WPŁYW EKSTRAKTÓW Z ALOESU ( ALOE BARBADENSIS MILLER

Prof. dr hab. Piotr Szeleszczuk Szkoła Głowna Gospodarstwa Wiejskiego Wydział Medycyny Weterynaryjnej Katedra Patologii i Diagnostyki Weterynaryjnej Zakład Chorób Ptaków 02-786 Warszawa ul. Ciszewskiego 8 Warszawa, 2018.09.07 RECENZJA rozprawy doktorskiej mgr Darii Dziewulskiej pod tytułem WPŁYW EKSTRAKTÓW Z ALOESU (ALOE BARBADENSIS MILLER) I LUKRECJI (GLYCYRRHIZA GLABRA) NA REPLIKACJĘ PARAMYKSOWIRUSA GOŁĘBIEGO (PPMV-1) ORAZ NA WYBRANE ZJAWISKA ODPORNOŚCIOWE U GOŁĘBI Oceny dokonano na wniosek prof. dr hab. Bogdana Lewczuka (WMW-DZ.6360.6.2018), Dziekana Wydziału Medycyny Weterynaryjnej Uniwersytetu Warmińsko-Mazurskiego w Olsztynie na podstawie art.13 ust.1. Ustawy o stopniach naukowych i tytule naukowym z dnia 14 marca 2003 roku (Dz.U. z 2003 r. Nr 65, poz. 595; z 2005 r. Nr 164, poz. 1365). Wstęp Z paramyksowirozą gołębi czyli zakażeniem wariantem gołębim wirusa rzekomego pomoru drobiu związana jest spora części aktywności zawodowej recenzenta (Szeleszczuk P.: Trzydzieści lat immunoprofilaktyki chorób gołębi w Polsce. Życie Wet. 90, 603-609, 2015), stąd z dużym zainteresowaniem śledziłem i śledzę krajowe badania prowadzone na gołębiach z wykorzystaniem tego groźnego, dla tych wyjątkowych ptaków, patogenu. Wirusy APMV-1 występujące u gołębi różnią się antygenowo i genetycznie od szczepów izolowanych od innych gatunków drobiu i zostały zakwalifikowane do grupy tzw. wariantów gołębich APMV-1 oznaczanych skrótem PPMV-1. Patolodzy gołębi od lat używają na określenie zakażenia wariantem gołębim wirusa rzekomego pomoru drobiu terminu paramyksowiroza. Wcześniej używano też w krajowym piśmiennictwie określenia paramyksowirozowa choroba gołębi. Jest oczywiste, że określenie paramyksowiroza gołębi wprowadzone w połowie lat osiemdziesiątych w Wielkiej Brytanii, ma na celu uniknięcie skojarzeń z rzekomym pomorem drobiu, chorobą od dziesiątek lat urzędowo zwalczaną i niosącą za sobą restrykcje formalne. Autorka w swojej pracy używa również określenia paramyksowiroza 1

gołębi, co wskazuje na jej znajomość nomenklatury kolumbopatologicznej. W ocenie klinicznej epidemiologia zakażeń PPMV-1 w Polsce miała kilka wyraźnie różniących się okresów. Największe żniwo zebrała ostra postać kliniczna tej infekcji z dominującymi objawami ze strony układu nerwowego, która dziesiątkowała stada gołębi do czasu wprowadzenia na szeroką skalę szczepień profilaktycznych (czyli od roku 1984 do roku 1999). Ocenia się, że populacja gołębi hodowlanych obniżyła się nawet o połowę. Stopniowo choroba zmieniała swój charakter z neuropatycznego na nefropatyczny. Przez wiele lat, do mniej więcej 2010 roku paramyksowiroza nie stanowiła problemu klinicznego u prawidłowo zaszczepionych gołębi. Od kilku lat pojawią się w Polsce przypadki choroby w stadach szczepionych, które zdają się wskazywać na introdukcję bardziej patogennych szczepów PPMV-1 (Szeleszczuk i wsp., 2016) lub pojawienie się szczepów atypowych (Śmietanka i Minta, 2011). Paramyksowiroza jest szczególnie groźna dla młodych gołębi, z uszkodzonym układem odpornościowym, zatem badania wykonane przez doktorantkę należy traktować, jako modelowe, a wybór tematyki badań jest z pewnością wynikiem dużego zaangażowania klinicznego