Modelowanie molekularne i analiza struktury filmu łzowego

Politechnika Śląska Wydział Automatyki, Elektroniki i Informatyki Streszczenie rozprawy doktorskiej w dyscyplinie biocybernetyki i inżynierii biomedycznej Modelowanie molekularne i analiza struktury filmu łzowego Alicja Wizert Promotorzy: Dr hab. Daoud Robert Iskander Dr hab. Łukasz Ćwiklik Gliwice, 2017

Streszczenie rozprawy doktorskiej Cele Celem niniejszej rozprawy było zbudowanie realistycznego modelu struktury filmu łzowego na poziomie molekularnym. Model ten koncentruje się na budowie i strukturze warstwy lipidowej znajdującej się pomiędzy warstwą wodną filmu łzowego a środowiskiem zewnętrznym. Warstwa lipidowa zbudowana jest z lipidów polarnych i niepolarnych. Warstwa wodna, w rzeczywistości złożona głównie z wody, białek, cukrów i elektrolitów, w modelu została przybliżona wodą lub wodą zawierającą wybrane białko łzowe. Na podstawie skonstruowanego modelu przetestowana została struktura i dynamika zachowań filmu łzowego oraz analiza jego stabilności pod wpływem zmiennych warunków panujących na powierzchni oka (w szczególności jako konsekwencja ruchu powiek). Przetestowane zostały biofizyczne właściwości skonstruowanego modelu. Celem podjętych badań było także ocena oddziaływań pomiędzy cząsteczkami jednego wybranego białka łzowego i lipidowej warstwy filmu łzowego przy użyciu opracowanego modelu i z zastosowaniem narzędzi symulacyjnych dynamiki molekularnej dla dużych układów. W szczególności zbadany został wpływ obecności lizozymu w fazie wodnej na zachowanie warstwy lipidowej, jak również zachowanie się samych białek w pobliżu granicy faz woda/lipid. Dobór lipidów w modelu opierał się o doniesienia literaturowe, uwzględniające najnowsze badania nad lipidomem zewnętrznych warstw ludzkiego filmu łzowego [1 3]. W skład monowarstwy polarnej wchodziły: fosfatydyloholina (POPC) - 67%, fosfatydyloetanolamina (POPE) - 22%, sfingomielina (SM) - 5.5% oraz ceramid (Cer) - 5.5%. Spośród niepolarnych lipidów łzowych wybrano trójgliceryd (TG) oraz ester cholesterolu (CE), których mieszanka ekwimolarna w modelu tworzyła relatywnie grubą warstwę pokrywającą monowarstwę polarną; stosunek ilościowy lipidów niepolarnych do lipidów polarnych wynosił 3 do 1. Wybór białka podyktowany był pracami nad proteomem filmu łzowego, wymieniającymi lizozym jako jedno z najliczniej występujących białek w filmie łzowym [4 6]. Ponadto, lizozym wykazuje zdolność adsorpcji do różnych powierzchni lipidowych, w tym fosfolipidów i lipidów pochodzących z gruczołu Meiboma [7], które wchodzą w skład modelu warstwy lipidowej filmu łzowego 1

(TFLL - z ang. tear film lipid layer). Motywacja Filmem łzowym nazywamy zewnętrzną warstwę płynu pokrywającego rogówkę. Film łzowy stanowi ważny element dla zdrowia i optyki oka, zaś jego zaburzenia prowadzą do poczucia dyskomfortu na oku, podrażnień rogówki oraz stanów zapalnych, które to symptomy mogą być związane z zespołem suchego oka (z ang. Dry Eye Syndrom, DES). W skrajnych przypadkach nieleczone schorzenie może doprowadzić nawet do całkowitego oślepnięcia. DES dotyka milionów ludzi na calym świecie, a wskaźnik zachorowania na tę chorobę waha się od 5 % do nawet 35 % w grupach zwiększonego ryzyka [8 12] i systematycznie rośnie, czego przyczyn doszukuje się w coraz to większej popularności soczewek kontaktowych, szczególnie w starzejących się społeczeństwach krajów wysoko rozwiniętych. Powszechnie uważa się, iż film łzowy zbudowany jest z trzech warstw: mucynowej (zbudowanej z mucyn, wydzielanych przez komórki nabłonka rogówki oraz komórki kubkowe spojówki), wodnej (fizjologicznie wydzielanej przez gruczoł łzowy i bogatej w rozpuszczalne w wodzie białka, cukry, elektrolity, a także lipidy) oraz lipidowej, na którą składają się zarówno lipidy polarne (nie do końca określonego pochodzenia) oraz lipidy niepolarne (wydzielane głównie przez gruczoły Meiboma). Z definicji zespołem suchego oka nazywa się patologiczny stan filmu łzowego wynikający z niedoboru łzy lub nadmiernego parowania wody z jego warstwy wodnej [13]. W konsekwencji niedobór ten prowadzi do uszkodzenia komórek zewnętrznego odcinka oka, powodując podrażnienie i uczucie dyskomfortu. Uważa się, że za spowalnianie parowania odpowiedzialna jest warstwa lipidowa, która odgradza warstwę wodną od środowiska zewnętrznego, ponadto zapewnia ona gładką powierzchnię dla optyki oka. Dlatego też istotne jest poznanie mechanizmów, zachodzących w strukturze lipidów w filmie łzowym oraz określenie wpływu innych jego składników na stabilność i funkcje warstwy lipidowej. Białka znajdujące się w płynie łzowym również nie pozostają bez wpływu na zdrowie powierzchni oka. Przykładowo, obniżenie poziomu lizozymu w filmie łzowym obserwowane jest w przypadku wielu chorób oczu, w tym DES [14], opryszczkowym zapaleniu oka [15] oraz u pacjentów zażywających blokery beta [16]. Niskie stężenie lizozymu skorelowane jest także z obniżonym poziomem lipokaliny [17] białka wiążącego lipidy i obniżającego napięcie powierzchniowe [18, 19]. Z kolei laktoferyna odgrywa ważną rolę w utrzymaniu ochrony immunologicznej oka [20]. Sugeruje się, że poziom każdego z tych trzech głównych białek łzowych może służyć jako dodatkowy biomarker do oceny jakości powierzchni oka [17, 21]. W skład predniego odcinka oka wchodzi spojówka, rogówka, twardówka, komora przednia, tęczówka, ciało rzęskowe i soczewka.

