MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2009, 61: Sebastian Wardak, Marek Jagielski 1

MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2009, 61: 63-77 Sebastian Wardak, Marek Jagielski 1 OCENA PRZYDATNOŚCI WYBRANYCH METOD GENOTYPOWYCH I FENOTYPOWYCH DO WEWNĄTRZGATUNKOWEGO RÓŻNICOWANIA PAŁECZEK CAMPYLOBACTER JEJUNI ORAZ CAMPYLOBACTER COLI IZOLOWANYCH OD LUDZI. II. PRZYDATNOŚĆ METOD PFGE, ERIC-PCR, PCR-FLA-A-RFLP I MLST Zakład Bakteriologii NIZP - PZH w Warszawie Kierownik: prof. dr hab. M. Jagielski Oceniono przydatność metod PFGE, ERIC-PCR oraz PCR-flaA-RFLP do wewnątrzgatunkowego różnicowania izolatów pałeczek C. jejuni C. coli wyosobnionych od ludzi ze sporadycznych zakażeń oraz z ognisk zakażeń pokarmowych. Izolaty z ognisk zakażeń pokarmowych dodatkowo analizowano metodą MLST. Wykazano, że spośród zastosowanych genotypowych metod typowania najwyższą wartością indeksu różnicowania izolatów pałeczek C. jejuni charakteryzowała się metoda PFGE i ERIC-PCR. Stwierdzono, że wszystkie oceniane genotypowe metody mogą być wykorzystywane do potwierdzania pokrewieństwa izolatów pałeczek C. jejuni i C. coli pochodzących od osób z poszczególnych ognisk zakażenia tymi drobnoustrojami. W drugiej części prezentowanej pracy przedstawiono ocenę przydatności metod PFGE (Restriction Enzyme Analysis - Pulsed Field Gel Electrophoresis), PCR-flaA-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism of flaa gene) oraz ERIC-PCR (Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus) do różnicowania izolatów pałeczek Campylobacter jejuni i Campylobacter coli wyosobnionych od ludzi w latach 2006-2007. Ponadto metodą MLST (Multilocus Sequence Typing) porównano profile alleliczne genów metabolizmu podstawowego izolatów pałeczek C. jejuni wyosobnionych od ludzi z trzech ognisk zakażenia pokarmowego. 1 Praca naukowa finansowana ze środków na naukę w latach 2007-2008 jako projekt badawczy nr NN404253233

64 S. Wardak, M. Jagielski Nr 1 MATERIAŁ I METODY Przedmiot badań oraz dane kliniczne osób od których izolowano pałeczki Campylobacter. Dane dotyczące badanych izolatów pałeczek C. jejuni i C. coli opisano uprzednio (14). Analiza polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych genomowego DNA pałeczek C. jejuni oraz C. coli metodą elektroforezy w zmiennym homogennym polu elektrycznym o kształcie sześciok ą t a f o r e m n e g o ( P F G E ). Izolację całkowitego DNA do analizy polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych metodą elektroforezy w zmiennym polu elektrycznym przeprowadzono zgodnie z wytycznymi CAMPYNET (http://campynet.vetinst.dk/pfge. html) i z modyfikacją własną. Do badania użyto tej samej zawiesiny komórek bakteryjnych w roztworze PBS o gęstości 7 w skali McFarlanda, która została przygotowana w celu izolacji genomowego DNA. Bloczki wykonane po zmieszaniu 300 μl zawiesiny bakteryjnej z 600 µl 1% agarozy umieszczano w sterylnych probówkach typu Eppendorf o pojemności 1,5 ml zawierającej 1,0 ml buforu ESP (0,5 M EDTA, 1% Sarkozyl) oraz 10 µl roztworu proteinazy K o stężeniu 20 mg/ml i inkubowano w temperaturze 55 o C przez 18 20 godzin. Po usunięciu buforu ESP bloczki płukano pięciokrotnie w 1 ml buforu TE. Fragment bloczka o szerokości około 2 mm umieszczano w nowej, sterylnej probówce typu Eppendorf zawierającej 20 jednostek enzymu restrykcyjnego SmaI i inkubowano przez 16 18 godzin w temperaturze 30 o C. Następnie inkubowany fragment bloczka umieszczano w 200 μl 0,75 x TBE (90 mm Tris-kwas borny, 2 mm EDTA, ph 8,0). W celu stwierdzenia poprawności wykonania badania oraz określenia międzyżelowego poziomu identyczności w kolejnych rozdziałach w żelu agarozowym jako kontroli używano szczepu z kolekcji PZH C. jejuni PZH 93/06. Jako wzorzec wielkości fragmentów DNA zastosowano Lambda Ladder, który umieszczano co 5-6 ścieżkę w 1% żelu agarozowym. Elektroforezę pulsacyjną prowadzono w 0,5 x stężonym buforze TBE w aparacie Gene Mapper (Bio-Rad). Zgodnie z wytycznymi CAMPYNET zastosowano następujące warunki elektroforezy: temperatura rozdziału 14 o C; napięcie 6 V/cm; początkowy czas pulsu 0,5 s, czas końcowy pulsu 40 s, czas elektroforezy 22 godziny. Elekroforegramy dokumentowano przy użyciu GelScan wersja v.1.13. firmy Kucharczyk T.E. (Polska), a następnie analizowano przy użyciu oprogramowania komputerowego Gel Compar II Software v. 5.0 firmy Applied Maths, (Belgia). Izolaty bakteryjne zaliczano do określonego profilu PFGE, jeżeli nie obserwowano różnic w ich wzorach restrykcyjnych. Analiza polimorfizmu genetycznego badanych izolatów pałeczek C. jejuni oraz C. coli metodą ERIC-PCR (Enterobacterial Repetitiv e I n t e r g e n i c C o n s e n s u s ). Badanie zostało przeprowadzone zgodnie wytycznymi zaproponowanymi przez Steinbrueckner i wsp. (12). Metodą ERIC-PCR analizowano genomowy DNA izolatów pałeczek C. jejuni oraz C. coli. Amplifikaty ERIC-PCR uzyskano w reakcji PCR z zastosowaniem jednej pary starterów: Eric1 i Eric2 opisanych przez Versalovic i wsp. (13). Amplifikację DNA prowadzono w objętości 25 μl w termocyklerze Mastercycler type 5333 v. 2.30.33-9 (Eppendorf, Niemcy). Mieszaninę reakcyjną przygotowano dla wszystkich badanych izolatów jednocześnie ze względu na próbę uniknięcia wpływu nieznacznych zmian stężenia poszczególnych składników mieszaniny na produkt amplifikacji. W celu przygotowania mastermiksu na 150 oddzielnych reakcji do 1950 μl