promotora, dr hab. Tomasza Stenzla, prof. nadzw. UWM. W Katedrze Chorób Ptaków, Wydziału Medycyny Weterynaryjnej w Uniwersytetu Warmińsko-Mazurskiego w Olsztynie, kierowanej przez Prof. dr hab. Andrzeja Koncickiego, intensywne, stojące na światowym poziomie badania naukowe na gołębiach prowadzane są od ponad 10 lat. W 2010 roku promotor recenzowanej rozprawy dr hab. Tomasz Stenzel, prof. nadzw. UWM obronił pracę doktorską pt.: Wpływ różnych immunomodulatorów na wybrane parametry odporności nieswoistej i swoistej u gołębi (Columba livia domestica) oraz przebieg zakażenia paramyksowirusem gołębim (PPMV-1). Doświadczania warsztatowe wykorzystał z pewnością przy planowaniu pracy doktorskiej zrealizowanej przez Panią mgr Darię Dziewulską. Bez wątpienia zakażenie wariantem gołębiego wirusa rzekomego pomoru drobiu jest jednym z niezwykle istotnych problemów dla hodowli gołębi, stąd ważność i aktualność podjętych przez panią magister badań. Ostatnio miałem również sposobność recenzowania rozprawy doktorskiej dr wet. Moniki Olszewskiej-Tomczyk, pod tytułem Ocena wrażliwości różnych gatunków drobiu na zakażenie wariantem gołębim wirusa choroby Newcastle, która to praca choć formalnie nie dotyczyła gołębi, ale wariantu gołębiego wirusa rzekomego pomoru drobiu, to jednak wykonana była na gołębiach i podawała wiele informacji przydatnych dla kolumbopatologa (obrona tej ciekawej pracy zrealizowanej w Zakładzie Chorób Drobiu, Państwowego Instytutu Weterynaryjnego Państwowego Instytutu Badawczego PIWET-PIB miała miejsce w roku 2017). Dr Olszewska-Tomczyk między innymi przeprowadziła oznaczenie 2

transkrypcyjnej ekspresji cytokin prozapalnych (IFNγ, IL-1β, IL-6, IL-8) oraz czynnika hamującego syntezę cytokin (IL-10) u ptaków zdrowych i zakażonych. Między innymi wykazała ona, że oddziaływanie wirusa PPMV-1 ocenione na podstawie ekspresji cytokin na poziomie mrna, wskazuje na aktywację wrodzonych komponentów odpowiedzi immunologicznej. Nie ulega wątpliwości, że badania cytowanej autorki i badania mgr Darii Dziewulskiej bardzo znacząco poszerzają wiedzę na temat patogenezy zakażenia PPMV-1 u gołębi. Generalna, zasadniczo pozytywna uwaga, jaka nasuwa się po lekturze recenzowanej pracy doktorskiej Pani mgr Darii Dziewulskiej jest taka, iż doktorantka wykazała się rozległym, wysoce wyspecjalizowanym i bardzo nowoczesnym warsztatem badawczym. W świetle wcześniejszych uwag, jest oczywiste, że wybór tematu pracy doktorskiej uważam, za cenny i bardzo potrzebny zwłaszcza w aspekcie aktualnej sytuacji epidemiologicznej w populacji gołębi w kraju. Szczególnie dotyczy to badań prowadzanych technikami biologii molekularnej co było możliwe dzięki stworzeniu odpowiedniego zaplecza technicznego w Zespole Prof. Koncickiego. Ocena pracy doktorskiej Przedstawiona do oceny praca doktorska Wpływ ekstraktów z aloesu (Aloe barbadensis Miller) i lukrecji (Glycyrrhiza glabra) na replikację paramyksowirusa gołębiego (PPMV-1) oraz na wybrane zjawiska odpornościowe u gołębi została wykonana w Katedrze Chorób Ptaków, Wydziału Medycyny Weterynaryjnej w Uniwersytetu Warmińsko- Mazurskiego w Olsztynie, pod kierunkiem wybitnego kolumbopatologa dr hab. Tomasza Stenzel, prof. nadzw.uwm. Dysertacja posiada układ typowy dla opracowań na stopień