noœci od typu transkrypcyjnaymi, takimi jak NF B, AP-1, NFAT, promotora co do sekwencji i lokalizacji, zw³aszcza STAT. Jest to g³ówny mechanizm regulacji przez w odniesieniu do miejsc wi¹zania innych glukokortykosteroidy odpowiedzi immunologicznej czynników transkrypcyjnych i koaktywatorów. W ten i zapalnej ustroju (15,21). sposób konkretny gen podlega aktywacji lub Wymaga on wy szych stê eñ ligandu, co represji. Wi¹zanie GR do DNA w czêœci fizjologicznie odpowiada³oby wyrzutowi kortyzolu promotorowej genu powoduje allosterycznie w reakcji na stres, (np. wtargniecie obcego indukowane zmiany konformacyjne w obrêbie antygenu). Substytutem wysokich stê eñ kortyzolu samego receptora. S¹ one sygna³em dla rekrutacji jest najprawdopodobniej zwiêkszone powinowackoaktywatorów transkrypcji maj¹cych kluczowe two receptorowe steroidów wziewnych, znaczenie dla przebudowy struktury chromatyny stosowanych w celu t³umienia reakcji zapalnej. j¹drowej (chromatine remodeling) (CREB Cechê tê (choæ w ró nym nasileniu) posiadaj¹ i p/caf). Oba wymienione bia³ka posiadaj¹ wszystkie steroidy wziewne obecnie stosowane wewnêtrzn¹ aktywnoœæ acetylazy histonowej. w leczeniu astmy. Acetyluj¹ one reszty lizynowe histonów W takich warunkach aktywowany receptor GR uruchamiaj¹c w ten sposób proces roz³¹czania preferencyjnie pozostaje w formie monomeru. nukleosomów i rozpl¹tywania nici DNA (21). Jest to Udowodniono na modelu zwierzêcym warunek rozpoczêcia transkrypcji. dim/dim (transgeniczne myszy GR, które maja ALERGIA 3(25)/2005 25

uszkodzon¹ pêtle dimeryzacyjn¹), e efekty przed uszkodzeniem i w ten sposób ujawnia swój przeciwzapalne steroidów zwi¹zane s¹. g³ównie efekt przeciwzapalny (22,23). z antagonistycznym wp³ywem aktywowanych receptorów GR na inne czynniki transkrypcyjne, Post-trankrypcyjny wp³yw na transport a zw³aszcza NF B. Efekt ten nie wymaga i metabolizm mrna oraz translacjê dimeryzacji receptora (21). Jednym z postulo- Ju niewielkie zmiany w stopniu acetylacji reszt wanych mo liwych sposobów oddzia³ywania lizynowych s¹ w stanie uruchomiæ procesy by³oby wzajemne hamowanie GR i aktywnej transkrypcji, dlatego te musz¹ istnieæ dodatkowe transkrypcyjnie podjednostki p65 NF B lub mechanizmy zapewniaj¹ce odpowiedni poziom krytycznej dla tworzenia heterodimerów AP-1 precyzji w procesie regulacji ekspresji genów (19). podjednostk¹ c-jun (15,21) Czêœciowo mog¹ one byæ zwi¹zane z regulacyjnym wp³ywem GR na tzw. stabilnoœæ mrna. Regulacja procesu trankrypcji poprzez Wiadomo, e w wielu przewlek³ych procesach wp³yw na remodeling chromatyny zapalnych np. reumatoidalnym zapaleniu stawów, W chromosomach DNA jest œciœle upakowane dochodzi do zwiêkszenia stabilnoœci mrna (19). w formie nukleosomów wokó³ bia³kowego trzonu. Aktywowany monomeryczny GR hamuje na Pojedynczy nukleosom sk³ada siê z bia³ek przyk³ad fosforylacjê seryny w pozycji 2 polimerazy histonowych i spiralnie nawiniêtego na te bia³ka RNA II, co zapobiega wyd³u aniu i ponawianiu fragmentu cz¹steczki DNA. Osiem cz¹steczek produkcji mrna. histonów rdzeniowych (po dwie cz¹steczki Wa niejszy jednak wydaje siê mechanizm histonów H2A, H2B, H3 i H4) ³¹czy siê ze sob¹, poœredni, polegaj¹cy na regulowaniu (hamowaniu) tworz¹c oktamer w kszta³cie dysku. Odcinek DNA akty wnoœ ci wewn ¹trz komó rkow ych uk³a dów o d³ugoœci 146 par zasad owija siê dooko³a tego syg nal iza cyj nyc h zwi ¹za nyc h z kas kad ¹ kompleksu bia³kowego i w ten sposób powstaje fosf ory lacy jn¹ zale n¹ od kina z ser ynordzeñ nukleosomu. Ekspresja oraz represja œciœle wo/treoninowych. Nale ¹ do nich tak istotne drogi zwi¹zane s¹ ze zmianami w opisanej strukturze przewodzenia informacji i aktywacji komórek chromatyny (21). zapalnych