Nr 1 Wewnątrzgatunkowe różnicowanie pałeczek Campylobacter 65 jałowej wody dejonizowanej dodawano 375 μl dziesięciokrotnie stężonego buforu reakcyjnego (NH 4 ) 2 SO 4 (dołączonego przez producenta do polimerazy), 525 μl 25 mm roztworu MgCl 2 (dołączonego przez producenta do polimerazy), 75 μl mieszaniny deoksynukleotydów (końcowe stężenie każdego z dntp 200 μm) oraz 300 μl mieszaniny starterów Eric1 oraz Eric2. Mieszaninę rozlewano po 22,5 μl do probówek PCR o objętości 0,2 ml. Następnie dodawano preparat matrycowego DNA w ilości 2,5 μl oraz 1 μl polimerazy DNA Taq (Fermentas, Litwa) o aktywności 1 j./μl i niezwłocznie umieszczano w termocyklerze. W celu stwierdzenia poprawności wykonania badania oraz określenia międzyżelowego poziomu identyczności w kolejnych rozdziałach w żelu agarozowym jako kontroli używano szczepu z kolekcji PZH C. jejuni PZH 93/06. Kontrolę ujemną stanowiła mieszanina reakcyjna bez matrycowego DNA. Analizę polimorfizmu genetycznego amplifikatów uzyskanych metodą ERIC-PCR prowadzono w 2% żelu agarozowym. (Agarose Electophoresis Grade, MP Biomedicals, Niemcy) w buforze TAE. Jako wzorca wielkości DNA używano1 kb DNA Ladder (Fermentas, Litwa), który umieszczano co 5-6 ścieżkę w przygotowanym żelu agarozowym. Elekroforegramy dokumentowano przy użyciu GelScan wersja v.1.13. firmy Kucharczyk T.E. (Polska), a następnie analizowano przy użyciu oprogramowania komputerowego Gel Compar II Software v. 5.0 firmy Applied Maths, (Belgia). Analiza polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych amplifikowanego fragmentu genu flaa badanych izolatów pałeczek C. jejuni oraz C. coli (Restriction Fragment Length Polymorphism of flaa gene - PCR-flaA- R F L P ). Badanie zostało przeprowadzone zgodnie z wytycznymi CAMPYNET (http://campynet.vetinst.dk/fla/html). Metodą PCR-flaA-RFLP analizowano amplifikaty uzyskane z genomowym DNA izolatów pałeczek z C. jejuni oraz C. coli. Amplifikaty do analizy PCR-flaA-RFLP uzyskano w reakcji PCR z zastosowaniem pary starterów: FlaA1 i FlaA2. W celu przygotowania mastermiksu dla 10 oddzielnych reakcji do 145 μl jałowej wody dejonizowanej dodawano 25 μl dziesięciokrotnie stężonego buforu reakcyjnego (NH 4 ) 2 SO 4 (dołączonego przez producenta do polimerazy), 15 μl 25 mm roztworu MgCl 2 (dołączonego przez producenta do polimerazy), 5 μl mieszaniny deoksynukleotydów (końcowe stężenie każdego z dntp 200 μm), 20 μl mieszaniny starterów FlaA1 oraz FlaA2 (końcowe stężenie każdego startera 0,4 μm) oraz 10 μl polimerazy DNA Taq o aktywności 1 j./μl (końcowa aktywność 1 j./reakcję). Mieszaninę dokładnie mieszano i rozlewano po 22,5 μl do probówek PCR (Eppendorf, Niemcy) o objętości 0,2 ml. Następnie dodawano matrycowego DNA w ilości 2,5 μl i próbki niezwłocznie umieszczano w termocyklerze. Otrzymane w wyniku PCR produkty reakcji poddawano trawieniu enzymem restrykcyjnym DdeI o aktywności 10 j./µl (Sigma, Niemcy). Mieszanina reakcyjna zawierała 5 µl produktu reakcji PCR, 2 µl buforu SH (dołączonego przez producenta enzymu), 0,2 µl enzymu restrykcyjnego oraz 12,8 µl sterylnej wody dejonizowanej. Próbki inkubowano w temp. 37ºC przez 16-18 godzin. Produkty powstałe w wyniku działania enzymu restrykcyjnego określano po rozdziale w 2,5% żelu agarozowym. Jako wzorca wielkości DNA używano GeneRuler 100 bp DNA Ladder (Fermentas), który umieszczano co 5-7 ścieżkę w przygotowanym żelu agarozowym. W celu stwierdzenia poprawności wykonania badania oraz określenia międzyżelowego poziomu identyczności w kolejnych rozdziałach w żelu agarozowym jako kontroli używano szczepu z kolekcji PZH C. jejuni PZH 93/06. Kontrolę ujemną stanowiła zaś mieszanina reakcyjna bez matrycowego DNA. Elekroforegramy dokumentowano przy użyciu zestawu do dokumentacji fotograficznej