Metody Trudności w badaniu łzy in vivo, wynikające w głównym stopniu ze złożoności jej struktury oraz specyfiki dynamicznych warunków panujących na powierzchni oka, zmuszają nie tylko do zaprzęgnięcia najnowocześniejszych technik analitycznych, ale też do zastosowania nowatorskiego podejścia w samej metodologii badawczej. Daltego też w niniejszej pracy zastosowano metody komputerowe, a mianowicie symulacje dynamiki molekularnej (MD. Przeprowadzone w niniejszej pracy symulacje wykorzystują pole siłowe MARTINI, umożliwiające, w przybliżeniu, atomowy poziom opisu systemów molekularnych. Pole to jest przykładem gruboziarnistych pól siłowych, stosującym przybliżenia poprzez odwzorowanie czterech atomów przy pomocą jednego ziarna. Szybki rozwój MARTINI w ostatnich latach doprowadził do osiągania wydajności obliczeniowej, pozwalającej na śledzenie zachowań układów w czasach rzędu mikrosekund i rozmiarach rzędu dziesiątek nanometrów [22]. Jak wiadomo naturalne warunki panujące na oku są dynamiczne, zaś ruch powiek podczas mrugnięcia dodatkowo wprowadza silne zaburzenia ciśnienia na jego powierzchni [23]. Aby odzwierciedlić tę złożoną charakterystykę środowiska, w którym znajduje się film łzowy, przeprowadzone symulacje miały dwojaki charakter: równowagowy lub nierównowagowy. Te pierwsze miały na celu zbadanie właściwości modelowanej warstwy lipidowej na różnym poziomie kompresji lateralnej; te drugie zaś skupiały się na opisie zjawisk, jakie mogą zachodzić podczas ściskania i rozciągania filmu łzowego przez powieki podczas mrugania. Dyskusja wyników Analiza modelu warstwy lipidwej filmu łzowego Jeśli chodzi o rolę poszczególnych składników lipidowych, symulacje zaproponowanego modelu wykazują, że fosfolipidy oddzielają lipidy niepolarne od fazy wodnej, poprzez tworzenie jednolitej monomolekularnej platformy, na której tworzy się gruba niepolarna warstwa lipidowa. Lipidy polarne organizują się w taki sposób, że ich hydrofilowe grupy oddziałują z fazą wodną, podczas gdy hydrofobowe ogony skierowane są ku warstwie niepolarnej. Ponadto głowy tych lipidów wyznaczają zasadniczą granicę penetracji wody do warstwy lipidowej i jedynie nieliczne cząsteczki wody są w stanie przedostać się do grubej warstwy niepolarnych lipidów, skąd odparowują do fazy gazowej. Cząsteczki niepolarne lipidów wypełniają wolne przestrzenie między ogonami lipidów tworzących monowarstwę, zwiększając jej wytrzymałość i zapewniając ciągłość całej warstwy lipidowej. Taki układ, poddany kompresji lateralnej, pozostaje stabilny w sensie ciągłości polarnej monowarstwy w symulowanych czasach (rzędu mikrosekund). W niniejszej pracy określono też rolę niepolarnych lipidów w filmie łzowym; było to możliwe dzięki uwzględnieniu w modelu nadwyżki lipidów niepolarnych w posta-

