ARTYKUŁY. Rola struktury mrna w inicjacji translacji u eukariontów. Role of the mrna structure in translation initiation in Eucaryotes

ARTYKUŁY Rola struktury mrna w inicjacji translacji u eukariontów Role of the mrna structure in translation initiation in Eucaryotes MAJA HEMMINGS-MIESZCZAK Spis treści I. Ogólne wprowadzenie do problematyki translacji II. Elementy regulatorowe w mrna III. Helikazy w inicjacji translacji IV. Mechanizmy wyboru kodonu inicjacyjnego V. Główne mechanizmy inicjacji VI. Alternatywne mechanizmy inicjacji VII. Podsumowanie Contents I. Introduction to translation II. Regulatory elements in the mrna III. Helicases in translation initiation IV. Strategies for the initiation codon selection V. Main mechanisms of initiation VI. Alternative mechanisms of initiation VII.Concluding remarks Wykaz stosowanych skrótów: AUG, kodon inicjujący biosyntezę białka; CaMV, wirus mozaiki kalafiora (ang. cauliflower mosaic virus)', IRES, miejsce wewnętrznej inicjacji translacji (ang. internal ribosom e entry site)', Met-tRNAi, metionylo-trna (inicjatorowy trna); mrna, informacyjny RNA (ang. messenger RNA); nt, nukleotyd; ORF, otwarta ramka odczytu (ang. open reading frame)', pre-mrna, prekursorowy mrna; Pu, puryna; Py, pirymidyna; RNA, kwas rybonukleinowy; RRM, białkowa domena oddziałująca z RNA (ang. RNA recognition motive)', rrna, rybosomałny RNA; TOP; sekwencja polipirymidynowa (ang. term inal oligopyrim idine); trna, transferowy RNA (ang. transfer RNA); uorf, krótka ORF, znajdująca się powyżej funkcjonalnego miejsca inicjacji translacji (ang. upstream ORF); 5 - i 3 -UTR, niekodujące końce mrna (ang. untranslated regions). Post-transkrypcyjna regulacja ekspresji genów u eukariontów może zachodzić na każdym z trzech etapów procesu biosyntezy białka, ale najczęściej zachodzi na etapie inicjacji. W czasie inicjacji translacji rybosom przyłącza się do mrna i dokonuje w y boru kodonu inicjacyjnego, w procesie pozostaj ącym pod kontrolą białkow ych czynników inicj a- Dr, Novartis Pharma AG, 4002 Basel, Szwajcaria; e-mail: maria.hemmings@pharma.novartis.com cyjnych i elementów regulatorowych samego mrna. Spośród elementów budowy transkryptu, obecność czapeczki, długość i struktura drugo- i trzeciorzędowa lidera, oraz pozycja i kontekst kodonu inicjacyjnego odgrywają kluczową rolę w translacji. Przedstawione tutaj główne i alternatywne m echanizmy inicjacji translacji omówiono z uwzględnieniem interesujących cech niektórych liderów mrna, podkreślając szczególną rolę struktury mrna w inicjacji translacji i jej regulacji. I. Ogólne wprowadzenie do problematyki translacji Informacyjny RNA (ang. messenger RNA, mrna) pow staje w procesie transkrypcji, syntetyzowany przez kompleks jądrowej RNA polimerazy II (poi II; [1]). W jądrze komórkowym tzw. pierwotny transkrypt lub pre-m RNA ulega m odyfikacji, polegającej na dołączeniu 5 -końcowej struktury nazywanej czapeczką (ang. m7g cap', [2]), i obróbce obejmującej proces usuw ania intronów (ang. splicing', [3]) i 3 -końcowej poliadenylacji [4]. Jądrowy pre-m RNA występuje w kom pleksach z rozmaitymi 118 POSTĘPY BIOCHEMII 47(2), 2001

