Domowy spektrofotometr z telefonu komórkowego i programu ImageJ Spektrofotometr to urządzenie pomiarowe, dzięki któremu można ustalić ilość światła pochłanianą lub rozpraszaną przez próbkę. Urządzenie to stanowi jedno z ważniejszych elementów wyposażenia współczesnego laboratorium biochemicznego. Pomiar aktywności enzymatycznej prędzej czy później zwykle sprowadza się do jakiejś reakcji barwnej, która wskazuje na ilość substratu lub produktu. Porównując różnice w pochłoniętej lub rozproszonej ilości światła można wywnioskować ilość substratu, która ubyła w wyniku zajścia reakcji enzymatycznej lub ustalić ilość produktu, który powstał dzięki reakcji. Jest to więc narzędzie, które pozwala na otrzymanie ilościowych wyników, które pozwalają również na wnioskowanie statystyczne i określenie czy zaobserwowane różnice w wariantach doświadczenia jest różnicą wiarygodną czy należy uznać je za przypadek. Problemem spektrofotometru jest jednak cena; jest to wydatek co najmniej kilku tysięcy złotych, co powoduje, że raczej nie jest urządzeniem powszechnie spotykanym w szkolnych pracowniach. Jednak dzięki powszechnemu dostępowi do cyfrowych aparatów fotograficznych i darmowemu programowi komputerowemu problem ten można spróbować rozwiązać. Na przykład, chcąc ocenić ilość strawionego białka w roztworze odtłuszczonego mleka wystarczy wykonać zdjęcie zestawu probówek zawierających badany preparat. Oczywiście wykonując to zdjęcie należy zwrócić uwagę na to, czy światło pada na nie równomiernie i czy rzeczywiście dolna część probówki zawierająca badane roztwory znajduje się na czarnym, jednolitym tle. Takie zdjęcie należy przesłać na komputer i poddać analizie według następujących wskazówek: 1. Należy pobrać program ImageJ ze strony: http://imagej.nih.gov/ij/download.html i zainstalować na komputerze. 2. Otworzyć to zdjęcie w programie ImageJ (File -> Open). Często popełnianym błędem jest otwieranie zdjęć w systemie operacyjnym, w trybie pozwalającym jedynie na jego przeglądanie. Konieczne jest kliknięcie na pasek, który pojawia się przy uruchomieniu program ImageJ i wczytanie analizowanego zdjęcia do programu. 3. Zaznaczyć oś, wzdłuż której będzie wykonywany pomiar, korzystając z odpowiedniego przycisku na pasku narzędzi. 4. Wybranie opcji (Analyze -> Plot Profile) umożliwi wyświetlenie wykresu, dzięki któremu można odczytać stopień "zmętnienia" w poszczególnych probówkach. 5. W wyniku analizy zdjęcia umieszczonego niżej, otrzymuje się wykres, z którego można odczytać
ilościowe dane dotyczące stopnia zabielenia poszczególnych próbek. Mając na jednym zdjęciu próbę kontrolną i próby badane można określić np. procentowy ubytek substratu po reakcji enzymatycznej trwającej przez określony czas. To tylko jedna z naprawdę wielu możliwości zastosowania programu ImageJ. Kompletnym źródłem informacji o programie ImageJ jest instrukcja udostępniona przez instytucję, która stworzyła ImageJ, czyli amerykańskie Narodowe Instytuty Zdrowia: http://imagej.nih.gov/ij/docs/index.html jednak może się okazać, że jest ono zbyt obszerne dla zwykłego użytkownika. Dobrym pomysłem jest przeszukać bazę filmów umieszczonych w serwisie YouTube hasłem ImageJ tutorial. Z pewnością zostanie wyświetlona długa lista filmów pokazujących możliwości programu ImageJ. Dodatkowa literatura http://www.dydaktyka.ib.pwr.wroc.pl/materialy/ ETP002901%20Diagnostyka%20obrazowa/ Obliczenia statystyczne w naukach biologicznych Naukowe wnioskowanie wymaga wiarygodnych danych. Czytelnik publikacji czy odbiorca wyników doświadczeń musi wiedzieć, czy zaprezentowane dane są dziełem przypadku czy są wiarygodne. Z drugiej strony, będąc badaczem, który wykonał doświadczenia, opisał je i chciałby przekonać słuchaczy lub czytelników do swoich racji, dobrze jest od razu uzbroić się w informacje, które pomogą przekonać nieprzekonanych. W osiągnięciu tego celu pomocne są powtórzenia prób i metody statystyczne. Wyniki raz przeprowadzonego doświadczenia mogą być dziełem przypadku. Tak jak rzut kostką i wylosowana liczba jest dziełem przypadku. Co innego, jeśli tą samą kostką rzuci się sześćset razy. Można się spodziewać, z drobnymi odchyleniami, że każda liczba wypadła ok. sto razy. Wykonując doświadczenia, warto każdą próbę powtórzyć co najmniej kilka razy. Dotyczy to zarówno prób badanych, jak i prób kontrolnych. Oczywiście im więcej powtórzeń, tym lepiej, choć gdzieś trzeba postawić sobie granicę. Przy pewnej liczbie powtórzeń wprost
wykonanie takiego doświadczenia stałoby się zbyt trudne organizacyjnie. Warto też zwrócić uwagę, że pod słowem powtórzenie mogą się kryć dwa pojęcia. Pierwsze z nich dotyczy wykonania kilku takich samych prób w ramach jednego doświadczenia. Drugie zaś odnosi się do rzeczywiście niezależnych doświadczeń, do których należy np. przygotować odczynniki od początku. Nie ma jasnych wytycznych jak należy postępować, ale z pewnością powtarzający się wynik czy pomiar przy prawdziwie niezależnych doświadczeniach może dostarczyć mocnych argumentów, które pozwolą przekonać niemal każdego odbiorcę do wniosków wynikających z takich doświadczeń. Jeśli dysponujemy pulą danych wynikających z przeprowadzonych doświadczeń, z danych tego samego typu należy obliczyć średnią arytmetyczną. W tym miejscu zasadne wydaje się odwołanie się do konkretnego przykładu w celu podkreślenia mankamentów posługiwania się średnią jako jedyną miarą w opracowywaniu wyników wielu doświadczeń. 1. Przeprowadzono klasówki w klasach A i B. W klasie jest 10 uczniów, ponieważ jest to szkoła w małej miejscowości. Wyniki poszczególnych uczniów są podzielone średnikami. Klasa A 4; 4; 4; 4; 4; 4; 4; 4; 4; 4 Ile wynosi średnia? Klasa B 5; 5; 5; 5; 5; 4; 4; 3; 2; 2 Ile wynosi średnia? 2. W której klasie oceny poszczególnych uczniów są bardziej zróżnicowane? 3. Jak zmierzyć to zróżnicowanie? Do tego służy miara, którą określa się odchyleniem standardowym. Żeby ją obliczyć, najpierw trzeba obliczyć wariancję w następujący sposób: (i) od liczby punktów każdego ucznia odejmij średnią (ii) każdą z tych liczb [wyniku z (i)] podnieś do kwadratu (iii) dodaj je i podziel przez liczbę uczniów (iv) to będzie wariancja W klasie A będzie to wyglądać tak: (i) 4-4; 4-4; 4-4; 4-4; 4-4; 4-4; 4-4; 4-4; 4-4; 4-4; (ii) 0 2 ; 0 2 ; 0 2 ; 0 2 ; 0 2 ; 0 2 ; 0 2 ; 0 2 ; 0 2 ; 0 2 (iii) 0/10 (iv) 0 W klasie B będzie to wyglądać tak: (i) 5-4; 5-4; 5-4; 5-4; 5-4; 4-4; 4-4; 3-4; 2-4; 2-4 (ii) 1 2 ; 1 2 ; 1 2 ; 1 2 ; 1 2 ; 0 2 ; 0 2 ; (-1) 2 ; (-2) 2 ; (-2) 2, czyli 1; 1; 1; 1; 1; 0; 0; 1; 4; 4 (iii) 14/10 (iv) 1,4
