Badanie emisji roztworo w barwniko w za pomocą s wiatła laserowego

Badanie emisji roztworo w barwniko w za pomocą s wiatła laserowego 1 Cel ćwiczenia Celem ćwiczenia jest teoretyczne i praktyczne zapoznanie studentów z problematyką zastosowania laserów jako źródeł światła wzbudzającego fluorescencję. Wykonanie ćwiczenia wymaga znajomości podstawowych wielkości charakteryzujących absorpcję i emisję światła przez molekuły luminezujące. 2 Cechy laserów jonowych Lasery jonowe są laserami gazowymi, na ogół o pracy ciągłej, w których ośrodkiem czynnym są jony gazów szlachetnych lub pary metali takich jak: ksenon, krypton, argon, neon, a także chlor, pary fosforu czy siarki. Inwersję obsadzeń osiąga się na skutek wzbudzenia jonów na wyższe poziomy energetyczne w procesie ich zderzeń z wolnymi elektronami tworzącymi się w wyładowaniu elektrycznym. Przed wzbudzeniem poziomów jonowych gaz ulega jonizacji. Jonizację taką wywołuje przepływający przez gaz prąd, od wartości którego w dużym stopniu zależy wyjściowa moc laserów. Największą moc (kilkaset W) otrzymano m. in. na jonach argonu i kryptonu. 2.1 Podział laserów jonowych Lasery, w których ośrodkiem czynnym są pobudzone jony takich gazów, jak Ar +, Kr +, Xe +. Lasery te są pobudzone wyładowaniem elektrycznym w gazie przy przepływie prądu rzędu kilku do kilkudziesięciu amperów. Lasery te mogą równocześnie generować kilka długości fali z zakresu widzialnego i nadfioletu. Na przykład dla Ar + największą moc uzyskuje się dla 488 nm oraz 514,5 nm. Z laserów tych uzyskuje się moce od kilku do kilkunastu W dla wszystkich długości fal emitowanych równocześnie. Lasery, w których ośrodkiem czynnym są pobudzone jony takich metali, jak Cd +, Sn +, Zn +, Se +. Pary metali, zwykle z dodatkiem gazu pomocniczego, są pobudzane przez wytworzenie w nich wyładowania elektrycznego przy przepływie prądu rzędu kilkudziesięciu ma. Dla Cd + uzyskuje się generację na długości fali 441 nm i 325 nm. Moce laserów Cd + zwykle są rzędu kilkunastu do kilkudziesięciu mw. 2.2 Zastosowanie laserów jonowych Badania fizyczne, Łączność optyczna, Technologia, Fotochemia, Fotobiologia, Separacja izotopów. 1

3 Laser argonowy Ośrodkiem czynnym lasera argonowego jest zjonizowany argon. Jonizacja argonu następuje w specjalnie wykonanej kapilarze wyładowczej pod wpływem prądu wyładowczego o natężeniu 15-3 A. Schemat rury wyładowczej do lasera argonowego przedstawiono na rys. 1 Rys. 1. Schemat rury wyładowczej do lasera argonowego Zaletą laserów argonowych jest ich promieniowanie w krótkofalowym zakresie widma. Natomiast wadą jest jednoczesna generacja kilku linii widmowych. Emisję monochromatyczną można jednak uzyskać stosunkowo łatwo wprowadzając do wnętrza rezonatora element dyspersyjny (np. pryzmat). Rys. 2. Sposoby mocowania pryzmatu w rezonatorze lasera argonowego celem selekcji pożądanej długości fali Sposoby mocowania pryzmatu ilustruje rys. 2. W pierwszym przypadku pryzmat jest na stałe przylutowany do rury zamiast okienka Brewstera. Lustro rezonatora optycznego jest ustawiane prostopadle do biegu wiązki o pożądanej długości fali. Ze względu na to, że gęstość prądu osiąga wartość rzędu 5 A/cm 2, kapilarna rurka wyładowcza jest bardzo intensywnie chłodzona wodą. W laserach jonowych dużej mocy kwarc okazał się materiałem zbyt nietrwałym. Obecnie rury wyładowcze wykonuje się z materiałów ceramicznych albo z grafitu. Rys. 3. Schemat konstrukcji rury wyładowczej lasera ILA-12. 1, 8 brewsterowskie okienka kwarcowe; 2, 1 - układy ochrony okienek brewsterowskich; 3 anoda grafitowa; 4 kanał wyładowczy zbudowany z segmentów grafitowych; 5 - rura kwarcowoszklana; 6 katoda niklowa; 7, 12 - wysięgniki okienek brewsterowskich; 9 doprowadzenia prądu; 11 cewka wytwarzająca pole magnetyczne. 2