naukowy i zawarta jest na 59 stronach uwzględniających 4 tabele, 7 rycin oraz podzielona jest na następujące rozdziały: wykaz skrótów, streszczenie, abstract, wstęp, cel, materiał i metody, wyniki, dyskusja, wnioski, oraz piśmiennictwo. Dla całościowej oceny dysertacji najbardziej istotne jest, że wyniki prac stanowiących podstawę do ubiegania się przez Panią magister Darię Dziewulską o tytuł doktora nauk weterynaryjnych zostały opublikowane w następujących artykułach: 1. Dziewulska D., Stenzel T., Śmiałek M., Tykałowski B., Koncicki A. An evaluation of the impact of aloe vera and licorice extracts on the course of experimental pigeon paramyxovirus type 1 infection in pigeons. Poultry Science. 2018;97(2):470-476. doi:10.3382/ps/pex341. 2. Dziewulska D., Stenzel T., Śmiałek M., Tykałowski B., Koncicki A. The impact of Aloe vera and licorice extracts on selected mechanisms of humoral and cell-mediated 3

immunity in pigeons experimentally infected with PPMV-1. BMC Veterinary Research. 2018;14:148. doi:10.1186/s12917-018-1467-3. Sumaryczna liczba punktów za te publikacje według MNiSW wynosi 80, zaś sumaryczny Impact Factor 3.68. Obie prace zamieszczono w jednych z najlepiej ocenianych czasopism docierających do szerokiego grona specjalistów z całego świata. Publikacja wyników, w tak prestiżowych tytułach jest najlepszym potwierdzeniem jakości i oryginalności badań zrealizowanych przez doktorantkę. W zgodnych oświadczeniach współautorów podnoszone jest, że udział mgr Darii Dziewulskiej w powstawaniu powyższych publikacji był wiodący, a wykonane prace są wyrazem jej własnych, oryginalnych hipotez. Doktorantka odegrała pierwszoplanowa rolę w koncepcyjnym przygotowaniu przeprowadzonych badań, analizie uzyskanych badań i wnioskowaniu. Szata edytorska ocenianej rozprawy jest bardzo staranna i estetyczna, zawiera ona dobrej jakości ryciny i czytelne tabele. Ogólne wrażenie z lektury dysertacji jest pozytywne i można stwierdzić, że recenzowana praca doktorska Pani mgr Darii Dziewulskiej napisana jest poprawnym językiem, spełnia wymogi merytoryczne i formalne stawiane opracowaniom na stopień naukowy doktora. Styl pracy jest bardzo zwięzły, opis metodyk badawczych świadczy o bardzo dobrym przygotowaniu warsztatowym, zwłaszcza w obszarze technik molekularnych, co nie dziwi, bowiem jest to zgodne z wykształceniem doktorantki (w 2010 roku ukończyła studia magisterskie na kierunku Biotechnologia na Wydziale Biologii i Biotechnologii Uniwersytetu Warmińsko-Mazurskiego w Olsztynie). Bardzo bogate i prawidłowo używane w tekście opracowania nazewnictwo fachowe świadczy o dobrym przygotowaniu merytorycznym badaczki. Dotyczy to szczególnie części poświęconej badaniom ekspresji genów. Na korzyść Doktorantki przemawia i to, że stara się przybliżyć zrozumienie wykonywanych badań opisując krótko i przystępnie zasady stosowanych metodyk. Oczywiście w tak obszernym i obejmującym kilka bardzo specjalistycznych obszarów opracowaniu trudno nie popełnić nieścisłości i niezręczności językowych, których jednak doktorantka w zasadzie się ustrzegła. Między innymi doktorantka używa konsekwentnie skrótu dpi., który rozwija jako Day postinoculation i tłumaczy jako dzień po zakażeniu. W tym przypadku zapis winien brzmieć Day post-infection