4. Wreszcie można obliczyć odchylenie standardowe, które jest po prostu pierwiastkiem wariancji, czyli: w klasie A 0 = 0 a w klasie B 1,4 = 1,183 Porównując wartości odchylenia standardowego z obu klas (0 versus 1,183) można określić jak bardzo nierówne były wyniki sprawdzianu uzyskane w obu klasach, mimo tej samej średniej. Jednak nie należy na tym kończyć analizy wyników z rozmaitych doświadczeń. Warto jeszcze iść o krok dalej i sprawdzić, czy różnice zaobserwowane między grupami (w wyżej wymienionym przykładzie będą to oczywiście dane pochodzące z klasówek przeprowadzonych w klasach A i B), nie są dziełem przypadku. W analizie niezależnych od siebie grup danych często stosuje się test t Studenta 1. Obliczanie statystyki jest jednak dość skomplikowane, dlatego warto skorzystać z odpowiedniego oprogramowania. Może to być arkusz kalkulacyjny (m.in. Microsoft Excel), jednak w środowisku naukowym znaczną popularnością cieszy się darmowy program R. Korzystając z niego można także bardzo łatwo obliczyć wartości odchylenia standardowego. 1. Przeprowadzono pomiar masy kurzych jaj z chowu klatkowego i z wolnego wybiegu. Wyniki poszczególnych uczniów są podzielone średnikami. Chów klatkowy 51; 49; 50; 53; 48; 49 Z wolnego wybiegu 49; 51; 53; 50 2. Sprawdźmy, czy sposób hodowli kur istotnie wpływa na masę jaj korzystając z metod statystycznych. 3. Należy pobrać program R ze strony: http://r.meteo.uni.wroc.pl i zainstalować na komputerze. 4. Pierwszy krok w korzystaniu programu R to wprowadzenie danych następującymi komendami: KL <- c(51, 49, 50, 53, 48, 49) 1 Zanim rozpocznie się analizę testem t Studenta, powinno się sprawdzić normalność rozkładu testem Kolmogorowa-Smirnowa. Jednak dla uproszczenia niniejszego opisu etap ten został pominięty, zakładając, że dane użyte w przykładzie mają rozkład normalny.
Klawiszem enter należy potwierdzić wpisaną treść. Następnie należy wprowadzić kolejną grupę danych: WW <- c(49, 51, 53, 50) KL (chów klatkowy) i WW (wolny wybieg) to nazwy zbiorów, w których będą przechowywane dane. Nazwy te mogą być dowolne, ale nie mogą zawierać odstępów. 5. Można sprawdzić wprowadzone dane w następujący sposób: print (KL) W tym przypadku także wpisaną treść należy potwierdzić klawiszem enter. Powinien pojawić się wiersz zawierający następujące dane: 51 49 50 53 48 49 6. Odchylenie standardowe można obliczyć komendą: sd (KL) Po naciśnięciu klawisza enter pojawi się obliczona wartość: 1.788854 W przypadku jaj z wolnego wybiegu będzie to wyglądało w następujący sposób: sd (WW) 1.707825 7. Obliczenie statystyki testu t Studenta jest równie proste. Należy wpisać komendę: t.test (KL, WW) i nacisnąć klawisz enter. Pojawi się następujący komunikat. Welch Two Sample t-test data: KL and WW t = -0.6675, df = 6.808, p-value = 0.5264 alternative hypothesis: true difference in means is not equal to 0 95 percent confidence interval:
-3.422168 1.922168 sample estimates: mean of x mean of y 50.00 50.75 8. Można dowiedzieć się, że średnia zbiorów KL i WW wynosi, odpowiednio, 50,00 i 50,75, zaś to, co najistotniejsze znajduje się za hasłem p-value, czyli wartość 0,5264. Jest ona znacznie większa niż najczęściej uznawana za progową w naukach przyrodniczych wartość 0,05 (5%). Jest to przesłanka, że należy przyjąć tzw. hipotezę zerową (H0), która mówi zawsze o tym, że nie ma różnic między badanymi grupami. Można zatem uznać, że sposób hodowli kur nie wpływa na masę znoszonych przez nie jaj. Gdyby wartość p była mniejsza niż 0,05, wówczas należałoby odrzucić H0 i uznać, że sposób hodowli kur ma wpływ na masę jaj.