Dr hab. Urszula Gawlik-Dziki, prof. UP Katedra Biochemii i Chemii Żywności Wydział Nauk o Żywności i Biotechnologii Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie Lublin, 28.03.2018 Ocena rozprawy doktorskiej mgr inż. Donaty Izabeli Zaczyńskiej pt. Interakcje preparatów białkowych z kwasami chlorogenowymi ziarna kawy w badaniach modelowych i prozdrowotnych produktach żywnościowych Kawa napar z palonych ziaren kawowca, jest jednym z najbardziej rozpowszechnionych napojów na świecie. Jego popularność wynika głównie z psychoaktywnych właściwości kofeiny, jednak w ostatnich latach ogromne zainteresowanie budzą inne składniki kawy kwasy chlorogenowe. Udokumentowano wielokierunkowe działanie prozdrowotne tych związków wynikające głównie z aktywności przeciwutleniających (w tym zdolności do modulowania aktywności enzymów pro- i antyoksydacyjnych). W związku z tym wielu producentów wykorzystuje kwasy chlorogenowe do suplementacji żywności. Niestety, czynnikiem zasadniczo wpływającym na aktywność biologiczną takich produktów są interakcje kwasów chlorogenowych i składników matrycy żywności, w tym białek. Prowadzić one mogą do istotnego obniżenia wartości odżywczej oraz potencjału nutraceutycznego produktów funkcjonalnych a także wpływają na ich atrakcyjność organoleptyczną. Pogłębienie wiedzy o wzajemnych oddziaływaniach związków czynnych jest bardzo ważnym trendem badań żywnością funkcjonalną, w który bardzo dobrze wpisuje się praca doktorska mgr inż. Donaty Zaczyńskiej. Przedstawiona do oceny rozprawa doktorska jest starannie przygotowanym pod względem naukowym i graficznym opracowaniem o układzie typowym dla tego typu prac. Liczy ona 252 strony i podzielona jest na 7 głównych rozdziałów. Oprócz tego praca zawiera streszczenie w języku polskim i angielskim. Dysertacja zawiera łącznie 50 rysunków i 66 tabel. 1
Pierwszy z rozdziałów to Wstęp, poprzedzony spisem skrótów, wprowadzający czytelnika w tematykę dysertacji. Następny to Przegląd literatury, kolejne to Cel badań, Materiały i metody, Wyniki i dyskusja wyników, Podsumowanie i Streszczenie. Pracę zamykają spis tabel, spis rysunków, bibliografia i wykaz publikacji. Treść pracy oparta jest na obszernej literaturze przedmiotu. Spośród niezwykle obszernego piśmiennictwa Autorka wykorzystała 246 prac, z których większość to prace najnowsze, opublikowane w czasopismach o wysokiej randze naukowej. Przegląd literatury podzielony jest na osiem głównych rozdziałów; każdy z nich składa się z kilku podrozdziałów. W pierwszym z nich Autorka przeprowadziła charakterystykę kwasów hydroksycynamonowych oraz chlorogenowych, omówiła profil związków fenolowych występujących w zielonych ziarnach kawy oraz podjęła się wyjaśnienia właściwości prozdrowotnych i mechanizmów działania kwasów chlorogenowych ze szczególnym uwzględnieniem ich właściwości kardioprotekcyjnych, przeciwcukrzycowych, neurodegeneracyjnych, antybakteryjnych oraz przeciwnowotworowych. Kolejny rozdział poświęcony jest przemianom kwasów chlorogenowych zachodzącym podczas procesów prażenia ziaren kawy. Omówione w nim zostały skutki reakcji Maillarda i reakcji polimeryzacji, efekty hydrolizy, pirolizy, utleniania oraz izomeryzacji, degradacji i estryfikacji wewnątrzcząsteczkowych. Kolejne zagadnienia poruszone przez Autorkę to suplementacja żywności kwasami chlorogenowymi ze szczególnym uwzględnieniem skutków interakcji kwasów chlorogenowych z głównymi komponentami matrycy żywności - lipidami, węglowodanami i białkami oraz ich wchłanianie i przemiany metaboliczne. Kolejny podrozdział dotyczy zagadnienia minimalizowania