lub w tłumaczeniu, jako dzień po inokulacji. Niewłaściwe jest także określenie Jednodniowych kurcząt SPF (str.22.). Jednodniowe mogą być tylko pisklęta kurze SPF. Ponadto bardzo nieliczne literówki zaznaczono w tekście pracy. Cytowane w pracy doktorskiej, piśmiennictwo zamykające się stosunkowo niewielką liczbą 84 publikacji jest jednak w istocie wyborem starannie wyselekcjonowanych pozycji literaturowych potwierdzających opinie Autorki lub z nimi rozbieżne. Dobór piśmiennictwa 4

wskazuje na dojrzałość naukową i umiejętność wyboru bardzo bogatej, w generalnym zakresie stosowania fitobiotyków literatury źródłowej z drugiej jednak strony wskazuje na brak badań w tym temacie w odniesieniu do gołębi. Podkreślić należy, że Autorka równie starannie wyselekcjonowała pozycje piśmiennictwa krajowego wybierając, jak się wydaje, najbardziej reprezentatywne prace. W tej liczbie wszystkie najważniejsze prace z zakresu immunomodulacji u gołębi, których była współautorem, co potwierdza jej szerokie zainteresowanie tematem. Niestety nie zacytowała pracy doktorskiej dr wet. Moniki Olszewskiej-Tomczyk. Opiniowaną pracę doktorską rozpoczyna lapidarny wstęp, obejmujący 9 stron, krótko wprowadzający czytelnika w problematykę związaną z wybranymi do badań roślinami leczniczymi i zakażeniem wariantem gołębim wirusa choroby Newcastle. Bardzo popieram opinię Doktorantki, że stosowanie leków zawierających składniki roślinne do terapii i profilaktyki wirusowych chorób ptaków jest przyszłościowym rozwiązaniem (Szeleszczuk P., Żbikowski A., Dolka B., Nerc J., Adamczyk K., Rogala M.: Terapia wirusowych chorób drobiu - od teorii do praktyki. Wieliczko A. (red.): Aktualne problemy w patologii drobiu - stare di nowe wyzwania istotne w produkcji drobiarskiej. UP Wrocław. s. 57-65. ISBN: 978-83-7717-266-7. Niestety z powodów proceduralnych zasadniczo, nie ma w Unii Europejskiej zarejestrowanych weterynaryjnych leków roślinnych. Problemem, ten ze względów formalnych, jest łatwiejszy do rozwiązania u gołębi, bowiem w większości nie są one konsumowane przez człowieka (pocztowe i zdobne), niż w przypadku drobiu. Cieszy, że badania mgr Dziewulskiej wpisują się w nurt poszukiwań alternatyw dla stosowania przeciwdrobnoustrojowych produktów leczniczych weterynaryjnych w kolumbopatologii. Jest istotną wartością recenzowanej pracy doktorskiej, że jej autorka próbowała odpowiedzieć na pytanie o skuteczność fitoterapeutyczną aloesu i lukrecji w kontrolowanym doświadczeniu in vivo i warsztatowo trudnych, pogłębionych badaniach molekularnych. W podrozdziale 1.1.1. wstępu autorka omawia w syntetycznej formie dobrze poznaną przez naukowców roślinę leczniczą, jaką jest stosowany od wieków aloes zwyczajny. Liście tej rośliny zawierają 75 aktywnie biologicznych czynników, z których najważniejszą rolę odgrywa acemannan będący jednym z najsilniejszych immunomodulatorów pochodzenia roślinnego. Drugą rośliną wybraną do badań była lukrecja gładka, której korzeń zawiera ponad 400 związków bioaktywnych. Glicyryzyna wyosobniana z lukrecji posiada bardzo dobrze udokumentowane właściwości immunomodulujące. Oczywiście na rynku krajowym jest bardzo wiele preparatów dla gołębi określanych, jako dodatki paszowe suplementy, zawierających wyciągi z aloesu czy z lukrecji, jednak ich producenci nie przedstawiają 5