białkami o charakterze zasadowym (ang. hnrnp complexes', [5,6]) i przy ich aktywnym udziale, już po zakończeniu obróbki, jako dojrzały mrna, ulega eksportowi do cytoplazm y [7]. W cytoplazm ie zachodzi proces biosyntezy białka, polegający na przepisaniu informacji genetycznej, zawartej w mrna, na sekwencję aminokwasów (ang. translation', [8]). Proces translacji zachodzi w trzech etapach, w yróżnianych jako inicjacja, elongacja i term inacja. Przygotowawcza faza inicjacji translacji składa się z szeregu reakcji, zachodzących w kontakcie z 5 -końcową, niekodujacą sekwencją mrna, przy udziale licznych białkowych czynników inicjacyjnych (ang. eukaryotic initiation factors, elf). Podczas inicjacji aparat translacyjny dokonuje wyboru substratowego mrna i form uje kom pleks inicjacyjny. Inicjacja translacji ([8]; Rye. 1) rozpoczyna się dysocjacją 80S rybosom u, z jednoczesnym przyłączeniem czynników blokujących przedw czesną asocjację rozdzielonych podjednostek: czynnik eif6 oddziałuje z podjednostką rybosomu 60S, a elf l A i eif3 z 40S (etap 1A). Uwolniona mała podjednostka rybosomu łączy się z eif2-gtp-mettrnai (ang. ternary complex) tworząc kompleks 43S (etap IB), gotowy do oddziaływ ania z odpowiednio przygotow anym mrna. W pierw szym etapie inicjacji, struktura 5'-cap cząsteczki mrna przyłącza czynnik eif4b i kompleks eif4f, które pełniąc funkcję helikazy, rozplatają drugorzędową strukturę mrna (etap 1) i werbują pre-inicjacyjny kompleks 43S (etap 2). W trzecim etapie inicjacji kompleks związany przez mrna przesuwa się liniowo w kierunku 3 -końca, w poszukiwaniu odpowiedniego kodonu inicjacyjnego, będącego najczęściej tripletem AUG. Proces ten najlepiej odzwierciedla scanning m odel [9], zgodnie z którym kom pleks Asocjacja 43S-mRNA Scanning uw olnienie faktorów eif5 ~ " \ Asocjacja rybosomu Ryc. i. Mechanizm inicjacji translacji u eukariontów (zamerrick i Hershey, 1996). Objaśnienia zamieszczono w tekście. POSTĘPY BIOCHEMII 47(2), 2001 119

43S wybiera kodon inicjacyjny położony najbliżej 5 -końca mrna. Zazwyczaj występuje on w w obrębie sekwencji GCCPuCCAUGG [10]. Stabilizacja rybosomu z mrna i utworzenie kompleksu 48S zachodzi za pomocą klasycznego parowania zasad (ang. Watson-Crick basepairing) pomiędzy kodonem AUG i antykodonem z inicjatorowego M et-trnai (etap 3). N astępnie, przyłączenie czynnika eif5 i hydroliza GTP pow odują dysocjację czynników inicjacyjnych, umożliwiając przyłączenie podjednostki 60S rybosomu (etap 4). Uformowanie dojrzałego kompleksu inicjacyjnego, zawierającego 80S rybosom w miejscu kodonu inicjacyjnego na mrna, zamyka etap inicjacji procesu biosyntezy białka. Następne etapy biosyntezy białka, elongacja i terminacja, zachodzą przy aktywnym udziale dynamicznej maszyny molekularnej, za jaką obecnie uważa się rybosom [11], i w efekcie wymagają mniejszej, w porównaniu z inicjacją, liczby czynników translacyjnych. Elongacja polega na przyłączaniu reszt aminokwasowych do C-końca syntetyzowanego peptydu. Proces ten zachodzi w czterech, cyklicznie powtarzających się reakcjach, obejmujących: 1) przyłączenie am inoacylo-trna katalizowane przez eefl A w kompleksie z GTP; 2) hydrolizę GTP, połączoną z wymianą nukleotydu na eefla, katalizowaną przez eeflb ; 3) translokację peptydu i syntezę w iązania peptydow ego katalizowane prawdopodobnie przez rrna dużej podjednostki rybosomu; 4) translokację mrna i peptydylo-trna katalizowane przez eef2 w kompleksie z GTP. Ostatnie intensywne badania krystalograficzne struktury rybosomu [12] pozw oliły precyzyjnie zlokalizować przewidywane wcześniej, rotacyjnie wypełniane miejsca wiążące trna: A dla aminoacylo-trna, P dla peptydylo-trna i E dla