Pole magnetyczne wytwarza się nawijając bezpośrednio na płaszcz lasera solenoid o kilkuset zwojach. Typowe natężenie osiowego pola magnetycznego wynosi kilka tysięcy A/m. Sądzi się, że osiowe pole magnetyczne koncentruje elektrony (i w znacznie mniejszym stopniu jony) w pobliżu środka rury. Powoduje to zmniejszenie ich dyfuzji w kierunku ścianek oraz zwiększenie liczby zderzeń. Obszar centralny plazmy osiąga wyższy stopień wzbudzenia niż regiony peryferyjne, przylegające do ścianek. Pole magnetyczne wywołuje polaryzację kołową światła w efekcie Zeemana, co zmniejsza skuteczność płytek brewsterowskich zamykających rurę wyładowczą. Rys. 4. Szczegóły konstrukcji rury wyładowczej współczesnych laserów argonowych Szczegóły konstrukcji typowej rury wyładowczej lasera argonowego przedstawiono na rys. 4. Główna rura (o średnicy kilku cm) wykonana jest z kwarcu lub ceramiki. Kanał wyładowczy uformowany jest za pomocą niewielkich otworków (o średnicy do 2 mm) w krążkach ze szklistego grafitu (vitreous graphite) lub z wolframu. System drobnych kanalików w krążkach (jest ich ok. 6) służy do wyrównywania ciśnienia w rurze. Rura jest intensywnie chłodzona wodą. W wyniku zderzeń z elektronami następuje jonizacja atomów argonu i wzbudzanie powstałych jonów do stanu 4p (rys. 5). Rys. 5. Schemat poziomów energetycznych wzbudzonego jonu argonu z zaznaczeniem przejść laserowych. Inwersję obsadzeń uzyskuje się głównie wskutek różnicy czasów życia w stanach 4p i 4s; czas życia w stanie 4p wynosi około 1 ns, a w stanie 4s około 2 ns. Depopulacja stanu 4s następuje wskutek emisji spontanicznej w obszarze próżniowego nadfioletu do poziomu podstawowego jonu (3p 5 ), a następnie na drodze rekombinacji do stanu podstawowego atomu. 3

4 Absorpcja światła laserowego przez roztwory barwników Absorpcja to w optyce proces pochłaniania energii fali świetlnej przez ciało. W procesie absorpcji (także emisji) światło zachowuje się jak cząstka elementarna i może być pochłaniane tylko w porcjach zależnych od częstotliwości światła. Zjawisko to opisuje poprawnie mechanika kwantowa. Kwant energii fali przenoszony jest przez foton, który zderza się z cząstka, np. elektronem, czy jądrem atomowym. Cząstka pochłania zawsze całą energię fotonu i tylko wtedy, gdy pozwalają jej na to jej dopuszczalne stany kwantowe. W wyniku absorpcji światła przechodzącego przez substancje (np. gaz, ciecz lub ciało stałe) z widma światła zostają usunięte pochłaniane częstotliwości, na tej podstawie można stwierdzić, przez jakie substancje przechodziło światło. Zjawisko to służy do badania składu chemicznego mieszanin związków chemicznych, gazów otaczających gwiazdy, obłoków gazowych we wszechświecie, jest to spektroskopia absorpcyjna. Jeśli absorpcja zachodzi pomiędzy parą wzbudzonych poziomów, zachodzi wówczas absorpcja ze stanów wzbudzonych. Ilościową miarą wielkości absorpcji są transmitancja i absorbancja promieniowania. Transmitancja (czasami nazywana transmisją) jest zdefiniowana jako I T I gdzie I jest natężeniem światła padającego, a jest natężeniem światła po przejściu przez ośrodek. Transmitancja jest zwykle wyrażana w procentach. Absorbancja związana jest z transmitancją poprzez wyrażenie I (1) A logt (2) W przypadku roztworów substancji absorbujących w nieabsorbujących rozpuszczalnikach i przy niezbyt dużych natężeniach światła padającego absorbancja podlega prawu Lamberta-Beera (czasami nazywanemu prawem Beera-Lamberta-Bouguera), które może być zapisane w postaci lub też po skorzystaniu z zależności (1) i (2) jako A c d (3) I I I e (4) 2,3 1 c d c d gdzie jest molowym (dziesiętnym) współczynnikiem absorpcji, c stężeniem molowym czynnika powodującego pochłanianie, a d grubością warstwy absorbującej. Prawo Lamberta-Beera jest wynikiem połączenia dwóch prostszych praw optyki, prawa Lamberta i prawa Beera. Historycznie jako pierwszy łączne prawo podał Pierre Bouguer w 1729 r. Było ono jednak podane w dość mętnej postaci opisowej i nie zostało dostrzeżone przez innych optyków. Johann Heinrich Lambert podał w 176 r. prostą zależność między absorbancją i grubością ciała pochłaniającego światło, natomiast August Beer podał w 1852 r. prostą zależność między absorbancją i stężeniem, a następnie połączył swoje prawo z prawem Lamberta do obecnie znanej postaci prawa Lamberta-Beera. Ogólnie mówiąc, prawo Lamberta-Beera jest odzwierciedleniem faktu, że w przypadku dostatecznie cienkiej warstwy pochłaniającej zmniejszenie natężenia promieniowania jest 4