66 S. Wardak, M. Jagielski Nr 1 wyników elektroforezy GelScan wersja v.1.13. firmy Kucharczyk T.E. (Polska), a następnie analizowano przy użyciu oprogramowania komputerowego Gel Compar II Software v. 5.0 firmy Applied Maths, (Belgia). Ustalenie pokrewieństwa izolatów pałeczek C. jejuni metodą porównywania profili allelicznych genów metabolizmu podstawowego tzw. Multilocus Sequence Typing (MLST). Analizę MLST przeprowadzono dla wybranych 6 izolatów pałeczek C. jejuni (82/06, 92/06, 76/07, 82/07, 124/07, 125/07) wyosobnionych od pacjentów z 3 zbiorowych ognisk zakażenia pokarmowego: Użyto 7 par oligonukleotydów starterowych PCR opisanych na stronie internetowej http://pubmlst. org/campylobacter/mlst-info/cjejuni/cjejuni-info.shtml jako przydatnych do amplifikacji fragmentów genów: aspa, glna, glta, glya, pgm, tkt, unca. A n a l i z a s t a t y s t y c z n a. Wyniki uzyskane metodą ERIC-PCR, PCR-flaA-RFLP, PFGE oraz REAP analizowano przy użyciu oprogramowania GelCompar II Software v. 5.0 (Applied Maths, Belgia). Podobieństwo genetyczne izolatów przedstawiono w postaci dendrogramów utworzonych przy wykorzystaniu metody klasteryzacji UPGMA (Unweighted Pair Group Method Rusing Arithmetic averages) i współczynnika korelacji Pearson a w przypadku analizy profili uzyskanych metodą ERIC-PCR oraz współczynnika podobieństwa Dice a do analizy profili uzyskanych metodą PFGE. Dla każdej z zastosowanych metod określono indeks różnicowania (indeks Simpsona) izolatów należących do gatunku pałeczek C. jejuni (5). Im wartość indeksu bliższa wartości 1 tym wyższa zdolność różnicowania danej metody. WYNIKI Wyniki różnicowania izolatów pałeczek C. jejuni oraz C. coli metodą elektroforezy pulsacyjnej (PFGE). Metodą PFGE analizie poddano wszystkie badane izolaty pałeczek C. jejuni i C. coli (Ryc. 1). W wyniku rozdziału elektroforetycznego metodą PFGE otrzymano wzory zawierające od 4 do 13 prążków o wielkości od 48 kpz do 539 kpz. Wzory PFGE większości izolatów pałeczek C. coli charakteryzowały się w porównaniu do wzorów PFGE izolatów pałeczek C. jejuni obecnością prążków głównie o wielkości od około 50 kpz do około 250 kpz. Analiza przy użyciu oprogramowania Gel Compar II Software v. 5.0 (Applied Maths, Belgia) uzyskanych metodą PFGE elektroforetycznych wzorów genomowego DNA badanych izolatów pałeczek C. jejuni i C. coli pozwoliła na utworzenie dendrogramu, z którego wynika, że oba gatunki zostały rozdzielone na dwie gałęzie. Całkowite podobieństwo izolatów należących do obu gatunków pałeczek Campylobacter wyniosło 41,5%. W wyniku badania powtarzalności wyników typowania szczepu pałeczek C. jejuni PZH 93/06 stwierdzono iż międzyżelowy poziom identyczności profili wynosił 100%. Izolaty pałeczek C. jejuni i C. coli pochodzące z czterech udokumentowanych ognisk zakażenia pokarmowego z lat 2006-2007 wykazywały taki sam profil w obrębie ogniska. Wśród 128 badanych izolatów pałeczek C. jejuni wyróżniono 117 profili, spośród których aż 107 było unikatowych (tj. były reprezentowane przez pojedyncze izolaty). Pozostałe 10 profili reprezentowało od dwóch (9 profili) do trzech izolatów (1 profil). Obliczona wartość indeksu różnicowania izolatów pałeczek C. jejuni na podstawie analizy polimorfizmu genetycznego metodą PFGE wyniosła 0,999. Szczegó-

Nr 1 Wewnątrzgatunkowe różnicowanie pałeczek Campylobacter 67 Ryc. 1. Dendogram przedstawiający wyniki genetycznego zróżnicowania wszystkich badanych izolatów pałeczek C. jejuni (n=135) i C. coli (n=20) metodą PFGE z zastosowaniem endonukleazy SmaI (Dice, Opt:1,50%, Tol 1,50%). Ramką oznaczono profile izolatów pałeczek C. coli.

68 S. Wardak, M. Jagielski Nr 1 Ryc. 2. Dendogram przedstawiający wyniki genetycznego zróżnicowania wszystkich badanych izolatów pałeczek C. jejuni (n=135) i C. coli (n=20) metodą ERIC-PCR (Person, Opt:1,50%, Tol 1,50%). Ramką oznaczono profile izolatów pałeczek C. coli.

Nr 1 Wewnątrzgatunkowe różnicowanie pałeczek Campylobacter 69 Ryc.3. Analiza wyników genetycznego zróżnicowania izolatów pałeczek C. coli (n=20) metodą PCR-flaA-RFLP z zastosowaniem endonukleazy DdeI.