jak uk³ad kinazy MAP (MAPK mitogen- W komórkach zapalnych w stanie spoczynku activated protein kinase), kinazy regulowanej œcis³e upakowanie DNA wyklucza ³¹czenie siê DNA sygna³em zewnatrzkomórkowym (ERK extra z polimeraz¹ II RNA, która warunkuje tworzenie cellular regu lated kinase), uk³ad kinazy mrna. Acetylacja bia³ek histonowych przez CBP aktywowanej stresem / kinazy N-terminalnego (CREB binding protein), bia³ko koaktywatorowe koñca c-jun (SAPK/JNK steress activated protein posiadaj¹ce wewnêtrzna aktywnoœæ transacetylazy kinase / N-terminal kinase), kinazy p38 (zwanej histonowej (HAT), jak to wspomniano powy ej, ma tak e SAPK 2) oraz kinazy I B. kluczowe znaczenie dla rozluÿnienia struktury Dok³adne omawianie tych skomplikowanych chromatyny. Jeœli dochodzi do oddzia³ywania mechanizmów przekracza ramy niniejszego czynnika CBP z czynnikiem transaktywacyjnym opracowania. Wymienione uk³ady kinaz wp³ywaj¹ (NF B, AP-1, STAT, GATA-3) ca³y proces zarówno na transkrypcjê, jak i przede wszystkim transkrypcji ulega znacznemu nasileniu. W ten translacjê, genów pro-zapalnych i s¹ obok sposób proces trankrypcji genu pro- zapalnego zwiêkszonej ekspresji czynników transkrypcyjnych jest œciœle zwi¹zany z aktywacj¹ HAT (transferazy g³ównymi mechanizmami patologicznej regulacji hiostonowej) i acetylacj¹ bia³ka histonowego. zapalnej w astmie. S¹ one równie celem post- W komórce istnieje mechanizm równowa ¹cy, transkrypcyjnego, hamujacego wp³ywu steroidów który wykorzystuje enzym deacetyluj¹cy histony i GR na procesy alergiczne. i pr zy wr ac aj ¹c y sp oc zy nk ow ¹ st ru kt urê Na tej drodze steroidy wywo³uj¹ miêdzy innymi chromatyny j¹drowej deacetylaza histonowa, post- transkrypcyjn¹ represjê takich genów jak IL- HDAC (histone deacetylase). Jest to w³aœciwie 1, VEGF (naczyniowy, endotelialny czynnik zespó³ enzymów, podzielonych na II klasy. wzrostowy), TNF, IL-6, IL-8, COX-2, eotaksyna Represja genów zale y wiêc bezpoœrednio od (19). zahamowania, czy te odwrócenia reakcji acetylacji histonów, a wiêc procesu kontrolo- Nie-genomiczne efekty dzia³ania steroidów wanego przez HDAC. Historyczne badania i obserwacje efektów Receptory GR w formie aktywnych monomerów farmakodynamicznych steroidów sugerowa³y, e oprócz poœredniego hamowania HTA poprzez niektóre z nich wystêpuj¹ w relatywnie krótkim oddzia³ywanie z czynnikiem j¹drowym np. NF B, czasie od podania leku i dlatego nie mog¹ byæ zwiêkszaj¹ rekrutacjê HDAC ze stale kr¹ ¹cego t³umaczone wp³ywem regulacyjnym na transkrypmiêdzy cytoplazm¹ a j¹drem kompleksu cjê genów, co wymaga³oby d³u szego czasu. enzymatycznego. W ten sposób dochodzi do Znane s¹ przyk³ady efektów dzia³ania steroidów zahamowania transkrypcji genów pro- zapalnych. obserwowane in vitro, które ujawniaj¹ siê w ci¹gu Kluczowy dla represji genów przy udziale minut lub nawet sekund, a wiec w czasie steroidów i GR kompleks HDAC, jest niezwykle wykluczaj¹cym produkcjê bia³ek de novo (19, 28). podatny na utlenianie. Aktywne rodniki tlenowe, Nie- genomiczne efekty dzia³ania steroidów szczególnie obficie wydzielane w trakcie tzw. maj¹ charakter heterogenny, ale nie s¹ zwi¹zane stresu oksydacyjnego zmniejszaj¹ aktywnoœæ z ekspresj¹ genów. Charakteryzuj¹ siê nastê- HDAC. Prawdopodobnie dlatego u pal¹cych puj¹cymi cechami: astmatyków efektywnoœæ przeciwzapalna 1. szybkim efektem czasowym, steroidów wziewnych jest wyraÿnie mniejsza. 2. odmiennym, najczêœciej nie zwi¹zanym Istniej¹ równie sugestie, e teofilina chroni HDAC z receptorem GR mechanizmem farmakologicz- 26 ALERGIA 3(25)/2005