proporcjonalne do liczby absorbujących cząstek znajdujących się na drodze równoległej i monochromatycznej wiązki promieniowania. W praktyce prawo Lamberta-Beera jest używane w sytuacji, kiedy wiązka nie jest zupełnie monochromatyczna, a reprezentuje wąski przedział I pasmowy zwłaszcza, jeżeli zależność spektralna pochłaniania nie jest silna w tym przedziale. Ponieważ natężenie promieniowania przepuszczanego może zmieniać się w granicach od zera do, więc absorbancja ( ) może zmieniać się teoretycznie od zera do I log I / I nieskończoności. W praktyce jednak, wartości absorbancji większe niż 2 nie są stosowane, a zakres, który umożliwia otrzymanie odpowiednio precyzyjnych wyników analitycznych, jest jeszcze bardziej ograniczony. Dokładne granice dopuszczalnych wartości absorbancji określane są częściowo przez typ przyrządu pomiarowego. W pomiarach absorbancji próbką jest na ogół kuweta zawierająca roztwór. Mierzona absorbancja powinna charakteryzować tylko substancję absorbującą. W praktyce, podczas pomiaru mamy do czynienia z częściowymi odbiciami wiązki światła od ścianek kuwety, a ponadto rozpuszczalnik (o którym zakłada się, że jest nieabsorbujący) może w rzeczywistości częściowo rozpraszać i absorbować promieniowanie. Ponieważ absorbancja jest wielkością addytywną, wpływ odbić i rozpuszczalnika na wyznaczaną absorbancję substancji absorbującej może być wyeliminowany przez pomniejszenie absorbancji kuwety z roztworem o absorbancję tej samej kuwety zawierającej tylko rozpuszczalnik. I 5 Pomiary widm absorpcji roztworów W ćwiczeniu pomiary widm absorpcji wykonuje się za pomocą spektrofotometru Specord M4. Bieg promieni światła w tym przyrządzie pokazano na rysunku 6. Rys. 6. Bieg promieni światła w spektrofotometrze Specord M4. 1 siatki dyfrakcyjne, 2, 21 szczeliny, 3, 22, 23 zwierciadła wklęsłe, 6 lampa deuterowa, 7 lampa halogenowa, 8, 18 soczewki cylindryczne, 9 próbka porównawcza, 1, 16 soczewki, 11-14 zwierciadła sferyczne, 15 fotopowielacz, 17 próbka pomiarowa, 19 zwierciadło obrotowe. Przebieg pomiaru sterowany jest programem komputerowym, który umożliwia wiele rożnych scenariuszy. W ćwiczeniu mierzona jest absorbancja badanego roztworu w zakresie długości fal światła od 35 do 65 nm. 5