żadnych badań potwierdzających ich skuteczność. Rzadko też w opisach działania produktu informują, że zawierające je odżywki nie są lekami, choć opisy ich działania i stosowania nie pozostawiają wątpliwości, że takie właściwości zdają się posiadać. Nie ma tych danych także w piśmiennictwie światowym, stąd wykonane przez autorkę badania były w pełni oryginalne i poszerzyły wiedzę w tym zakresie. Dodatkowo stworzyły model badawczy do obiektywnej oceny działania preparatów roślinnych u gołębi. Możliwe i wskazane jest dołączenie do oceny innych parametrów, ale zaproponowany model opierający się na ocenie ekspresji genów kodujących receptory powierzchniowe limfocytów oraz metody cytometrii przepływowej jest autorskim rozwiązaniem mgr Dziewulskiej. Ciekawym fragmentem wstępu jest podrozdział 1.2. w którym doktorantka opisuje gołębi paramyksowirus typu 1 w powiązaniu z podejrzewanym o udział w etiologii choroby młodych gołębi (CMG) cirkowirusem gołębi (PCiV). Wyczerpująco, choć krótko autorka podaje dane na temat aktualnej pozycji taksonomicznej, budowy molekularnej PPMV-1 oraz kliniki i patologii paramyksowirozy gołębi. Ostatnia część tego rozdziału stanowi opis odpowiedzi immunologicznej w przebiegu zakażenia PPMV-1. W mojej ocenie wstęp jest bardzo zwięzłą i syntetycznie skomponowaną częścią pracy, wprowadzającą czytającego w całość zagadnień będących przedmiotem badań. Cel badań (rozdział 2) jest poprzedzony krótkim wstępem, w którym Autorka stwierdza, że PPMV-1 jest dobrze poznanym patogenem gołębi, niewymagającym skomplikowanego procesu diagnostycznego i stosunkowo łatwym do namnażania w warunkach laboratoryjnych. Z tego powodu podjęła badania mające na celu określenie wpływu ekstraktu z aloesu i lukrecji na przebieg zakażenia oraz na wybrane mechanizmy odporności humoralnej i komórkowej u gołębi podczas infekcji wirusowej na tym modelu doświadczalnym. Doktorantka sformułowała trzy szczegółowe zadania, których wykonanie zrealizuje cel pracy, czyli określi wpływ ekstraktu z aloesu i lukrecji na przebieg zakażenia oraz na wybrane mechanizmy odporności humoralnej i komórkowej u gołębi podczas infekcji wirusowej. Zadania te to: 1. Określenie czy ekstrakty z aloesu i lukrecji wpływają na replikację PPMV-1; 2. Wyjaśnienie czy namnażanie PPMV-1 jest zależne od dawki wymienionych ekstraktów; 3. Ocenę wpływu aloesu i lukrecji na mechanizmy odpowiedzi komórkowej i humoralnej u gołębi zdrowych klinicznie, jak i gołębi zakażonych PPMV-1. Trzeba zdecydowanie podkreślić, że każdy z obszarów, które Doktorantka badała wymagał przeprowadzenia pracochłonnych analiz i wyspecjalizowanego warsztatu badawczego na wysokim poziomie, którym dysponuje Katedra Chorób Ptaków, Wydziału 6