nym, nych. Wa ne s¹ równie efekty nie zwi¹zane 3. wystêpowaniem równie w komórkach z regulacj¹ ekspresji genów (niegenomiczne). Ca³y pozbawionych j¹der, system regulacyjny wspó³czeœnie wyobra amy 4. mog¹ byæ mediowane przez analogi steroidowe sobie jako subteln¹ równowagê bia³ek œrodowiska trwale zwi¹zane z bia³kami osocza, które wewn¹trzkomórkowego, utrzymywan¹ dziêki w ogóle nie przedostaj¹ do kompartmentu wzajemnym oddzia³ywaniom bezpoœrednim komórkowego. ( cross-talk) pomiêdzy uczestnikami procesu. W komórkach immunologicznie kompetentnych W ostatnim okresie wykrywane s¹ ró ne, coraz i komórkach zapalenia poznaliœmy tylko niektórych to nowe przyk³ady nie-genomicznych mecha- bohaterów tego dynamicznego uk³adu (NF B, nizmów farmakologicznych dzia³ania steroidów. AP-1, NFAT, STAT, GATA i inne), niemniej wiemy, e Obejmuj¹ tak odmienne efekty jak np. modyfikacjia receptor GR i jego ligand glukokortykoid jako przepuszczalnoœci b³on komórkowych i pomp aktywator, graj¹ rolê g³ównego supresora - szeryfa. jonowych przez lipofilne steroidy, interakcjê z b³o- Nowe mechanizmy i teorie nie tylko s¹ atrakcyjne nowymi receptorami (mgr) i apoptozê komórek poznawczo, ale wyraÿnie ukierunkowuj¹ badania zapalnych, czy te nie- genomiczne hamowanie nad lekami steroidowymi przysz³oœci. Badacze produkcji enos (endotelialna syntetaza tlenku maj¹ œwiadomoœæ, e w astmie steroidy ze azotu) w endotelium za poœrednictwem wzglêdu na wielokierunkowoœæ dzia³ania s¹ klasycznego receptora GR. i najprawdopodobniej bêd¹ w najbli szej Niektóre z efektów nie zwi¹zanych z regulacj¹ przysz³oœci, lekami nie do zast¹pienia. Co nie ekspresji genów wymagaj¹ wysokich stê eñ leku. Takim przyk³adem jest zapobieganie pourazowemu oznacza, e nie mo na wyprodukowaæ jeszcze obrzêkowi rdzenia przez podawanie do ylnie doskonalszych cz¹steczek (29). Szukamy zatem bardzo wysokich dawek steroidów, inne zaœ glukokortykosteroidu lub jego analogu, który jest wystêpuj¹ ju przy niskich stê eniach steroidu (19). lipofilny, ma wysokie powinowactwo do klasycznego receptora GR, a wiêc preferencyjnie Podsumowanie aktywuje go w kierunku wytwarzania form Burzliwy rozwój wiedzy na temat mechanizmów monomerycznych i hamowania czynników dzia³ania steroidów potwierdza, e s¹ one transkrypcyjnych. Szukamy cz¹steczki, która przy g³ównymi regulatorami procesów immunologiczuk³adami sygnalizacyjnymi komórek, a wreszcie tym nie traci zdolnoœci oddzia³ywania z innymi nych i zapalnych ustroju. Regulacja ta odbywa siê na kilku piêtrach i obejmuje zarówno ró nicowanie leku, który precyzyjnie dzia³a w tylko uk³adzie i dojrzewanie komórek immunologicznie kompetenwysok¹ oddechowym, w formie która zapewnia w nim tnych, aktywacjê i apoptozê komórek zapalenia koncentracjê. Jak te trudne do alergicznego oraz regulacjê ekspresji genów jednoczesnego spe³nienia postulaty uda³o siê odpowiedzialnych za produkcjê bia³ek pro- farmakologom spe³niæ postaram siê przedstawiæ w zapalnych, w aktywowanych komórkach zapal- nastêpnej czêœci opracowania.! Piœmiennictwo 1. www.ginastma.com 2. Inhaled Steroids in Asthma, Claude Lenfant. Lung Biology in Health and Disease; vol:163. Marcell Dekker, Inc, New York, 2002. 3. Stephens L. A., Mottet C, Mason D. & Powrie, F.Human CD4+CD25+ thymocytes and peripheral T cells have immune suppressive activity. Eur. J. Immunol, 2001; 31: 1247 1254. 4. Neaville WA, Tisler C, Bhattacharya A et al. Developmental cytokine response profiles and the clinical and immunologic expression of atopy during the first year of life. J Allergy Clin Immunol, 2003; 4: 740-746. 5. McIntire JJ et al. Identification of Tapr (an airway hyperreactivity regulatory locus) and the linked gene family. http//immunol.nature.com.,2001; 2: 20. 6. Reed ChE, Milton DK A Endotoxin-stimulated innate immunity: contributing factor for asthma. Allergy and Clin Immunol, 2001: 108 (2): 157-166. 