70 S. Wardak, M. Jagielski Nr 1 łowa analiza dendrogramu wykazała także, że izolaty pałeczek C. jejuni wyosobnione w różnych rejonach kraju nie były ze sobą klonalnie powiązane. Wśród 17 izolatów pałeczek C. coli wyróżniono 15 profili, spośród których 13 było unikatowych. Pozostałe dwa profile reprezentowały po dwa izolaty. A n a l i z a w y n i k ó w E R I C - P C R. Analizie poddano wszystkie badane izolaty pałeczek C. jejuni i C. coli (Ryc. 2). Po elektroforetycznym rozdziale amplifikatów uzyskano wzory zawierające od 5 do 14 prążków odpowiadających fragmentom DNA o wielkości od około 250 pz do około 2500 pz. Analiza elektroforegramów pozwoliła na wykrycie charakterystycznego prążka o wielkości około 900 pz obecnego w elektroforegramach amplifikatów fragmentów genomowego DNA większości izolatów pałeczek C. jejuni oraz prążków o wielkości około 500 pz i 600 pz obecnego w elektroforegramach amplifikatów fragmentów genomowego DNA większości izolatów pałeczek C. coli. W wyniku analizy wzorów amplifikatów przy użyciu oprogramowania Gel Compar II Software v. 5.0 (Applied Maths, Belgia), uzyskano dendrogram, z którego wynika, że izolaty pałeczek C. jejuni i C. coli zostały rozdzielone na dwie gałęzie. Całkowite podobieństwo izolatów należących do obu gatunków pałeczek Campylobacter wyniosło 42,7%. W wyniku badania powtarzalności wyników typowania ERIC-PCR szczepu pałeczek C. jejuni PZH 93/06 stwierdzono, iż międzyżelowy poziom identyczności profili z użyciem algorytmu UPGMA oraz współczynnika korelacji Pearson a wynosił 98,4%. Poziom ten potraktowano jako punkt odcięcia dla wyznaczenia liczby profili pałeczek C. jejuni oraz C. coli uzyskanych metodą ERIC-PCR. Izolaty pałeczek Campylobacter pochodzące z poszczególnych ognisk charakteryzowały się wysokim poziomem podobieństwa genetycznego, od 99,09% do 99,42% dla izolatów z ogniska. A więc wszystkie izolaty pałeczek C. jejuni oraz C. coli pochodzące z czterech udokumentowanych ognisk zakażenia pokarmowego z lat 2006-2007 posiadały takie same profile w obrębie ogniska. Wśród 128 badanych izolatów pałeczek C. jejuni wyróżniono 107 profili ERIC-PCR spośród których 90 było unikatowych. Pozostałe 17 profili wykryto u dwóch (13 profili) lub trzech izolatów (4 profile). Obliczona wartość indeksu różnicowania izolatów pałeczek C. jejuni na podstawie analizy polimorfizmu genetycznego metodą ERIC- PCR wyniosła 0,997. Wśród 17 izolatów pałeczek C. coli wyróżniono 15 profili, spośród których 13 było unikatowych. Pozostałe dwa profile reprezentowały po dwa izolaty. Wyniki różnicowania izolatów pałeczek C. jejuni oraz C. coli metodą PCR-flaA- R F L P. Metodą PCR-flaA-RFLP analizie poddano wszystkie badane izolaty pałeczek C. jejuni oraz C. coli. W wyniku elektroforetycznego rozdziału restrykcyjnych fragmentów amplifikowanego fragmentu genu flaa otrzymano wzory zawierające od 2 do 5 prążków odpowiadających fragmentom DNA o wielkości od około 150 pz do ponad 1000 pz. Analiza wzorów PCR-flaA-RFLP izolatów pałeczek C. jejuni i C. coli z wykorzystaniem oprogramowania Gel Compar II Software v. 5.0 (Applied Maths, Belgia), umożliwiła wyróżnienie 21 profili (Ryc. 3). W wyniku badania powtarzalności wyników typowania PCR-flaA-RFLP szczepu pałeczek C. jejuni PZH 93/06 stwierdzono, iż międzyżelowy poziom identyczności wzorów PCR-flaA-RFLP tego izolatu wynosił 100%. Izolaty pałeczek C. jejuni i C. coli pochodzące z czterech udokumentowanych ognisk zakażenia pokarmowego wykazywały takie same wzory PCR-flaA-RFLP w ramach ogniska. Cztery profile PCR-flaA-RFLP były wspólne dla izolatów obu gatunków pałeczek Campylobacter, pozostałe były charakterystyczne dla izolatów pałeczek C. jejuni albo pałeczek C. coli. Analizując osobno izolaty C. jejuni oraz C. coli stwierdzono, że wśród 128 badanych

Nr 1 Wewnątrzgatunkowe różnicowanie pałeczek Campylobacter 71 izolatów pałeczek C. jejuni wyróżniono 18 profili, spośród których dwa dotyczyły tylko pojedynczych izolatów. Pozostałe 16 profili reprezentowało od dwóch do 19 izolatów. Obliczona wartość indeksu różnicowania izolatów pałeczek C. jejuni na podstawie analizy PCR-flaA-RFLP wyniosła 0,912. Wśród 17 izolatów pałeczek C. coli wyróżniono 7 profili, spośród których pięć dotyczyły tylko pojedynczych izolatów. Pozostałe dwa profile reprezentowały po sześć izolatów. Wyniki analizy pokrewieństwa izolatów metodą porównywania profili allelicznych genów metabolizmu podstawowego tzw. Multilocus Sequence Typing (MLST). Wśród 6 badanych izolatów wyosobnionych od pacjentów z trzech ognisk zakażenia pokarmowego wyróżniono 3 różne profile alleliczne. Izolaty z poszczególnych ognisk należały do jednego profilu allelicznego. Uzyskane profile alleliczne (2,1,12,9,2,1,25), (4,44,10,1,1,7,1), (9,1,4,6,4,5,1) zaliczono odpowiednio do 3 nowych typów sekwencyjnych, którym nadano numery: ST 3847, 3848 oraz 3849. Uzyskane typy sekwencyjne zaliczono następnie do kompleksu klonalnego odpowiednio: ST-21, ST- 257 oraz ST-45. Dostępny w bazie danych opis dotyczący poszczególnych izolatów pałeczek C. jejuni zaliczonych do powyższych kompleksów, pozwolił na stwierdzenie, że izolaty te były wyosobnione głównie w krajach Unii Europejskiej najczęściej od ludzi z objawami zapalenia żołądkowo jelitowego oraz od kur bądź z kurzego mięsa. Analiza wybranych przypadków zakażeń wywołanych przez pałeczki C. jejuni oraz C. coli w oparciu o dane epidemiologiczne oraz genotypową charakterystykę izolatów wyosobnionych od zakażonych o s ó b. Analizie poddano dane epidemiologiczne przypadków objawowych zakażeń oraz uzyskane wyniki różnicowania izolatów pałeczek C. jejuni i C. coli wyosobnionych od trojga osób, u których zaobserwowano wielokrotne, objawowe zakażenie tymi drobnoustrojami. Przeprowadzone badania różnicowania wykazały, że poszczególne izolaty wyosobnione od jednej osoby nie były spokrewnione i nie należały do jednego profilu w zastosowanych metodach typowania. Analizie poddano także dane epidemiologiczne oraz wyniki różnicowania izolatów pałeczek C. jejuni oraz C. coli wyosobnionych od osób z ognisk bądź ze sporadycznych przypadków zakażeń. Izolaty te wybrano ze względu na występowanie nierozróżnialnych profili PFGE u dwu i więcej izolatów (10 profili C. jejuni i dwa profile C. coli, wraz z czterema profilami zawierającymi izolaty z ognisk). W badaniach 12 profili reprezentujących 25 izolatów pałeczek C. jejuni i C. coli nie pochodzących z ognisk, 2 reprezentowało po 2 izolaty wyosobnione od chorego oraz od osoby z otoczenia chorego, jeden profil reprezentował 2 izolaty wyosobnione od tego samego pacjenta podczas choroby i po jej ustąpieniu. Wśród pozostałych 9 profili PFGE, 4 profile reprezentowały izolaty wyosobnione w podobnym przedziale czasowym do 3 miesięcy od ludzi zamieszkujących jeden region, dwa profile reprezentowały izolaty wyosobnione w przedziale czasowym do 3 miesiący od ludzi zamieszkujących różne regiony a trzy profile reprezentowały izolaty wyosobnione w przedziale czasowym większym niż 3 miesiące od ludzi zamieszkujących różne regiony. Przeprowadzone badania wykazały, że izolaty pałeczek C. jejuni i C. coli zaliczone do poszczególnych profili PFGE były także zaliczone do tych samych, bądź podobnych profili, w pozostałych zastosowanych metodach.