ci grubej, niepolarnej warstwy lipidowej. Struktura tej warstwy jest uporządkowana gradientowo, tzn. poszczególne jej składniki są dobrze wymieszane w przeważającej objętości tej warstwy, jednakże w pobliżu obu granicy środowisk obserwuje się wzrost uporządkowania, objawiający się preferencją w położeniu i orientacji cząsteczek w zależności od rodzaju lipidu. Mianowicie, cząsteczki estrów cholesterolu dominują na granicy z polarną monowarstwą, gdzie ich krótki ogon wraz z pierścieniami aromatycznymi penetruje między łańcuchami lipidów polarnych, natomiast długi ogon preferencyjnie skierowany jest do fazy niepolarnej. Cząsteczek trójglicerydów w tym rejonie jest mniej w porównaniu do estrów i nie przenikają one do monowarstwy polarnej tak głęboko, mimo to w jej pobliżu wykazują zwiększone uporządkowanie, przeciętnie przeplatając się dwoma z trzech łańcuchów węglowodorowych z ogonami lipidów polarnych. Inaczej sytuacja przedstawia się na granicy lipid/powietrze zajmowanej w znacznej przewadze przez trójglicerydy ułożone zwykle ogonami do fazy gazowej. Wraz z mniej licznymi długimi ogonami estrów cholesterolu tworzą one gładką powierzchnię zewnętrzną filmu łzowego, co jest istotne z punktu optyki oka. Należy zauważyć, że czyste CE (charakteryzujący się anizotropią kształtu) ulegają przejściu fazowemu z fazy cholesterolowej do fazy smektycznej w temperaturze ok. 314 K [26]. Przeprowadzone testowe symulacje czystych CE w polu siłowym MARTINI w 314 K nie wykazały takiego przejścia. Wynika z tego zatem, iż model MARTINI nie pozwala na odtworzenie przejścia tego lipidu do fazy smektycznej. Jednakże, co zostało wykazane eksperymentalnie, dodanie TG do CE niweluje wszystkie przejścia ciekłokrystaliczne w takiej mieszaninie [27]. Podobne działanie wykazano doświadczalnie także w bardziej złożonych mieszaninach lipidowych (TG + CE + cholesterol) [28]. W związku z tym oraz z uwagi na fakt, iż faza niepolarna rozważanego tutaj modelu jest mieszaniną estrów cholesterolu i trójglicerydów, nie powinna ona wykazywać przejścia fazowego w temperaturze 305 K stosowanej w przeprowadzonych symulacjach. W ostatnich latach pojawiły się eksperymentalne badania sugerujące występowanie w płynie łzowym stanów podobny do lipidowej fazy żelowej [29]. Przeprowadzone tutaj symulacje nie pokazały takich efektów, jednakże nie można wykluczyć tworzenia się żelo-podobnych agregatów lipidowych w większych skalach przestrzenno-czasowych. Warto zauważyć inne ograniczenie modelu MAR- TINI dotyczące penetracji wody. Mianowicie, przy pomocy pola siłowego MARTINI niemożliwym jest zbadanie roli niepolarnych lipidów w penetracji i parowaniu wody przez film łzowy. Powodem tego jest mała rozdzielczość reprezentacji wody w modelu MARTINI, gdzie jedno ziarno odpowiada aż czterem cząsteczkom H 2 O. Warstwa lipidowa filmu łzowego ulega ciągłym zmianom wywołanym ruchem powiek podczas mrugania oka. Na poziomie molekularnym zjawisko to może być Faza cholesterolowa, zwana także fazą nematyczną skręconą - rodzaj fazy ciekłokrystalicznej, w której cząsteczki dążą do ustawienia w pewnym określonym kierunku, a kierunek ten zmienia się w przestrzeni tworząc helisę [24] Faza smektyczna - rodzaj fazy ciekłokrystalicznej, która prócz równoległego ułożenia cząsteczek względem siebie charakteryzuje się dodatkowo ułożeniem w warstwy [25]

naśladowane poprzez modulację ciśnienia lateralnego badanej powierzchni. W skali rzędu nanometrów, w przypadku umiarkowanego ciśnienia lateralnego (APPL > 60 Å 2 ) polarna warstwa filmu łzowego pozostaje w przybliżeniu płaska. Ściśnięty układ (APPL 60 Å 2 ) pozostaje stabilny w sensie ciągłości polarnej monowarstwy, która jednak ulega pofałdowaniu. Pojawienie się krzywizn w strukturze warstwy lipidowej powoduje zmiany w ułożeniu poszczególnych komponentów lipidowych uwarunkowane różnym rozmiarem głów polarnych; POPE i Cer chętnie lokalizują się w regionach o ujemnej krzywiźnie, SM zajmuje przeważnie krzywiznę dodatnią, podczas gdy POPC nie wykazuje szczególnych preferencji położenia. Tego typu sortowanie lipidów polarnych może odgrywać znaczącą rolę w fizjologii i biomechanice filmu łzowego. Drugą istotną obserwacją w ściśnietych układach filmu łzowego jest zachowanie relatywnie płaskiej powierzchni warstwy lipidowej na granicy z powietrzem. W symulowanych skalach czasowo-przestrzennych, zaburzenia falowe monowarstwy, zachodzące na granicy woda/lipid, nie powodują propagacji podobnych fal na powierzchni granicznej filmu łzowego z powietrzem. Wynika to z obecności grubej warstwy lipidów niepolarnych, która działa jak bufor niwelujący zaburzenia zachodzące w głębszych warstwach płynu łzowego. Stąd odgrywa ona rolę stabilizującą dla powierzchni filmu łzowego podczas kompresji lateralnej, co wpisuje się w opisaną wcześniej rolę ochronną niepolarnej warstwy lipidowej razem z zapobieganiem odparowywania wody, jak również zapewnianiu optycznych właściwościach powierzchni filmu łzowego dla prawidłowego widzenia [30, 31]. Najbardziej znaczące zmiany w strukturze warstwy lipidowej filmu łzowego obserwowano podczas nierównowagowych symulacji kompresji i dekompresji. Ściskanie filmu łzowego w początkowym stadium powodowało nasilające się fałdowanie powierzchni tworzonej przez lipidy polarne a wraz z dalszym postępem symulacji wydalenia części lipidów polarnych w postaci agregatów makrocząsteczkowych z monowarstwy do warstwy niepolarnej lub też do fazy wodnej. Agregaty te, w środowisku niepolarnym tworzyły odwrotne micele wypełnione wodą oraz micele (wypełnione mieszaniną TG i CE) w fazie wodnej, które mogły przemieszczać się swobodnie lub też pozostawały w bliskim kontakcie z monowarstwą. Taki mechanizm pozwala na kompensację napięcia powierzchniowego, przez pozbycie się nadmiaru lipidów polarnych w monowarstwie przy jednoczesnym zachowaniu jej integralności. Akcja powiek w trakcie mrugnięcia wprowadza dużą zmienność ciśnienia lateralnego warstwy lipidowej filmu łzowego. Tymczasem czas potrzebny do ustalenia się równowagi monowarstw fosfolipidowych na wadze Langmuira mieści się w zakresie co najmniej minut [32]. W związku z tym można założyć, że film łzowy w warunkach fizjologicznych jest daleko od równowagi termodynamicznej, gdyż średni czasu pomiędzy poszczególnymi mrugnięciami oka wynosi ok. 6 sekund [33]. Daje to podstawy do założenia, iż struktura modelu warstwy lipidowej uzyskana w wyniku poddawania Powierzchnia na lipid polarny z ang. area per polar lipid, parametr określający gęstość upakowania lipidów na powierzchni.