Medycyny Weterynaryjnej w Uniwersytetu Warmińsko-Mazurskiego w Olsztynie. W kolejnym, trzecim rozdziale dysertacji autorka charakteryzuje materiał i metody. Jak się wydaje lepszym rozwiązaniem mogłoby, być podanie opisu układu doświadczenia w punkcie 3.1. a nie na zakończenie tego rozdziału. Czytającemu łatwiej byłoby zrozumieć poszczególne protokoły po zapoznaniu się układem doświadczenia, które przeprowadzono na 120 gołębiach podzielonych na 10 grup, z których część (5 grup) zakażano PPMV-1 w koncentracji 10 6 EID50 w dawce 100µL na ptaka (po 50 µl wirusa nakrapiano na nozdrza i oka) (Podrozdział 3.8. Układ doświadczenia). Przez 7 dni po zakażeniu, raz dziennie ptakom z wybranych grup podawano per os wodny roztwór ekstraktu z aloesu lub lukrecji w dawce 300mg/kg m.c. lub 500mg/kg m.c. W 4,7 oraz 14 po zakażeniu od losowo wybranych gołębi z każdej grupy pobierano wymaz z kloaki. Następnie ptaki te poddano eutanazji i w trakcie badania anatomopatologicznego pobierano wycinki narządów wewnętrznych takich jak mózg, nerki, śledziona, trzustka oraz wątroba. Z próbek śledziony wyizolowano komórki mononuklearne, z których część posłużyła do oznaczania procentowego udziału limfocytów B IgM + metodą cytometrii przepływowej. Pozostałe komórki mononuklearne wykorzystano do oceny ekspresji genów kodujących receptory powierzchniowe limfocytów T (CD3, CD4, CD8) oraz interferon gamma (IFN-Ɣ) metodą względną real time PCR (qpcr). W pozostałych narządach oraz w wymazach z kloaki określano liczbę kopi RNA wirusa metodą ilościową (bezwzględną ) qpcr. Doktorantka rozpoczyna, jednak rozdział trzeci opisując materiał wykorzystany do badań. Z powodu braku komercyjnie dostępnych gołębi, o statusie wolnym od swoistych patogenów autorka musiała pokonać kilka pułapek metodologicznych. Dostępne są krajowe wytyczne (Dolka B., Szeleszczuk P.: Opracowanie parametrów do oceny zdrowia gołębi pocztowych i ozdobnych przeznaczonych do wykorzystania w badaniach eksperymentalnych. Mat. XIV Kongresu PTNW, Wrocław, 13-15 09,2012, str. 407) podające wymogi, jakie powinny być spełnione w tym zakresie. Jak wynika z opisu autorki użyte w tym eksperymencie ptaki to gołębie ozdobne rasy pawik, bowiem pozyskanie nieszczepionych przeciwko paramyksowirozie gołębi pocztowych (rasa najczęściej stosowana do badań) jest nierealne. Przy interpretacji badań należy mieć na uwadze, że użyte w doświadczeniu gołębie były w wieku 8 tyg. czyli były to bardzo młode osobniki, bardzo wrażliwe na zakażenie PPMV-1. Generalnie bardzo interesujące i oryginalne jest wykonanie badań na pawikach, które są niezwykle ciekawymi gołębiami hodowanymi w Europie od setek lat, jeśli wykorzystywanymi do badań naukowych to chyba tylko przez ośrodek olsztyński. Wyjaśnienia wymaga czy test 7

ELISA (Idexx ND Ab, USA) jest przydatny do badania surowic gołębi? Podana dalej przez doktorantkę procedura przygotowania ekstraktów roślinnych definiuje w odniesieniu do lukrecji zawartość kwasu glicyryzynowego na 20 %. Jednym z problemów w stosowaniu produktów zawierających surowce roślinne jest konieczność standaryzacji koncentracji substancji czynnych, co nie jest łatwe w przypadku naturalnych surowców roślinnych. W doświadczeniu, co też ma istotne znaczenie przy interpretacji wyników, wykorzystano mezogeniczny szczep PPMV-1 /pigeon/poland/ar3/95 uzyskany z Państwowego Instytutu Weterynaryjnego Państwowego Instytutu Badawczego w Puławach. W podrozdziale 3.4. doktorantka podaje metodykę izolacji komórek mononuklearnych ze śledzion gołębi z poszczególnych grup doświadczalnych i kontrolnych. Najbardziej rozbudowaną metodyczną częścią pracy jest podrozdział 3.5. poświęcony badaniom molekularnym. Autorka podaje protokół izolacji RNA z komórek mononuklearnych, narządów