negatywnych skutków interakcji kwasów chlorogenowych poprzez zastosowanie cyklodekstryn. Zakres przeglądu literatury oraz dobór treści poszczególnych rozdziałów jest merytorycznie uzasadniony. Stanowi syntetyczne wprowadzenie czytelnika w bardzo obszerną tematykę pracy oraz jej część eksperymentalną. Potwierdza także, iż Doktorantka ma dobrą orientację w literaturze tematu, jednakże niektóre jego fragmenty powinny znaleźć się w dyskusji wyników. Dotyczy to zwłaszcza danych zamieszczonych na stronach 40-42. Po wprowadzeniu Autorka pracy przedstawiła cel badań, którego realizacji służyć miało pięć celów szczegółowych. Na podkreślenie zasługuje kompleksowość założonych badań oraz ich interdyscyplinarny charakter. Kolejną część pracy stanowi rozdział Materiały i metody. Rozpoczyna go przedstawienie zakresu przeprowadzonych doświadczeń w postaci zwięzłego opisu i 2
przejrzystego schematu, jednak dalsza lektura, moim zdaniem, jest dość uciążliwa ze względu na ilość i niejasny podział treści. I tak, w podrozdziale Materiały i metody zawarto wiele danych (spis odczynników, chromatogramy, widma kwasów fenolowych, krzywe wzorcowe itp.), które z powodzeniem można było umieścić w Aneksie zyskując na przejrzystości pracy. W tym miejscu podkreślić należy szerokie spektrum nowoczesnych metod i technik badawczych wymagających zarówno dużej wiedzy jak i umiejętności praktycznych. Ich zastosowanie dowodzi umiejętności posługiwania się nowoczesnymi metodami badawczymi oraz znajomości najnowszej aparatury analitycznej. Zastrzeżenia budzi jednak dobór metodyki do oznaczania strawności proteolitycznej. Bardzo proszę o wyjaśnienie, dlaczego do sporządzania buforu użyto mocznika? Czy nie lepszy byłby stosowany powszechnie w badaniach nad strawnością in vitro bufor PBS? Na jakiej podstawie dobrano czas trawienia pepsyną, trypsyną i chymotrypsyną? Dlaczego po symulowanym trawieniu gastrycznym próby liofilizowano? Czy Autorka opierała się na konkretnej metodyce? Jeśli tak, brakuje odniesienia literaturowego. Istotną część badań stanowi oznaczanie aktywności przeciwutleniającej. Czy oznaczając zdolność do neutralizowania syntetycznego rodnika DPPH badano kinetykę reakcji? Jeśli nie, na jakiej podstawie dobrano czas reakcji (30 min.)? Autorka podaje, iż aktywność przeciwrodnikową określiła jako IC 50. Dlaczego w takim razie w dalszej części pracy jest ona wyrażona w procentach? Podobnie w przypadku oznaczania zdolności do neutralizowania rodników hydroksylowych. Czy w tym przypadku niemożliwe było wyznaczenie wartości IC 50? Bardzo ważną część badań stanowią analizy produktów żywnościowych wzbogaconych w kwasy chlorogenowe i hydrolizaty białkowe. Odnoszę jednak wrażenie, iż Autorka nieco zbyt ambitnie podeszła do tej części badań ze szkodą dla przejrzystości i klarowności pracy. Może należało ograniczyć się tylko do chleba wzbogaconego w hydrolizat z białka jaja kurzego oraz kwasy chlorogenowe? Tym bardziej, iż badania na modelu zwierzęcym przeprowadzono tylko dla chleba wzbogaconego w ekstrakt z zielonej kawy i kwasami chlorogenowymi w postaci kompleksów inkluzyjnych. Dlaczego w skład receptury nie wchodził hydrolizat białka jaja kurzego? W przypadku produktów żywnościowych przeprowadzono test utleniania cholesterolu LDL, nie przeprowadzono natomiast testów DPPH oraz nie oznaczono zdolności do neutralizowania rodników hydroksylowych. Dlaczego? Chromatogramy zawarte w rozdziałach 4.4.19. 3 i 4.4.19.3 powinny się znaleźć raczej w rozdziale Wyniki i dyskusja wyników. 3