72 S. Wardak, M. Jagielski Nr 1 DYSKUSJA Do typowania pałeczek Campylobacter wykorzystywane są różne metody zarówno fenotypowe jak i genotypowe (16). Szczególnie użyteczne do wewnątrzgatunkowego typowania wielu gatunków bakterii okazały się, dynamicznie rozwijające się w ostatnich latach, metody biologii molekularnej. Jak dotąd opisano wiele różnorodnych technik genotypowania różniących się m. in. potencjałem różnicowania, powtarzalnością, czaso- i pracochłonnością, kosztami aparatury i odczynników oraz sposobem interpretacji wyników. Jak wynika z danych piśmiennictwa, w naszym kraju, do czasu rozpoczęcia obecnych badań, nie wykonywano typowania pałeczek Campylobacter izolowanych od ludzi przy użyciu takich metod jak MLST, PFGE, ERIC-PCR oraz PCR-flaA-RFLP. W pracy wykorzystano 155 izolatów pałeczek Campylobacter reidentyfikowanych lub wyhodowanych w NIZP-PZH, z czego 110 izolatów było wyhodowanych od 107 osób z kampylobakteriozą w roku 2006 stanowiąc prawie 70% wszystkich zgłoszonych przypadków kampylobakteriozy w tymże roku (10). Charakterystyka izolatów pałeczek C. jejuni i C. coli pochodzących z większości rejestrowanych w Polsce przypadków kampylobakteriozy pozwoliła na określenie ich stopnia zróżnicowania genotypowego. Trzy kolejno oceniane genotypowe metody tj. PFGE, PCR-flaA-RFLP i ERIC-PCR wykazały wysoki potencjał wewnątrzgatunkowego różnicowania badanych izolatów pałeczek C. jejuni i C. coli. Najniższy w tej grupie potencjał różnicowania wykazywała metoda PCR-flaA-RFLP, która oparta jest na analizie polimorfizmu genu flaa. Wartość indeksu różnicowania badanych pałeczek C. jejuni, metodą PFGE z wykorzystaniem procedury CAMPYNET, wyniosła 0,999 i była najwyższa spośród wartości indeksu różnicowania wszystkich użytych w prezentowanej pracy metod. W przypadku pałeczek C. jejuni wysokie zróżnicowanie stwierdzono zarówno wśród izolatów wyosobnionych w laboratorium mikrobiologicznym PSSE Bielsko-Biała, które stanowiły większość badanych w obecnej pracy izolatów (65%), jak również u izolatów wyosobnionych w laboratoriach mikrobiologicznych w innych regionach kraju. Badania innych autorów, uzyskane przy użyciu metody PFGE, także wskazują na wysokie zróżnicowanie genetyczne izolatów pałeczek C. jejuni izolowanych od ludzi oraz z innych źródeł (2, 6, 8). Inną zastosowaną w niniejszej pracy metodą była analiza restrykcyjna amplifikowanego fragmentu genu flaa o wielkości około 1,7 kpz (PCR-flaA-RFLP). Gen ten koduje białko FlaA - flagelinę, wchodzącą w skład rzęski tego drobnoustroju. Wielu autorów wskazuje, że najlepsze wyniki różnicowania pałeczek Campylobacter otrzymywane były z użyciem restryktazy DdeI (2, 11). Europejska sieć doskonałości Med-Vet-Net CAMPYNET zaproponowała, podobnie jak w przypadku metody PFGE, wystandaryzowaną procedurę wykonania PCR-flaA-RFLP przy użyciu restryktazy DdeI. Obliczona wartość indeksu różnicowania pałeczek C. jejuni przy użyciu metody PCR-flaA-RFLP wg procedury CAMPYNET była dość wysoka, wynosiła bowiem 0,912, była jednak niższa niż w przypadku różnicowania tego drobnoustroju metodą PFGE lub ERIC-PCR. Kolejną metodą użytą w badaniach do analizy polimorfizmu genetycznego pałeczek C. jejuni i C. coli było ERIC-PCR (Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus-PCR). Metoda ta jest stosowana do typowania nie tylko wielu drobnoustrojów takich jak np. pałeczki z rodzaju Enterobacteriaceae, ale także bakteriofagów czy grzybów (4). W piśmiennictwie jest stosunkowo niewiele prac poświęconych badaniom zróżnicowania pałeczek Campylobacter