jej dynamicznemu ściskaniu i rozciąganiu jest bliższa organizacji rzeczywistego filmu łzowego niż ta badana w układach zrównoważonych. Na podstawie badanego modelu rysuje się następujący obraz struktury molekularnej lipidów w filmie łzowym. Warstwa lipidowa filmu łzowego nie jest lokalnie płaskim monomolekularnym zespołem polarnych lipidów na granicy między wodą i grubą warstwą niepolarnych lipidów. Wyniki niniejszej pracy sugerują, iż nawet w skali nanometrowej, interfejs wodno-lipidowy jest strefą dynamiczną i niejednorodną, w której materiał lipidów polarnych wraz z wodą tworzy trójwymiarowe strukturą na granicy polarno-niepolarnej. Struktury te są stabilne kinetycznie w symulowanej skali czasowej, tworzą się i reorganizują wskutek ruchu powiek w czasie mrugania. Niektóre z nich mogą całkowicie oddzielić się od monowarstwy zarówno do warstwy niepolarnej jak i wodnej. Powierzchnia zewnętrzna filmu łzowego na granicy z powietrzem pozostaje lokalnie płaska pomimo dynamicznych procesów zachodzących w warstwie polarnej co świadczy o jej dobrym odizolowaniu od granicy faz woda-lipid. Możemy spekulować o ewentualnej roli trójwymiarowych agregatów zaadsorbowanych na granicy wody i lipidów lub zalegających w jej pobliżu. Tworzenie się odpowiednio miceli i odwróconych miceli umożliwia transfer lipidów polarnych z monowarstwy do wody lub fazy niepolarnej, co z kolei pozwala na stabilizację filmu łzowego podczas mrugania okiem. Te trójwymiarowe zespoły mogą być również postrzegane jako rezerwuary polarnych lipidów, które mogą być przenoszone z powrotem do monowarstwy, jeśli zajdzie taka potrzeba. Może to wskazywać na ewentualną rolę tych struktur w niektórych stanach patologicznych związanych ze zmniejszoną stabilnością filmu łzowego. Analiza wpływu białek na wartswę lipidową filmu łzowego TFLL jest zwykle wiązana z jej rolą w utrzymaniu stabilności mechanicznej łzy poprzez zmniejszanie napięcia powierzchniowego. Znajduje się ona w bezpośrednim kontakcie z warstwą wodną bogatą w rozpuszczalne w wodzie białka, w tym najbardziej liczny lizozym, odgrywający kluczową rolę w ochronie przeciwbakteryjnej oka. Wcześniejsze badania eksperymentalne wykazały, że cząsteczki lizozymu zmieniają właściwości TFLL. Zaprezentowane w te pracy wyniki symulacji MD sugerują, że TFLL, oprócz prostego podziału struktury na płaskie warstwy lipidów polarnych i niepolarnych, zawiera także wielokształtne agregaty lipidowe w postaci odwróconych miceli. Wykorzystując symulacje MD gruboziarnistego modelu TFLL w obecności lizozymu w fazie wodnej, wykazano, że hydrofilowe białko, którego naturalnym środowiskiem jest warstwa wodna filmu łzowego, może zostać włączone w strukturę lipidową poprzez enkapsulację we wnętrzu agregatów micelo-podobnych. Taki proces zachodzi w wyniku restrukturyzacji filmu lipidowego podczas zaburzeń ciśnienia lateralnego i wymaga obecności cząsteczki białka w pobliżu warstwy lipidowej filmu łzowego. W nieniejszej pracy pokazano, iż ten ostatni warunek może być spełniony dla lizozymu. Mechanizm ten nie musi jednak ograniczać się do cząsteczek lizozymu, ale