i wymazów. Następnie metodologię oceny stężenia i czystości wirusowego RNA. Po utworzeniu kopii cdna wykorzystała go do badań przy zastosowaniu qpcr. W celu oznaczenia ekspresji genów kodujących receptory powierzchniowe limfocytów T, dla genów CD4 i CD8 autorka zaprojektowała ich sekwencje, (numery akcesyjne CD4 MG214789, CD8 MG214790) co jest ważnym dokonaniem. Z zadowoleniem należy podkreślić dużą troskę Autorki o poprawność metodologiczną użytych metod, były one nie tylko optymalizowane, ale i walidowane w celu określenia ich czułości i specyficzności. Uzupełnieniem badań genetycznych była technika cytometrii przepływowej wykorzystana przez doktorantkę do oceny odsetka limfocytów B IgM. Należy podkreślić, że na przeprowadzenie wszystkich badań na zwierzętach Autorka uzyskała zgodę lokalnej komisji etycznej. Rozdział Wyniki jest bardzo interesującym, choć krótkim fragmentem ocenianej pracy (7 stron), poprawnie prezentującym dokonania Doktorantki. Zgrupowanie wyników w czterech podrozdziałach ułatwia śledzenie uzyskanych danych. Pierwsze trzy podrozdziały przedstawiają informacje o wynikach badań molekularnych, ostatni sumuje rezultaty badań cytometrycznych. Rozdział piąty Dyskusja to próba oceny własnych badań Autorki na tle literatury światowej. Cytując dane piśmiennictwa Autorka stara się odnieść uzyskane wyniki badań własnych do rezultatów innych autorów. W kilku punktach podkreśla oryginalność podjętych przez siebie badań. Generalnie można stwierdzić, że Doktorantka sprawnie konfrontuje własne wyniki badań wykazując się sporą wiedzą na temat dotychczas wykonanych prac. Rozdział szósty Wnioski ten bardzo istotny element pracy doktorskiej, jest bardzo 8

często krytykowany przez recenzentów, choć w przypadku wniosków wyciągniętych przez panią mgr Darię Dziewulską można stwierdzić, że są one klasycznie akademickie i zasadniczo poprawne! Zatem uzyskane wyniki badań oraz ich analiza upoważniły Autorkę do wyciągnięcia, w sumie, aż pięciu wniosków powiązanych z celami, jakie doktorantka postawiła sobie do rozwiązania rozpoczynając badania. Wniosek pierwszy informuje czytelnika, że: Wyciąg z aloesu zwyczajnego wykazuje u gołębi działanie przeciwwirusowe, co manifestowało się mniejszą liczbą kopii RNA PPMV-1 w próbkach wątroby, nerek i mózgu po zastosowaniu dawki 300 mg/kg m. c. oraz zwiększeniem ekspresji genu kodującego IFN-γ. Wniosek ten potwierdza opinię Ojiezeh i wsp, (2015) uzyskane u kur zakażonych eksperymentalnie wirusem rzekomego pomoru drobiu, ale w badaniach Doktorantki dane cytowanych autorów uzyskały mocne i bardziej wielostronne potwierdzenie, że podobne zjawisko występuje u gołębi. Wniosek drugi stwierdza, że Wyciąg z lukrecji gładkiej stosowany w dawce 300mg/kg m. c. wykazuje u gołębi działanie przeciwwirusowe, co manifestowało się czterokrotnie mniejszą liczbą kopii RNA PPMV-1 w próbkach wątroby i nerek w stosunku do ptaków z grupy kontrolnej oraz zwiększeniem ekspresji genu kodującego IFN-γ. Jak podkreśla sama autorka działanie przeciwwirusowe lukrecji jest jednak słabsze niż wyciągu z aloesu. Zagadnieniem niezwykle istotnym z praktycznego punktu widzenia jest pytanie czy połączenie wyciągów z obu roślin leczniczych ujawni efekt addycyjny działania przeciwwirusowego? W