Nr 1 Wewnątrzgatunkowe różnicowanie pałeczek Campylobacter 73 przy wykorzystaniu powyższej metody. W Polsce typowanie pałeczek C. jejuni izolowanych od drobiu z użyciem starterów ERIC przeprowadzili Wojciech i wsp. (18) oraz Wieczorek (17). Autorzy ci wskazują na wysokie zróżnicowanie genetyczne wśród badanych izolatów C. jejuni. W obecnych badaniach wartość indeksu różnicowania izolatów pałeczek C. jejuni metodą ERIC-PCR była bardzo wysoka i wyniosła 0,997, co klasyfikuje powyższą metodę na drugim miejscu pod względem przydatności do różnicowania izolatów C. jejuni zaraz po metodzie PFGE. Niewątpliwą zaletę metody ERIC-PCR stanowi niski koszt przygotowania próbek do badań. Jednakże metoda ta, jak twierdzi wielu autorów, jest wrażliwa na zmiany stężenia składników mieszaniny reakcyjnej. Z tego względu w trakcie badań wstępnych wypróbowano kilka stężeń jonów magnezu oraz polimerazy i wybrano takie, które poprawiły wydajność amplifikacji i ułatwiły analizę profili. W badaniach posłużono się także jedną serią mieszaniny składników (tzw. mastermix) niezbędnych do przeprowadzenia reakcji PCR. Ponadto w obecnej pracy do izolacji matrycowego DNA zastosowano metodę wykorzystującą lizę komórek bakteryjnych, które były zbierane z hodowli na stałym podłożu i zawieszane w roztworze PBS (gęstość zawiesiny 7 w skali McFarlanda). Liza komórek następowała a obecności detergentu (Triton-X100) i proteinazy K, bez etapów dalszego zagęszczania DNA. Takie postępowanie umożliwiło otrzymanie porównywalnych zawartości DNA w preparatach badanych izolatów, dzięki czemu uniknięto konieczności określania stężenia DNA metodą spektrofotometryczną, której stosowanie w przypadku niedostatecznie oczyszczonego preparatu może dawać błędne wyniki oznaczeń ilościowych. Analiza dendrogramu przedstawiająca zbiorczo wszystkie badane izolaty pałeczek Campylobacter wykazała, że wzory uzyskane metodą ERIC-PCR, tak jak to było w przypadku PFGE, pozwalają na różnicowanie tego drobnoustroju w obrębie gatunków: C. jejuni i C. coli. W wyniku przeprowadzonej analizy zaobserwowano także występowanie w większości wzorów charakterystycznego prążka o wielkości około 900 pz w przypadku pałeczek C. jejuni oraz około 500 pz i ponad 600 pz w przypadku pałeczek C. coli. Giesendorf i wsp. (3) wykorzystali różne warianty tzw. metody PCR - fingerprinting do opracowania techniki różnicowania pałeczek Campylobacter. Autorzy ci analizowali profile 33 izolatów C. jejuni, 30 izolatów C. coli oraz 8 izolatów C. lari otrzymane przy użyciu różnych konfiguracji starterów ERIC (startery ERIC1R i ERIC2), REP (startery REP1R i REP2), i AP (starter 1026). Zaobserwowali oni występowanie odcinków DNA charakterystycznych dla poszczególnych gatunków. Przy użyciu starterów ERIC 2 i 1026 stwierdzili, że wszystkie oceniane wzory badanych izolatów C. coli posiadały prążek odpowiadający wielkości około 700 pz, podczas gdy C. lari posiadał fragment wielkości około 1100 pz. Natomiast przy użyciu starterów REP autorzy otrzymali we wszystkich profilach badanych izolatów pałeczek C. jejuni fragment DNA o wielkości około 800 pz. Tak więc wyniki własnych badań jak i innych autorów wskazują, że metoda ERIC-PCR może posłużyć nie tylko do wewnątrzgatunkowego różnicowania tych pałeczek ale także do różnicowania poszczególnych gatunków w obrębie rodzaju Campylobacter. W przypadku pałeczek C. coli najlepsze rezultaty różnicowania uzyskano stosując metodę PFGE jak i ERIC-PCR, które to metody pozwoliły wyróżnić 15 różnych profili wśród 17 badanych izolatów. Może to świadczyć o wysokim zróżnicowaniu pałeczek C. coli. Należy jednak mieć na uwadze, że wniosek ten wyciągnięto na podstawie wyników badania stosunkowo niewielkiej liczby izolatów tego gatunku. W obecnej pracy wykonano również analizę powtarzalności zastosowanych metod dla szczepu C. jejuni PZH 93/06. Badania te pozwoliły na określenie poziomu identyczności

74 S. Wardak, M. Jagielski Nr 1 uzyskanych profili badanego szczepu w przypadku PFGE i PCR-flaA-RFLP na poziomie 100%, oraz 98,4% w przypadku ERIC-PCR co świadczy o pełnej powtarzalności przeprowadzonych badań. W wyniku określenia zróżnicowania genotypowego stwierdzono, że przy użyciu wszystkich omawianych metod izolaty pałeczek C. jejuni i C. coli pochodzące od osób z poszczególnych ognisk zostały zaliczone, do odpowiednich profili o nierozróżnialnych wzorach. Przeprowadzone badania wykazały, że izolaty pałeczek C. jejuni pochodzące od osób z trzech ognisk charakteryzowały się także takimi samymi w poszczególnych ogniskach, nie opisanymi do tej pory typami sekwencyjnymi MLST (ST 3847, 3848, 3849). Uzyskane typy sekwencyjne zaliczono do kompleksów klonalnych 21, 257 i 45, do których należą izolaty wyosobnione głównie w krajach Unii Europejskiej przeważnie od ludzi z kampylobakteriozą oraz od kur i z kurzego mięsa. W przypadku omawianych ognisk za podejrzany nośnik czynnika etiologicznego przyjmowano najczęściej mięso drobiowe (prawdopodobnie poddane nieodpowiedniej obróbce termicznej). Tak więc uzyskane w badaniach własnych wyniki wskazują, że izolaty pochodzące z ognisk mogą stanowić część kompleksów klonalnych zawierających izolaty prawdopodobnie w większym stopniu przystosowane do przeżycia w organizmie gospodarza, który stanowią kury będące najczęstszym źródłem zakażenia pałeczkami C. jejuni u ludzi. W celu uzyskania pełnej charakterystyki pokrewieństwa izolatów pałeczek C. jejuni wyosobnionych w kraju planowane są dalsze badania oparte na większej liczbie izolatów tego gatunku. Niewątpliwą zaletę metody MLST stanowi możliwość porównania profili allelicznych genów metabolizmu podstawowego badanych izolatów ze stale aktualizowaną bazą profili dostępną na stronach internetowych. Jednak zbyt wysoki koszt jednostkowy tej metody oraz znaczna pracochłonność stanowią obecnie ograniczenie w rutynowym jej stosowaniu. Szczególnie interesującym aspektem przydatności omawianych metod genotypowych do różnicowania drobnoustrojów, zwłaszcza gdy jest ono przeprowadzane na większej liczbie izolatów z danego terenu, jest możliwość zidentyfikowania potencjalnych ognisk epidemicznych z tzw. tła endemicznego. W przypadku pacjentów zamieszkujących ten sam region kraju od których wyosobniono w podobnym czasie izolaty pałeczek C. jejuni i C. coli o nierozróżnialnych profilach PFGE, można wnioskować, że osoby te mogły być narażone na ekspozycję na wspólne źródło zakażenia. Tak więc wyniki przeprowadzonych badań różnicowania połączone z analizą danych epidemiologicznych wskazują na możliwość istnienia kilku prawdopodobnych, niezarejestrowanych ognisk zbiorowego zakażenia pałeczkami Campylobacter. W niniejszej pracy stwierdzono także obecność kilku klonów, wyosobnionych od pacjentów zamieszkujących różne regiony kraju: w podobnym przedziale czasowym lub izolowanych w różnych okresach które prawdopodobnie mogą być częścią rozproszonego ogniska bądź stanowią stabilny w czasie klon (szczep) tego drobnoustroju. Możliwość występowania w środowisku stabilnych w czasie klonów Campylobacter sugerują także inni autorzy (2, 7, 9). Być może utrzymywanie się w środowisku takich szczepów jest w pewnych przypadkach dla tych bakterii lepszą strategią przetrwania. Jednakże jeżeli o rozprzestrzenieniu jakiegoś szczepu, o stabilnym genotypie, decydowałoby jego lepsze przystosowanie do różnorodnych warunków środowiska, to wyłania się pytanie, dlaczego takie szczepy nie rozprzestrzeniły się w stopniu znacznie wyższym niż wykryto to w obecnej i w cytowanych powyżej pracach. W obecnej pracy interesująca okazała się również analiza wyników PFGE i innych metod typowania pałeczek C. jejuni wyosobnionych od ludzi z wie-