powinien działać w przypadku dowolnej cząsteczki hydrofilowej. Zatem TFLL może skutecznie działać jako rozpuszczalnik i swoisty rezerwuar hydrofilowych białek oraz innych molekuł rozpuszczalnych w wodzie. Należy zwrócić uwagę, iż enkapsulacja wymaga, aby białko było obecne w sąsiedztwie zagłębień fałdów utworzonych podczas reorganizacji polarnej warstwy lipidowej. Ten warunek nie musi być spełniony dla każdego białka zaadsorbowanego na powierzchni lipidu, na co wskazuje fakt, że nie wszystkie trajektorie MD obliczone z adsorbowanym lizozymem prowadziły do ich enkapsulacji. Niemniej jednak, w rzeczywistym filmie łzowym, gdzie liczba lizozymów w sąsiedztwie granicy wody i lipidów jest wysoka, a restrukturyzacja TFLL zachodzi przy każdym mrugnięciu, proces zamykania lizozymu w strukturach lipidowych może zachodzić relatywnie często. Enkapsulacja cząsteczki przez odwrócone micele w TFLL jest co do zasady procesem odwracalnym. Gdy koncentracja takich miceli jest wysoka, kolejna reorganizacja powierzchni w TFLL, w szczególności spowodowana dekompresją lateralną filmu łzowego, może prowadzić do wchłonięcia odwróconych miceli z powrotem do monowarstwy polarnej, a w konsekwencji jej otwarcia i przeniesienia zamkniętych w niej cząsteczek hydrofilowych do fazy wodnej. Należy zauważyć, że niektóre odwrócone micele z osadzonym białkiem powinny być zdolne do oderwania się od polarnego filmu lipidowego i rozproszenia w objętości warstwy niepolarnych lipidów. Takie zachowanie przejawiały odwrócone micele w symulacjach MD bez białka. Zjawisko to prowadziłoby do wzbogacenia TFLL w hydrofilowy lizozym, co może potencjalnie zwiększyć aktywność antybakteryjną łzy już w najbardziej zewnętrznej, niepolarnej warstwie filmu łzowego. W symulacjach enkapsulacji wykazano, że SM odgrywa rolę wspomagającą podczas zakotwiczania białka w zagłębieniach fałdów lipidowej powierzchni. Mianowicie, kontakty pomiędzy lizozymem i SM są szczególnie częste podczas początkowego formowania pęcherzy lipidowych i przeistaczania się do postaci odwróconych miceli. Takie zachowanie SM podczas inkorporacji lizozymu idzie w parze ze znaczącą ekspozycją głów polarnych jej cząsteczek na powierzchni wody, co pokazują również ostatnie doniesienia literaturowe [34]. Szczególnie interesującym mogłoby okazać się eksperymentalne zbadanie roli SM poprzez wykorzystanie proponowanego modelu in vitro przy dobrze kontrolowanej kompozycji lipidowej. Przewidywana zdolność niepolarnej warstwy lipidowej filmu łzowego do gromadzenia w sobie cząsteczek hydrofilowych ma kilka konsekwencji. Po pierwsze, jeśli kapsułkowana cząsteczka jest białkiem, może ono sprawować swoje funkcje już w warstwie lipidowej filmu łzowego. W przypadku lizozymu prowadziłoby to do modulacji wrodzonej odpowiedzi immunologicznej filmu łzowego. Po drugie, obecność pęcherzy polarnych zmieniłaby właściwości biofizyczne TFLL, takie jak jego stabilność mechaniczna i przepuszczalność dla wody. Po trzecie, możliwość enkapsulacji w warstwie lipidowej filmu łzowego rozpuszczalnych w wodzie cząstek wydaje się być istotna z punktu widzenia dostarczania leków. Przykładowo czas retencji leku w fil-

mie łzowym może zostać zwiększony ze względu na jego uwięzienie w TFLL lub też odwrócone micele mogą być wykorzystana do gromadzenia i następnie dostarczania cząsteczek leków przez warstwę lipidową filmu łzowego do fazy wodnej. Podsumowanie oraz kierunki przyszłych badań Łącząc dynamikę z danymi strukturalnymi dostępnymi z różnych źródeł eksperymentalnych, symulacje dynamiki molekularnej umożliwiają szczegółową analizę szeregu zjawisk biologicznych [35,36]. Postępy w symulacjach przenoszą opisy systemów biologicznych o atomowej rozdzielczości do systemów wielkości milionów a nawet miliardów atomów, co pozwala na badanie funkcji układów i supercząstek nieosiągalne w sumulacjach małych układów lub dostępnych technik eksperymentalnych. W duchu tego postępu i w porównywalnej skali, w niniejszej pracy stworzono molekularny model filmu łzowego, którego wielkość sięgła do nawet 4 milionów atomów (1 milion ziaren w modelu MARTINI), zaś przeprowadzone symulacje osiągały długości rzędu mikrosekund. Osiągnięcie tak wysokiej rozdzielczości w badaniach nad filmem łzowym jest obecnie niemożliwe technikami eksperymentalnymi, gdyż większość metod bliskich tej skali wymaga przygotowania próbek, która wypacza właściwości filmu łzowego w warunkach naturalnych. Warstwa lipidowa modelu filmu łzowego odzwierciedla skład lipidowy rzeczywistej łzy według dotychczasowej wiedzy. Kluczowym założeniem strukturalnym modelu TFLL było po raz pierwszy uwzględnienie wielokrotnej przewagi lipidów niepolarnych nad lipidami polarnymi. Ponadto ilość lipidów niepolarnych została przyjęta tak, by przy dostępnej powierzchni przekroju symulowanego układu tworzyła jednocząsteczkową warstwę oddzielającą fazę wodną od fazy lipidów niepolarnych. Model ten zawierał również rozpuszczony w fazie wodnej lizozym jedno z najczęściej występujących białek w filmie łzowym, zdolne do oddziaływań z lipidami. Otrzymane dzięki zastosowaniu gruboziarnistego pola siłowego MARTINI, długie trajektorie symulacyjne pokazały, iż zaproponowany model jest stabilny i wytrzymały w badanej skali czasowej; nawet poddawany wysokiemu ciśnieniu lateralnemu. Podczas symulacji dynamicznego ściskania i rozciągania modelu TFLL (naśladujących efekt ruchu powiek) zaobserwowano i opisano mechanizm autokompensacji napięcia powierzchniowego przez polarną monowarstwę, który polega na regulacji liczby lipidów obecnych w monowarstwie, poprzez wydalanie ich w postaci agregatów makrocząsteczkowych do fazy wodnej (w postaci micel) bądź do fazy lipidów niepolarnych (w postaci odwróconych micel). Pokazano także, że przy spełnieniu pewnych warunków proces ten może być odwracalny i niektóre spośród wydzielonych agregatów mogą w razie potrzeby zostać ponownie wchłonięte przez monowarstwę. Warunkiem dla zachodzenia takiej kompensacji jest stabilizująca rola grubej niepolarnej warstwy lipidowej, która nie tylko obniża napięcie powierzchniowe między monowarstwą i powietrzem, ale także zapewnia środowisko dla amfifilowych agregatów, stanowiących