wolnego trna, zanim zostanie usunięty z rybosomu. Położone są one blisko siebie, w zagłębieniu pomiędzy dwiema podjednostkam i rybosom u. O statni etap translacji, term inacja zachodzi na skutek pojawienia się kodonu stop w miejscu A rybosomu. Wszystkie trzy kodony terminacyjne wiążą, ostatnio skrystalizowany, czynnik białkowy erfl [13], który w obecności erf3 stymuluje hydrolizę peptydylo-trna. W efekcie, następuje dysocjacja rybosomu, tak że uwolnione podjednostki mogą podjąć nową rundę procesu biosyntezy białka. Jednym ze sposobów regulacji ekspresji genów, którym często posługują się organizmy eukariotyczne, jest kontrola na poziomie translacji. Jej zalety to szybkość, skuteczność, a także niezależność od procesu transkrypcji. Post-transkrypcyjna regulacja może zachodzić na każdym z trzech etapów procesu translacji. Najczęściej jednak, regulacja zachodzi podczas inicjacji, sterowana przez elementy regulatorowe w samym mrna i białkowe czynniki inicjacyjne [14]. II. Elementy regulatorowe w mrna Typowy eukariotyczny mrna jest monocistronowy [15] tzn. zawiera tylko jedną otwartą ramkę odczytu (ang. open reading fram e, ORF) kodującą białko. Dodatkowe, niekodujące sekwencje, znajdujące się na końcach mrna (ang. untranslated regions, UTR), zaw ierają liczne elem enty regulatorowe, wpływające na wydajność translacji (Ryc. 2A). Sekwencje liderowe w mrna, poprzedzające główną otwartą ramkę odczytu, wywierają dom inującą rolę w ca-regulacji translacji. II-l. 5 -UTR (ang. mrna leader) Długość większości liderów mrna waha się w granicach od 20 do 80 nt. Wymagana minimalna długość odpowiada w przybliżeniu średnicy eukariotycznego rybosom u, wynoszącej około 30 nt. D łuższe sekwencje mogą stymulować, krótsze natomiast ham ują translację, praw dopodobnie uniem ożliwiając wiązanie kolejnego rybosom u [16]. Czapeczka występuje na 5 -końcu wszystkich mrna z wyjątkiem niektórych transkryptów w irusowych. Post-transkrypcyjnie dołączona m odyfikacja cup 0 zawiera m 7G(5 )ppp(5 )N (N odpowiada dowolnemu nukleotydowi), a cup 1 dodatkową metylację w miejscu (2 )OH N-rybozy. Czapeczka zabezpiecza mrna przed degradacją, a także ułatwia alternatywne składanie [17], transport do cytoplazmy i translację [18]. Pozbawione czapeczki transkrypty charakteryzuje niska wydajność translacji, jednakże, długie sekwencje 5 -UTR m ogą zredukować wpływ czapeczki na translację [19]. Niekodujące sekwencje, specyficznie oddziałujące z białkami, mogą wywierać negatywny wpływ na translację. Utworzenie stabilnego kom pleksu z białkiem, w pobliżu 5 -końca mrna stwarza przeszkodę przestrzenną (ang. steric hindrance), która uniem ożliw ia przyłączenie się rybosom u i blokuje inicjację. Tego typu represję stwierdzono w przypadku mrna kodującego ferrytynę (białko biorące udział w przechowywaniu jonów żelaza; [20]). Niedobór żelaza powoduje, że ferrytyna przyłącza się do 5 -końca mrna, blokując własną syntezę. Inny, mniej poznany, ale interesujący przykład stanow ią transkrypty zawierające 5-koń- 120 POSTĘPY BIOCHEMII 47(2), 2001