Nr 1 Wewnątrzgatunkowe różnicowanie pałeczek Campylobacter 75 lokrotnymi, objawowymi zakażeniami pałeczkami Campylobacter. Wyniki genotypowania izolatów, które wywołały zakażenia u tych pacjentów wskazują, że poszczególne izolaty wyosobnione od każdego chorgo nie są ze sobą spokrewnione. Tak więc kolejne zachorowanie u danej osoby było wywoływane przez inny szczep. Może to świadczyć o braku nabywania odporności na zakażenia pałeczkami Campylobacter u ludzi po przebytej kampylobakteriozie wywołanej przez szczepy o innych właściwościach fenotypowych i genotypowych. W świetle tej tezy interesujące są badania Black i wsp. (1), którzy stwierdzili, że powtórne zakażenie człowieka tym samym szczepem pałeczek Campylobacter, może wywołać pamięć immunologiczną i odporność gospodarza na kolejne zakażenie tym szczepem. Podsumowując, uzyskane w obecnej pracy wyniki pozwalają stwierdzić, że ocena genetycznego zróżnicowania pałeczek Campylobacter metodą PFGE i ERIC-PCR oraz PCR-flaA-RFLP może dostarczyć informacji przydatnych w analizie sytuacji epidemiologicznej kampylobakteriozy. Metody te w trakcie obecnych badań z powodzeniem wykorzystano do analizy pokrewieństwa izolatów wyosobnionych od pacjentów w pierwszym zarejestrowanym w Polsce ognisku zakażenia pokarmowego spowodowanego zakażeniem pałeczkami C. coli (15). W obecnych badaniach największą zaletą metody ERIC-PCR oraz PCR-flaA-RFLP w porównaniu z metodą PFGE była łatwość wykonania badania oraz szybkość uzyskania wyników, co jest niezmiernie ważne w przypadkach gdy istnieje pilna potrzeba udzielenia odpowiedzi o ewentualnym pokrewieństwie izolatów. W przypadku ERIC-PCR oraz RFLP-flaA-RFLP wynik był uzyskiwany po około 10 godzinach, natomiast wynik typowania z zastosowaniem PFGE dopiero po 3 dniach. Jednakże to metoda PFGE charakteryzowała się największym potencjałem dyskryminacyjnym dla badanych bakterii. Przy użyciu metody ERIC-PCR, jak twierdzi wielu autorów, należy się liczyć z możliwością wystąpienia nieswoistych reakcji wynikających z wrażliwości tej metody na stężenie jonów magnezu, dezoksynukleotydów czy polimerazy. Z tego względu wydaje się właściwe przygotowanie bezpośrednio przed użyciem dużej serii mastermixu, która zapewni wykonanie całości zaplanowanych badań. W przypadku metody PCR-flaA-RFLP w porównaniu z dwiema wyżej wspomnianymi metodami zaobserwowano niższą wartość indeksu różnicowania wynoszącą 0,912 wobec 0,999 dla metody PFGE i 0,997 dla metody ERIC-PCR. Jednakże metoda ta jest szybka i łatwa w wykonaniu oraz mniej kosztowna w porównaniu z PFGE. Z tego względu w dochodzeniu epidemiologicznym dla szybkiego określenia stopnia pokrewieństwa badanych izolatów pałeczek Campylobacter wskazane jest ich badanie w pierwszej kolejności metodą ERIC-PCR i PCR-flaA-RFLP. Metody te są możliwe do wdrożenia nawet w terenowych laboratoriach wyposażonych w aparaturę do PCR i do elektroforezy. Natomiast w następnym etapie, szczególnie dla nierozróżnialnych izolatów, powinno zostać wykonywane badanie metodą PFGE. Lepsze poznanie metod służących typowaniu tych drobnoustrojów pozwoli na szybką reakcję odpowiednich służb w przypadku wystąpienia większej epidemii zakażenia pałeczkami Campylobacter, co może znacznie poprawić działanie nadzoru epidemiologicznego, a przez to ograniczyć ewentualne zagrożenia dla zdrowia publicznego w naszym kraju.