rezerwuar lipidów polarnych. Dodatkowo warstwa niepolarna amortyzuje zaburzenia zachodzące w warstwie polarnej podczas ściskania (takie jak fałdowanie powerzchni czy też tworzenie agregatów), utrzymując tym samym relatywnie gładką powierzchnię zewnętrzną filmu łzowego. Dzięki dalszym symulacjom, uwzględniającym lizozym umieszczony w fazie wodnej pokazano, iż białko to oddziałuje z lipidami filmu łzowego i jest zdolne adsorbować do monowarstwy lipidowej o rozważanym składzie. Ponadto, w dynamicznych symulacjach ściskania TFLL z zaadsorbowanym lizozymem pokazano, iż z pewnym prawdopodobieństwem zachodzi zamykanie białka we wnętrzu tworzących się odwróconych miceli, wyciskanych z monowarstwy do fazy niepolarnej. Proces ten wydaje się nie być w żaden sposób specyficzny dla białka, stąd przypuszcza się, że może zachodzić dla dowolnej odpowiednio małej cząstki, zdolnej do adsorbowania bądź przebywania wystarczająco blisko monowarstwy. Z przeprowadzonych sumulacji wyłania się zmodyfikowany model filmu łzowego (pokazany schematycznie na rysunku 0.1), który nie zakłada już planarnego charakteru struktury warstwy lipidowej. Nowy, proponowany model postuluje obecność agregatów lipidowych w strukturach TFLL, stanowiących rezerwuar lipidów polarnych dla warstwy lipidowej, a ponadto zdolnych do zamykania i przenoszenia drobnych cząstek hydrofilowych z warstwy wodnej do warstwy lipidowej. Rysunek 0.1: Proponowany nowy model warstwy lipidowej filmu łzowego (B), otrzymany w drodze symulacji MD wyjściowego, planarnego modelu TFLL (A). Zielonym kolorem zaznaczono strefę hydrofobowych ogonów lipidów polarnych, czerwonym strefę ich polarnych głów; na brązowo pokolorowano obszary zajmowane przez lipidy niepolarne; cząsteczki lizozymu przedstawio na żółto i różowo, zaś wodę w kolorze niebieskim. Należy pamiętać, iż symulacje dynamiki molekularnej nie pozbawione są pewnych uproszczeń, o których wspomniano już w trakcie tej rozprawy. Wchodzą w to między innymi artefakty związane z wprowadzanymi założeniami i zaokrągleniami, jak np. periodyczne warunki brzegowe czy odcinanie energii dla oddziaływań dalekozasięgowych. Ponadto użycie równań Newtona oznacza odwoływanie się do mechaniki klasycznej, przez co pewne zjawiska mające kwantowy charakter, jak np. zmiany stanu protonacji reszt aminokwasów w białkach, nie są możliwe do odtworzenia w MD.

Podobnie pola siłowe odwołują się jedynie do pozycju całych atomów. Oznacza to, że ruch elektronów nie jest tu rozważany. W konsekwencji proces tranferu oraz stany wzbudzone elektronów są poza zasięgiem symulacji MD a reakcje chemiczne nie mogę być właściwie odwzorowane. Duży wpływ na obserwowane zachowania układu mają także artefakty skali, co obserwowano w niniejszej pracy podczas symulowania układów w różnych rozmiarach: od wyjściowej powierzchni 10 10 nm 2 przez 4- po 16-krotnie powielone. W mniejszych układach pewne zjawiska, jak tworzenie agregatów czy enkapsulacja lizozymu, nie mogły być obserwowane. Możliwe jest, iż dalsze zwiększanie skali pozwoli na odkrycie nowych aspektów związanych z procesami zachodzącymi w filmie łzowym. W związku z powyższym, wyniki symulacyjne należy interpretować z pewną ostrożnością. Model ten powinien być dalej rozwijany zarówno poprzez zwiększanie skali symulacyjnej, modyfikacje składu (przykładowo symulowanie niedoboru lipidów polarnych, zmian proporcji między składnikami lipidowymi bądź wprowadzania innych lipidów również wykrytych w filmie łzowym), badanie oddziaływań z pozostałymi białkami łzowymi, ilościowe określenie zaobserwowanego zjawiska zamykania drobnych molekuł hydrofilowych w strukturach TFLL, próby symulacji zerwania filmu łzowego i wiele innych. Przeprowadzone symulacje dynamiki molekularnej zaproponowanego modelu TFLL otwierają także drogę do utworzenia na jego podstawie fantomu filmu łzowego in vitro, co umożliwi poszerzenie metod eksperymentalnych możliwych do zastosowania w badaniu łzy i tym samym przyczyni się do lepszego zrozumienia struktury, składu, funkcji fizjologicznych a także poznania przyczyn i mechanizmów zaburzeń w stanach patologicznych filmu łzowego.