praktyce terapeutycznej w medycynie i weterynarii najczęściej stosuje się mieszaniny wyciągów z różnych roślin, podobnie dzieje się również u gołębi. Brak jest jednak danych eksperymentalnych, które potwierdzałyby zasadność takiego postępowania. Być może autorka pochyli się nad tym zagadnieniem. Oba wnioski opisują ważne osiągnięcie Doktorantki, bowiem w dotychczasowych badaniach nie podejmowano eksperymentalnego zakażenia gołębi szczepami PPMV-1 i oceny przeciwwirusowego działania wyciągów z aloesu i lukrecji. Zastosowanie czułych i nowatorskich technik biologii molekularnej dodatkowo podnosi wartość pracy. Wniosek podsumowujący badania w zakresie działania immunomodulującego wyciągu z aloesu zwyczajnego (wniosek trzeci) stwierdza, że: Działanie immunomodulujące wyciągu z aloesu zwyczajnego jest zależne od dawki: a) Dawka 300mg.kg m. c. wykazuje u gołębi właściwości immunostymulujące, co manifestowało się wyższą w stosunku do ptaków z grupy kontrolnej ekspresją genów kodujących receptory powierzchniowe limfocytów T CD4 i CD8. 9

b) Dawka 500 mg/kg m. c. wykazuje działanie immunosupresyjne manifestujące się zmniejszoną ekspresją genów kodujących receptory powierzchniowe limfocytów T CD4 i CD8. To stwierdzenie jest bardzo istotne i zdecydowanie należy je brać pod uwagę podczas prób stosowania ekstraktów z aloesu w praktyce. Ciekawy i w pełni oryginalny jest wniosek czwarty w którym Autorka stwierdza, że: Ekstrakt z aloesu zwyczajnego stosowany w obu dawkach stymuluje u gołębi zakażanych PPMV-1 nieswoistą odporność komórkową, co manifestowało się zwiększoną ekspresją genu kodującego receptor powierzchniowy CD4 limfocytów T. Podsumowując mogę stwierdzić, że badania wykonane przez doktorantkę stwarzają duże potencjalne możliwości terapii zakażeń wirusowych w kolumbopatologii. Wyniki prac eksperymentalnych zaprezentowane przez Doktorantkę stanowią bardzo ciekawy punkt wyjścia do dalszych badań w tym zakresie. Obserwując zaangażowanie promotora rozprawy w przenoszenie rezultatów badań naukowych do praktyki, mam podstawy sądzić, że będzie on dążył do praktycznego wykorzystania wyników wykonanych doświadczeń. Po krytycznej analizie opracowania, stwierdzam, iż Pani mgr Daria Dziewulska wykazała w pracy doktorskiej bardzo dobre przygotowanie merytoryczne do samodzielnego rozwiązywania postawionych celów badawczych. Recenzowana rozprawa stanowi oryginalne rozwiązanie problemu naukowego oraz w pełni potwierdza ogólną wiedzę teoretyczną Doktorantki, a tym samym w pełni spełnia wymagania stawiane tego typu opracowaniom określone w art.13 ust.1. Ustawy o stopniach naukowych i tytule naukowym z dnia 14 marca 2003 roku (Dz.U. z 2003 r. Nr 65, poz. 595; z 2005 r. Nr 164, poz. 1365). Po całościowym rozważeniu wartości poznawczej recenzowanej dysertacji zwracam się z wnioskiem do Wysokiej Rady Wydziału Medycyny Weterynaryjnej Uniwersytetu Warmińsko-Mazurskiego w Olsztynie o dopuszczenie Pani mgr Darii Dziewulskiej do dalszych etapów przewodu doktorskiego. Mając na względzie unikalne wartości poznawcze dysertacji i wysiłek włożony przez Doktorantkę w opanowanie i wykorzystanie tak specjalistycznego i nowatorskiego warsztatu badawczego wnioskuję o wyróżnienie pracy stosowną nagrodą. Prof. dr hab. Piotr Szeleszczuk 10