76 S. Wardak, M. Jagielski Nr 1 S. Wardak, M. Jagielski EVALUATION OF GENOTYPIC AND PHENOTYPIC METHODS FOR THE DIFFERENTIATION OF CAMPYLOBACTER JEJUNI AND CAMPYLOBACTER COLI CLINICAL ISOLATES FROM POLAND. II. PFGE, ERIC-PCR, PCR-FLAA-RFLP AND MLST SUMMARY Campylobacter jejuni and Campylobacter coli are leading cause of bacterial gastroenteritis in many developed countries. We compared pulsed-field gel electrophoresis (PFGE), enterobacterial repetitive intergenic consensus (ERIC-PCR) and restriction fragment length polymorphisms of the flagellin gene (PCR-flaA-RFLP) for distinguishing 128 C. jejuni isolates and 17 C. coli clinical isolates isolated between 2006 and 2007 in Poland. We also analysed seven isolates from three C. jejuni family outbreaks and three isolates from one C. coli family outbreak. These isolates were also analysed by multilocus sequence typing (MLST). PFGE and PCR-flaA-RFLP were performed as described by CAMPYNET. The methods were evaluated and compared on the basis of their abilities to identify outbreaks isolates and discriminate between unrelated isolates (with D index). PFGE was found to be the most discriminatory method (D=0,999), followed by ERIC-PCR (D=0,997) and PCR-flaA-RFLP (D=0,912). PFGE and ERIC-PCR clearly divided C. jejuni and C. coli into two clusters. PFGE, ERIC-PCR and PCR-flaA-RFLP distinguished 117, 107 and 18 distinct profiles, respectively, among 128 C. jejuni isolates. Among 17 C. coli isolates, 15 PFGE and ERIC-PCR, and 7 PCR-flaA-RFLP profiles were found. All the methods identified the outbreaks strains. MLST analysis showed that C. jejuni isolates obtained from three outbreaks belonged to three new 3847, 3848 and 3849 STs. We found isolates with the indistinguishable patterns in each method which were obtained from humans from the same region and related in time that potentially represent common-source outbreaks. We also found isolates with the indistinguishable patterns in each method that were obtained from humans from different part of Poland. This is the first report of using MLST, ERIC-PCR and PCR-flaA-RFLP methods to distinguish C. jejuni and C. coli clinical isolates in Poland. Our results demonstrate that all typing methods evaluated in this study are highly discriminatory and useful to investigate Campylobacter outbreaks in Poland. Our results also show that the genetic diversity of polish C. jejuni and C. coli isolates is very high. PIŚMIENNICTWO 1. Black RE, Levine MM, Clements ML i inni. Experimental Campylobacter jejuni infection in humans. J Infect Dis 1988;157:472-9. 2. Fitzgerald C, Stanley K, Andrew S i inni. Use of pulsed-field gel electrophoresis and flagellin gene typing in identifying clonal groups of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli in farm and clinical environments. Appl Environ Microbiol 2001;67:1429-36. 3. Giesendorf BA, van Belcum A, Koeken A i inni. Development of species-specific DNA probes for Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, and Campylobacter lari by polymerase chain reaction fingerprinting. J Clin Microbiol 1993;31:1541-6. 4. Gillings M, Holley M. Repetitive element PCR fingerprinting (rep-pcr) using enterobacterial repetitive intergenic consensus (ERIC) primers is not necessarily directed at ERIC elements. Lett Appl Microbiol 1997;25:17-21. 5. Hunter PR, Gaston MA. Numerical index of the Discriminatory ability of typing systems: an application of Simpson s index of diversity. J Clin Microbiol 1988;26:2465-6.

Nr 1 Wewnątrzgatunkowe różnicowanie pałeczek Campylobacter 77 6. Lindmark H, Harbom B, Thebo L I inni. Genetic characterization and antibiotic resistance of Campylobacter jejuni isolated from meats, water, and humans in Sweden. J Clin Microbiol 2004 Feb;42:700-6. 7. Manning G, Duim B, Wasenaar T i inni. Evidence for a genetically stable strain of Campylobacter jejuni. Appl Environ Microbiol 2001;67:1185-9. 8. Nielsen EM, Engberg J, Fussing V i inni. Evaluation of phenotypic and genotypic methods for subtyping Campylobacter jejuni isolates from humans, poultry, and cattle. J Clin Microbiol 2000;38:3800-10. 9. Owen RJ, Sutherland K, Fitzgerald C i inni. Molecular subtyping scheme for serotypes HS1 and HS4 of Campylobacter jejuni. J Clin Microbiol 1995;33:872-7. 10. Sadkowska-Todys M, Wardak S. Kampylobakterioza w 2006 roku. Przegl Epidemiol 2008;62:295-9. 11. Santesteban E, Gibson J, Owen RJ. Flagellin gene profiling of Campylobacter jejuni heat-stable serotype 1 and 4 complex. Res Microbiol 1996;147:641-9. 12. Steinbrueckner B, Ruberg F, Kist M. Bacterial genetic fingerprint: a reliable factor in the study of the epidemiology of human campylobacter enteritis? J Clin Microbiol 2001;39:4155-9. 13. Versalovic J, Koeuth T, Lupski JR. Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes. Nucleic Acids Res 1991;19:6823-31. 14. Wardak S, Jagielski M. Ocena przydatności wybranych metod genotypowych i fenotypowych do wewnątrzgatunkowego różnicowania pałeczek Campylobacter jejuni oraz Campylobacter coli izolowanych od ludzi. I. Przydatność biotypowania, określania profilu lekooporności i profilu plazmidowego oraz plazmidowego wzoru restrykcyjnego. Med Dośw Mikrobiol 2009;61: 47-61. 15. Wardak S, Szych J, Sadkowska-Todys M. The first report on Campylobacter coli family outbreak detected in Poland in 2006. Euro Surveill 2008;13;1-3. 16. Wassenaar TM, Newell DG. Genotyping of Campylobacter spp. Appl Environ Microbiol 2000;66:1-9. 17. Wieczorek K. Identyfikacja i różnicowanie termotolerancyjnych izolatów Campylobacter w oparciu o wybrane metody biologii molekularnej (rozprawa doktorska), kierownik projektu prof. dr hab. Jacek Osek, Państwowy Instytut Weterynaryjny - Państwowy Instytut Badawczy, 2007. 18. Wojciech L, Bednarski M, Wieliczko A i inni. Genotype analysis of Campylobacter jejuni isolated from broilers in Poland. Pol J Vet Sci 2005;8:41-7. Otrzymano: 10 II 2009 Adres Autora: 00-791 Warszawa, ul. Chocimska 24, Zakład Bakteriologii NIZP-PZH e-mail:swardak@pzh.gov.pl