Bibliografia [1] AH Rantamäki, T Seppänen-Laakso, M Oresic, M Jauhiainen, and JM Holopainen. Human tear fluid lipidome: from composition to function. PloS one, 6(5):e19553, 2011. [2] IA Butovich. On the lipid composition of human meibum and tears: comparative analysis of nonpolar lipids. Investigative Ophthalmology & Visual Science, 49(9):3779 3789, 2008. [3] KB Green-Church, KK Nichols, NM Kleinholz, L Zhang, and JJ Nichols. Investigation of the human tear film proteome using multiple proteomic approaches. Molecular vision, 14:456, 2008. [4] G Grabner, I Formanek, W Dorda, and T Luger. Human tear lysozyme. Graefe s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology, 218(5):265 270, 1982. [5] GA de Souza, LMF de Godoy, and M Mann. Identification of 491 proteins in the tear fluid proteome reveals a large number of proteases and protease inhibitors. Genome Biology, 7(8):R72, 2006. [6] FA Shamsi, Z Chen, J Liang, K Li, AA Al-Rajhi, IA Chaudhry, M Li, and K Wu. Analysis and comparison of proteomic profiles of tear fluid from human, cow, sheep, and camel eyes. Investigative Ophthalmology & Visual Science, 52(12):9156 9165, 2011. [7] P Mudgil, M Torres, and TJ Millar. Adsorption of lysozyme to phospholipid and meibomian lipid monolayer films. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 48(2):128 137, 2006. [8] SE Moss, R Klein, and BEK Klein. Prevalence of and risk factors for dry eye syndrome. Archives of Ophthalmology, 118(9):1264 1268, 2000. [9] OD Schein, B Muño, JM Tielsch, K Bandeen-Roche, and S West. Prevalence of dry eye among the elderly. American Journal of Ophthalmology, 124(6):723 728, 1997. [10] M Uchino, Y Nishiwaki, T Michikawa, K Shirakawa, E Kuwahara, M Yamada, M Dogru, D A Schaumberg, T Kawakita, T Takebayashi, et al. Prevalence and risk factors of dry eye disease in japan: Koumi study. Ophthalmology, 118(12):2361 2367, 2011. [11] DA Schaumberg, DA Sullivan, JE Buring, and R Dana. Prevalence of dry eye syndrome among us women. American Journal of Ophthalmology, 136(2):318 326, 2003. 11

[12] DA Schaumberg, R Dana, J E Buring, and DA Sullivan. Prevalence of dry eye disease among us men: estimates from the physicians health studies. Archives of Ophthalmology, 127(6):763 768, 2009. [13] MA Lemp. Report of the national eye institute/industry workshop on clinical trials in dry eyes. Eye & Contact Lens, 21(4):221 232, 1995. [14] P Versura, P Nanni, A Bavelloni, WL Blalock, M Piazzi, A Roda, and EC Campos. Tear proteomics in evaporative dry eye disease. Eye, 24(8):1396 1402, 2010. [15] E Eylan, D Ronen, A Romano, and O Smetana. Lysozyme tear level in patients with herpes simplex virus eye infection. Investigative Ophthalmology & Visual Science, 16(9):850 853, 1977. [16] IA Mackie, DV Seal, and JM Pescod. Beta-adrenergic receptor blocking drugs: tear lysozyme and immunological screening for adverse reaction. British Journal of Ophthalmology, 61(5):354 359, 1977. [17] B Caffery, E Joyce, A Boone, A Slomovic, T Simpson, L Jones, and M Senchyna. Tear lipocalin and lysozyme in sjögren and non-sjogren dry eye. Optometry & Vision Science, 85(8):661 667, 2008. [18] B Redl. Human tear lipocalin. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Protein Structure and Molecular Enzymology, 1482(1):241 248, 2000. [19] B Nagyova and JM Tiffany. Components responsible for the surface tension of human tears. Current Eye Research, 19(1):4 11, 1999. [20] JL Flanagan and MDP Willcox. Role of lactoferrin in the tear film. Biochimie, 91(1):35 43, 2009. [21] L Zhou, RW Beuerman, CM Chan, SZ Zhao, XR Li, H Yang, L Tong, S Liu, ME Stern, and D Tan. Identification of tear fluid biomarkers in dry eye syndrome using itraq quantitative proteomics. Journal of Proteome Research, 8(11):4889 4905, 2009. [22] SJ Marrink, AH De Vries, and DP Tieleman. Lipids on the move: simulations of membrane pores, domains, stalks and curves. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)- Biomembranes, 1788(1):149 168, 2009. [23] AJ Shaw, MJ Collins, BA Davis, and LG Carney. Eyelid pressure: inferences from corneal topographic changes. Cornea, 28(2):181 188, 2009. [24] PG de Gennes and J Prost. The physics of liquid crystals, clarendon, 1993. [25] D Demus, JW Goodby, GW Gray, BW Spiess, and V Vill. Handbook of liquid crystals, low molecular weight liquid crystals I: calamitic liquid crystals. John Wiley & Sons, 2011. [26] JM Smaby and HL Brockman. Properties of cholesteryl oleate and triolein in mixed monolayers at the air-water interface. Journal of Lipid Research, 19(3):325 331, 1978. [27] JA Hamilton, N Oppenheimer, and EH Cordes. Carbon-13 nuclear magnetic resonance studies of cholesteryl esters and cholesteryl ester/triglyceride mixtures. Journal of Biological Chemistry, 252(22):8071 8080, 1977.

[28] W Guo and JA Hamilton. 13c mas nmr studies of crystalline cholesterol and lipid mixtures modeling atherosclerotic plaques. Biophysical Journal, 71(5):2857 2868, 1996. [29] PE King-Smith, MD Bailey, and RJ Braun. Four characteristics and a model of an effective tear film lipid layer (tfll). The Ocular Surface, 11(4):236 245, 2013. [30] R Tutt, A Bradley, C Begley, and LN Thibos. Optical and visual impact of tear break-up in human eyes. Investigative ophthalmology & visual science, 41(13):4117 4123, 2000. [31] AH Rantamäki, M Javanainen, I Vattulainen, and JM Holopainen. Do lipids retard the evaporation of the tear fluid? evaporation of the tear fluid. Investigative Ophthalmology & Visual Science, 53(10):6442 6447, 2012. [32] P Kulovesi, J Telenius, A Koivuniemi, G Brezesinski, AH Rantamäki, T Viitala, E Puukilainen, M Ritala, SK Wiedmer, I Vattulainen, et al. Molecular organization of the tear fluid lipid layer. Biophysical Journal, 99(8):2559 2567, 2010. [33] MJ Doughty. Further assessment of gender-and blink pattern-related differences in the spontaneous eyeblink activity in primary gaze in young adult humans. Optometry & Vision Science, 79(7):439 447, 2002. [34] A Olżyńska and Ł Ćwiklik. Behavior of sphingomyelin and ceramide in a tear film lipid layer model. Annals of Anatomy-Anatomischer Anzeiger, 210:128 134, 2017. [35] H Yu and K Schulten. Membrane sculpting by f-bar domains studied by molecular dynamics simulations. PLoS Computational Biology, 9(1):e1002892, 2013. [36] HI Ingólfsson, MN Melo, FJ van Eerden, C Arnarez, CA Lopez, TA Wassenaar, X Periole, AH de Vries, DP Tieleman, and SJ Marrink. Lipid organization of the plasma membrane. Journal of the American Chemical Society, 136(41):14554 14559, 2014.