6 Fluorescencja roztworów barwników, widmo emisji Jedną z podstawowych wielkości charakteryzujących fluorescencję jest jej rozkład widmowy. Zależne od warunków obserwacji, dla danej substancji fluoryzującej rozkład ten może przybierać różne postacie. Największe znaczenie ma tzw. rzeczywiste albo wewnętrzne widmo emisji, które charakteryzuje światło fluorescencji w miejscu jego wytwarzania w małym elemencie objętości luminoforu. Takie widmo opisuje się za pomocą funkcji rozkładu f ( ), która najczęściej ma takie znaczenie, że wielkość f( ) d jest równa prawdopodobieństwu tego, że dany wyemitowany kwant światła charakteryzuje się długością fali z przedziału (, d). Zgodnie z tą definicją funkcja f ( ) jest unormowana Tak określoną funkcję rozkładu f ( ) f( ) d 1. (5) nazywa się kwantowym widmem emisji. Zamiast na skali długości fali rzeczywiste widmo emisji może być określone na skali liczb falowych Widmo to, oznaczane jako, związane jest z poprzez zależność f ( ) Równanie (1) prowadzi do zależności f ( ) 1/ f ( ) d f ( ) d (6) d 2 f ( ) f ( ) f ( ) (7) d Przedstawienie widma absorpcji lub widma emisji na skali liczb falowych jest w wielu przypadkach korzystniejsze, ponieważ skala ta, jest proporcjonalna do energii. Dzięki temu na otrzymanych widmach dostajemy informację o rozkładzie (odległościach w jednostkach energii) stanów elektronowych. Widmo f ( ) może być obliczone na podstawie f ( ) ze wzoru f 2 ( ) f( ) (8). 6

7 Aparatura do pomiaru widm emisji Doświadczalnie widmo emisji może być zmierzone za pomocą przyrządu, nazywanego spektrofluorymetrem. Schemat spektrofluorymetru używanego w ćwiczeniu przedstawiono na rys. 7. Rys. 7. Schemat układu pomiarowego widm emisji. Skonstruowano go w oparciu o działanie monochromatora SPM2 (w zależności od potrzeby pryzmatycznego lub siatkowego) w torze wzbudzania i podwójnego monochromatora siatkowego DFS12 w torze obserwacji. Opcjonalnie możliwe jest również zastosowanie dodatkowego toru wzbudzania polegającego na użyciu lasera argonowego jonowego. Niezależnie od zastosowanego sposobu wzbudzania, w omawianym przyrządzie emisja fluorescencji rejestrowana jest w systemie obserwacji frontalnej, tzn. wzbudzenie fluorescencji i jej obserwacja następują z tej samej strony próbki. Schematycznie bieg promieni w kuwecie pomiarowej przedstawiono na rys. 8. Rys. 7. Schemat biegu promieni w układzie do pomiaru widm emisji. Przy założeniu, że szerokość wiązki wzbudzającej jest odpowiednio duża, wielkość sygnału generowanego w detektorze (liczba zliczonych w jednostce czasu pojedynczych fotonów) pochodzących od warstwy roztworu o grubości dx położonej na głębokości x można opisać wyrażeniem 7