7. Wills-Karp M, Santeliz J and Karp ChL. The germless theory of allergic disease:revisiting the hygiene hypothesis. Nature reviews/immunology, 2001; 1: 69. 8. Aronica MA, McCarthy S, Swaidani S, et al. Recall Helper T Cell ResponseT Helper 1 Cell resistant Allergic Susceptibility without Biasing UncommittedCD4 T Cells. Am J Respir and Crit Care Med, 2004; 169: 588-599. 9. Vermaelen K and Pauwels R. Pulmonary dendritic cells. Am J Respir Crit Care Med, 2005; 172: 530-551. 10. Theofilopoulos AN, Dummer W, Kono DH. T cell homeostasis and systemic autoimmunity.j Clin Invest. 2001 Aug 1; 108(3): 335-340. 11. Liu AH and Murphy JR. Hygiene theory: fact or fiction. Allergy and Cin Immunol, 2003; 111: 471-478. 12. Georas SN. Inhaled glucocorticoids, lymphocytes, and dendritic cells in asthma and obstructive lung disease. Proc Am Thorac Soc, 2004; 1: 215-221. 13. Necela BM, Cidloski JA. Mechanisms of glucocorticoid receptor action in noninflamatory and inflamatory cells. Proc Am Thorac Soc, 2004; 1: 239-246. 14. Belvisi GM. Regulation of inflammatory cell function by corticosteroids. Proc Am Thorac Soc, 2004; 1: 207-214. 15. De Bosscher K, Berghe WV, Haegeman G. The interplay between the glucocorticoid receptor and nuclear factor -?B or activator protein- 1: molecular mechanisms for gene repression. Endo Review, 2003; 24(4): 488-522. 16. Mathew A, MacLean JA, DeHaan E, Tager AM, Green FH, Luster AD. Signal transducer and activator of transcription 6 controls chemokine production and T helper cell type 2 cell trafficking in allergic pulmonary inflammation. J Exp Med 2001;193:1087 1096. 17. Pernis AB, Rothman PB. JAK-STAT signaling in asthma. J Clin Invest., 2002; 15; 109(10): 1279-1283. 18. Ray A Cohn L. Th2 cells and GATA-3 in asthma: new insights into the regulation of airway inflammation. The J Clin Invest, 1999; 104 (8):985-993. 19. Stellato C. Post-transcriptional and nongenomic effects of glucocorticosteroids. Proc Am Thorac Soc, 2004; 1: 255-263. 20. Phuc Le P, Friedman JR, Schug J, Brestelli JE, Parker JB, Bochkis IM, Kaestner KH. Glucocorticoid Receptor-Dependent Gene Regulatory Networks. PLoS Genet. 2005 Aug; 1(2): e16. 21. Reichardt HM, Tuckermann JP, Göttlicher M et al. Repression of inflamatory responses in the absence of DANN binding by the glucocorticoid receptor. The EMBO Journal, 2001; 20 (24): 7168-7173. 22. Adcock IM, Ito K, Barnes JP. Glucocorticoids. Effects on gene transcription. Proc Am Thorac Soc, 2004; 1: 247-254. 23. Ito K, Ito M, ElliotWM et al. Decreased histone deacetylase activity in chronic obstructive pulmonary disease. N Engl J Med. 2005 May 12;352(19):1967-76. 24. Barnes P. Theophylline: New Perspectives for an old drug. Am J Respir Crit Care Med., 2003: 167:813-818. 25. Limbourg FP, Huang Z, Plumier J-Ch et al. Rapid nontranscriptional activation of endothelial nitric oxide synthase mediates increased cerebral blood flow and stroke protection by corticosteroids. The J Clin Invest, 2002; 110 (11): 1729-1738. 26. Buttgereit F, Scheffold A. Rapid glucocorticoid effects on immune cells. Steroids 2002; 67: 529-534. 27. McKay LI, Cidlowski JA. Molecular control of immune/inflamatory responses: interactions between nuclear factor-??b and steroid receptor signaling pathways. Endo Rewiev, 1999; 20 (4):435-459. 28. Lipworth BJ. Therapeutic implications of non-genomic glucocorticoid activity. Lancet, 2000: 365: 87-89. 29. Schäcke H, Schottelius A, Döcke W-D et al. Dissociation of transactivation from transrepression by a selective glucocorticoid receptor agonist leads to separation of therapeutic effects from side effects. PNAS, 2004; 101(1): 227-232. ALERGIA 3(25)/2005 27