Dodatek A Dorobek naukowy autorki Publikacje w czasopismach z listy filadelfijskiej Publikacje będące podstawą niniejszej pracy doktorskiej A. Wizert, D.R. Iskander, Ł. Ćwiklik, Interaction of lysozyme with a tear film lipid layer model: a molecular dynamics simulation study, Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes 2017, DOI: 10.1016/j.bbamem.2017. 08.015, punktacja MNiSW: 35. A. Wizert, D.R. Iskander, Ł. Ćwiklik, Organization of Lipids in the Tear Film: A Molecular-Level View, PloS one 2014, 9, e92461. DOI: 10.1371/journal.pone. 0092461, punktacja MNiSW: 40. Pozostałe E. Rodby-Bousquet, G. Paleg, J. Casey A. Wizert, Livingstone, R. (2016). Physical risk factors influencing wheeled mobility in children with cerebral palsy: a cross-sectional study. BMC pediatrics 2016, 16(1), 165. DOI: 10.1186/s12887-016-0707-6, punktacja MNiSW: 35. M. von Friesendorff, F.E. McGuigan, A. Wizert, C. Rogmark, A.H. Holmberg, A.D. Woolf, K. Akesson, Hip fracture, mortality risk, and cause of death over two decades. Osteoporosis International 2016, 27(10), 2945-2953. DOI: 10.1007/s00198-016-3616-5, punktacja MNiSW: 35. 15

M. Lis, A. Wizert, M. Przybyło, M. Langner, J. Świątek, P. Jungwirth, Ł. Ćwiklik, The Effect of Lipid Oxidation on the Water Permeability of Phospholipid Bilayers, Physical Chemistry Chemical Physics 2011, 13, 17555-17563. DOI: 10.1039/C1CP21009B, punktacja MNiSW: 40. Publikacje w materiałach konferencyjnych Ł. Ćwiklik, A. Olżyńska, D.R. Iskander, A. Wizert, Lysozyme in the Tear Film Lipid Layer. Biophysical Journal 2016, 110(3), 581a. DOI: 10.1016/j.bpj.2015. 11.3104, punktacja MNiSW: 35. A. Wizert, D.R. Iskander, Ł. Ćwiklik, Simulation Study of Proteins Interactions with Tear Film Lipid Layer on the Molecular Level Investigative Ophthalmology & Visual Science 2015 56(7), 3201-3201, punktacja MNiSW: 40. A. Wizert, D.R. Iskander, P. Jungwirth, Ł. Ćwiklik, Molecular-Level Organization of the Tear Film Lipid Layer: A Molecular Dynamics Simulation Study, Biophysical Journal 2014, 106(2), 710a. DOI: 10.1016/j.bpj.2013.11.3919, punktacja MNiSW: 35. A. Wizert, M. Lis, Molecular Dynamics Simulations of Oxidized Phospholipid Bilayer, Bio-Algorithms and Med-Systems 2010 6.12-S, 213-214, punktacja MNiSW: 6. Prezentacje na konferencjach międzynarodowych Plakat: A. Wizert, D.R Iskander, Ł. Ćwiklik, Analysing the Process of Lysozyme Transfere into Tear Film Lipid Layer, Tear Film & Ocular Surface (TFOS) Conference 2016, Montpellier, Francja, 7-10 września 2016. Prezentacja ustna: A. Wizert, D.R Iskander, Ł. Ćwiklik, Simulation Study of Proteins Interactions with Tear Film Lipid Layer on the Molecular Level, The Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) Annual Meeting 2015, Denver, USA, 3-7 maja 2015. Prezentacja ustna: A. Wizert, D.R Iskander, Ł. Ćwiklik, A Molecular-Level View on the Organization of Lipids in the Tear Film, 7th Tear Film & Ocular Surface (TFOS) Conference 2013, Taormina, Sycylia, Włochy, 18-21 września

2013. Prezentacja ustna: A. Wizert, D.R Iskander, Ł. Ćwiklik, Molecular Dynamics Simpulations od Artificial Tear Film Lipid Layer, 17th European Conference on Mathematics for Industry (ECMI), Lund, Szwecja, 23-27 lipca 2012. Uzyskane granty Kierownik projektu w grancie 2013/11/N/ST7/02682, Preludium 6, NCN, Budowa realistycznego modelu łzy oraz badanie stabilności jej warstwy lipidowej w warunkach panujących na powierzchni oka i w obecności białek w fazie wodnej, przy zastosowaniu symulacji dynamiki molekularnej; kwota: 62.400 PLN, okres: listopad 2014 luty 2016. Współpraca międzynarodowa Instytut Heyrowskiego Czeskiej Akademii Nauk; współpraca od 2010 roku. ODALab (Optical Diagnostics and Applications Laboratory), Instytut Optyki Uniwersytetu w Rochester, NY, USA; maj czerwiec 2015 (staż naukowy).