( ) di(, ) k( ) ( ) f( ) C( )exp 2,3 ( ) c x cos (9) gdzie k( ) wzbudzającego jest pewną stałą zależną od geometrii układu pomiarowego i długości fali światła, ( ) - wydajnością kwantową kwantową czułością widmową układu, ( ) i f ( ) ( ) - kwantowym widmem emisji, C ( ) - molowymi współczynnikami absorpcji c - stężeniem roztworu. Czynnik odpowiednio dla światła wzbudzającego i fluorescencji, a eksponencjalny uwzględnia tu absorpcję światła wzbudzającego i reabsorpcję światła fluorescencji przez przednią warstwę roztworu o grubości. Całkowity sygnał generowany w detektorze przy monochromatorze obserwacyjnym ustawionym na długość fali otrzymujemy przez scałkowanie wyrażenia (9) po całej grubości próbki d W wyrażeniu (1) wielkość x k( ) ( ) f ( ) C ( ) d I(, ) 1 exp (, ) (1) (, ) (, ) dana jest przez - Widać stąd, że poszukiwane widmo emisji f ( ) cos (, ) 2,3 ( ) f ( ) cd może być obliczone ze wzoru I(, ) (, ) ( ) k( ) ( ) C ( ) d 1exp (, ) (11) (12) W rzeczywistych warunkach na ogół zakłada się, że wydajność kwantowa ( ) jest niezależna od długości fali światła wzbudzającego. Czułość widmowa układu C ( ) jest zwykle określana przez pomiar sygnału I ( ) generowanego przez układ przy zastąpieniu próbki przez lampę wzorcową o w znanym widmie emisji f ( ). Wtedy przez analogię do (1) zachodzi gdzie k w I ( ) k f ( ) C ( ) (13) w w jest pewną stałą. Wyrażenie (13) pozwala określić C ( ) z dokładnością do stałej Podobnie, wyrażenie (12) określa f ( ) z dokładnością do pewnej stałej. W tym ostatnim przypadku stała ta może być jednak wyeliminowana przez skorzystanie z warunku normalizacji (5). Omawiany tu układ do pomiaru widm emisji sterowany jest przez komputer. Stąd dla wygody wytwarzane pliki z wynikowymi widmami emisji zawierają wartości proporcjonalne do ilorazu I(, ) / C ( ), które w przypadku próbek o małej grubości lub próbek o małym nałożeniu widm absorpcji i emisji można uznać za proporcjonalne do prawdziwego widma emisji f ( ) k. 8

8 Pytania kontrolne 1. Zasada działania lasera jonowego argonowego. 2. W jaki sposób zmienia się długość fali światła emitowanego przez laser argonowy? 3. Co to jest transmitancja i absorbancja? Ile procent fotonów jest absorbowanych w próbce, jeżeli jej absorbancja wynosi 1, 2 lub 3? 4. Co to są fluorescencją i fosforescencja? 5. Jak definiuje się fotonowe widmo emisji substancji fluoryzującej? 6. Jakie czynniki powodują, że kształt widma sygnału fotodetektora różni się od kształtu widma emitowanego bezpośrednio przez cząsteczki substancji fluoryzującej. 7. Zasada działania fotopowielacza. Jak można wyznaczyć jego czułość widmową? 8. Jakie są różnice w pracy fotopowielacza w systemie rejestracji prądu i w systemie zliczania pojedynczych fotonów? 9 Zadania do wykonania i przebieg ćwiczenia 9.1 Wybór dwóch roztworów barwników do badań widm absorpcji i emisji. 1. Wybór dwóch roztworów barwników do badań widm absorpcji i emisji. 2. Pomiar widm absorpcji wybranych roztworów barwników zgodnie z punktem 9.2. 3. Uruchomienie lasera argonowego (lub innego zastępczego). 4. Zmiana i wybór odpowiedniej długości fali emitowanej przez laser. 5. Pomiar widma fluorescencji roztworów barwników przy wzbudzeniu laserowym. Uwaga: Wszystkie powyższe czynności powinny być konsultowane z osobą prowadzącą laboratorium. 9.2 Uruchomienie lasera argonowego Zasady uruchamiania lasera argonowego opisane są w osobnej instrukcji dostępnej w laboratorium. 9.3 Pomiar widma fluorescencji barwników przy wzbudzeniu laserowym 1. Włączyć do sieci zasilacz ZWN 2,5 dostarczający napięcie dla fotopowielacza, licznik Ortec 994 oraz zasilacz AX-35D-3 zasilający interfejs komputera, silnik krokowy zmian długości fali oraz przesłony. Napięcie na lewym panelu (zasilanie przesłony) powinno wynosić ok. 7 V, a na prawym (zasilanie interfejsu) - ok. 12 V. 2. Uruchomić komputer. 3. Pod kierunkiem osoby prowadzącej laboratorium uruchomić laser argonowy, a następnie nastawić go na pożądaną długość fali. 4. Napełnić kuwetę cylindryczną o grubości,5 mm lub 1 mm wybranym roztworem barwnika i umieścić ją w uchwycie spektrofluorymetru. 5. Ustawić szerokości szczelin monochromatora DFS-12 tak, by liczba zliczeń pojedynczych fotonów w maksimum fluorescencji wynosiła nie więcej niż 2 s -1. 6. Korzystając z programu MOLEK3 wykonać pomiary widm emisji fluorescencji. 9