Rozdział 5 Wyniki i dyskusja wyników powinien być raczej podzielony na dwie części z uwagi na ilość przeprowadzonych analiz. Podczas lektury tego rozdziału niedogodność stanowi ilość stosowanych skrótów i brak ich wyjaśnienia pod tabelami i rysunkami, jednak zdaję sobie sprawę, iż wpłynęłoby to znacząco na objętość pracy. Wątpliwości budzi opis profilu aminokwasowego produktów uzyskanych po interakcji białek z kwasami chlorogenowymi. Autorka pisze Profil aminokwasów analizowano po przeprowadzeniu hydrolizy kwasem solnym. Czy produktów tych nie trawiono enzymatycznie? Jeśli nie dlaczego? Rozdział 5.2.6. Proszę o wyjaśnienie stwierdzenia, że dodatek KCH do hydrolizatów białkowych wywołał degradację aminokwasów egzogennych. Rozdział 5.3.3. Proszę o wyjaśnienie stwierdzenia: dodatek EKZ powodował zmniejszenie zawartości aminokwasów na skutek oddziaływań miedzy KCH i peptydami. Czy Autorka ma na myśli zawartość aminokwasów ogółem czy po hydrolizie? Czy może chodzi o ilość wolnych, oznaczanych, aminokwasów? Opis wyników jest najbardziej wartościową częścią pracy - Autorka wykazała się umiejętnością analizy wyników i wyciągania wniosków, jednak pewien niedosyt budzi dyskusja z wynikami uzyskanymi przez innych badaczy. Być może zasadne byłoby przeprowadzenie dyskusji w oddzielnym rozdziale i bardziej szczegółowe przedyskutowanie najbardziej wartościowych wyników? Całość pracy zamyka rozdział zawierający podsumowanie i opis osiągnięć wynikających z przeprowadzonych badań. Odzwierciedlają one otrzymane wyniki, ich interpretację i dyskusję. Według mnie brakuje ogólnych wniosków podsumowujących całość uzyskanych wyników, jednak zdaję sobie sprawę, że przy takiej ilości materiału oraz tak szeroko zakrojonych badaniach jest to zadanie niezwykle trudne. Wątpliwości budzi punkt 4. Podrozdziału 6.2. Zastosowana metodyka hydrolizy enzymatycznej nie odzwierciedla warunków panujących w ludzkim przewodzie pokarmowym, więc takie wnioskowanie jest zbyt dalekosiężne. Wszystkie powyższe uwagi nie umniejszają jednak ogólnej wartości pracy, a lektura całości pozwala na pozytywną ocenę założeń i wartości merytorycznej dysertacji. Podsumowując, praca doktorska mgr inż. Donaty Zaczyńskiej jest interesującą i wartościową rozprawą naukową dotyczącą interakcji kwasów chlorogenowych z białkami zarówno w układach modelowych jak i w prozdrowotnych produktach żywnościowych. Jest 4
ona kompleksowym opracowaniem stanowiącym wartościowy przyczynek do istniejącego stanu wiedzy, zawiera również elementy nowatorskie. Na podkreślenie zasługuje aplikacyjna wartość pracy. Przygotowanie rozprawy przez Doktorantkę świadczy o jej naukowej dojrzałości, predyspozycjach do pracy naukowo-badawczej i opanowaniu różnorodnych metod analitycznych. Doktorantka wykazała się umiejętnością prowadzenia badań na wysokim poziomie oraz umiejętnością przygotowywania rozpraw naukowych, również pod względem językowym i edytorskim. Uwzględniając znaczenie naukowe wykonanych badań jak i całość rozprawy stwierdzam, iż mgr inż. Donata Zaczyńska wykazała dobre przygotowanie, wiedzę i umiejętności pozwalające na dalszy rozwój naukowy, dlatego też wnioskuję o wyróżnienie pracy. W podsumowaniu stwierdzam, że przedłożona do recenzji praca doktorska jest oryginalnym i wartościowym osiągnięciem naukowym a przedstawione uwagi nie rzutują na jej wysoką wartość naukową. Rozprawa spełnia wszystkie wymagania stawiane pracom doktorskim, wymienione w ustawie o stopniach naukowych i tytule naukowym z dnia 14.03. 2003 r. (Dz.U. Nr 65, poz. 595, art.13.1 z późn. zm.). Na tej podstawie wnoszę o dopuszczenie pani mgr inż. Donaty Zaczyńskiej do dalszych etapów przewodu doktorskiego. 5