cow ą sekwencję polipirym idynow ą (ang. 5 -term i nal ołigopyrimidine; 5 TOP), występujące w mrna kodujących czynnik elf la i białka strukturalne rybosom u [21]. W obu podanych przykładach, regulacja translacji zachodzi przez zmianę warunków metabolicznych: zw iększenie stężenia jonów żelaza [22] i odpowiednio, fosforylację białka rybosomalnego S6 [23]. AUG-kontekst, uaug, uorf. A naliza porów naw cza sekwencji eukariotycznych mrna wykazała nieprzypadkow ość sekwencji otaczającej kodon inicjacyjny [24]. Zgodność z ustalonym consensusem PuCCAUGG zapewnia wysoką wydajność translacji [10]. Przeciwny efekt w yw iera obecność dodatkowych kodonów inicjacyjnych, poprzedzających główną sekwencję kodującą (ang. upstream AUG, uaug). Zlokalizow ane w pobliżu 5 -końca, pońca mrna [27], Ogólnie, kom pleks inicjacyjny w y daje się być bardziej wrażliwy na inhibicję w obecności spinki w liderze, niż rybosom kontynuujący translację, jeśli podobna spinka występuje w obrębie sekwencji kodującej. W ystępująca za kodonem inicjacyjnym struktura drugorzędowa może nawet spowodować wzrost wydajności translacji. Przypuszcza się, że w tym przypadku spowolnienie funkcjonalnego rybosomu może wydłużyć czas oddziaływania z kodonem inicjacyjnym, ułatwiając jego rozpoznanie, zw łaszcza gdy występuje on w suboptym alnym kontekście [28]. II-2. 3 -UTR (ang. mrna trailer) Długość. Większość eukariotycznych mrna, z wyjątkiem transkryptów histonow ych i niektórych A cap T O P E R 2D u O R F sekwencja kodująca E R poliadenylacja B Ryc. 2. Regulacja translacji. A: Elementy regulatorowe w mrna. RNA (czerwona linia) zawiera niekodujące sekwencje regulatorowe (5 - i 3 -UTR) otaczające sekwencję kodującą (ORF). Zielone ramki oznaczają krótką i główną ORF, niebieskie ramki przedstawiają ogólnie elementy regulatorowe (ER), które mogą oddziaływać z białkami (niebieskie owale). Na zielono zaznaczono sekwencje regulatorowe: m7g (czapeczka), Py (sekwencja polipirymidynową, TOP), AAUAAA (sygnał poliadenylacji), (A)n (sekwencja poliadenylowa). Czerwona struktura w obrębie 5 -UTR reprezentuje strukturę drugorzędową (2D). B: Oddziaływanie między 5 - i 3 -UTR w mrna stymuluje inicjację. Owale reprezentują oznaczone białka, których wzajemne oddziaływanie umożliwia zbliżenie obu końców mrna. wstające wówczas krótkie otwarte ramki odczytu (ang. upstream ORF, uorf) zapobiegają translacji, poprzez współzawodnictwo o czynniki translacyjne i kompleks inicjacyjny, z dalej położoną właściwą sekw encją kodującą [25]. Struktura drugorzędowa typu spinki (ang. hairpin), umiejscowiona pomiędzy czapeczką i kodonem inicjacyjnym, może zaham ować translację [26], W y dajność represji zależ}' od term odynam icznej stabilności spinki i jej lokalizacji w odniesieniu do 5 -kow irusow ych zawiera 3 -końcowe niekodujące sekwencje o długości od 50 do 200 nt. Uniwersalna sekwencja AAUAAA determinuje m iejsce cięcia i poliadenylacji, następujące w odległości ok. 30 nt w kierunku 3 -końca pierwotnego transkryptu. W konsekwencji, typowy eukariotyczny mrna zawiera dodatkowo 3 -końcow ą 200 nt sekwencję poliadenylową (ang. poly(a) taił), która w kompleksie z PABP (ang. poly(a ) binding protein) zabezpiecza mrna przed degradacją i wspom aga POSTĘPY BIOCHEMII 47(2), 2001 121

translację. Ostatni efekt wyjaśnia model pętli mrna (ang. closed-loop model, [29]; Ryc. 2B). W edług tego modelu, jeden z czynników inicjacyjnych translacji, eif4g u drożdży i roślin lub jego homolog PAIP-1 u ssaków, występuje w roli łącznika pomiędzy, odpowiednio, PABP i eif4e lub PABP i eif4a [30], zbliżając obydwa końce mrna. Podobny model obowiązuje w przypadku mrna pozbawionych czapeczki, zakładając jednoczesne oddziaływanie eif4g z PABP i mrna [31]. Oddziaływanie fizyczne i funkcjonalne 3 - i 5 -UTR w pętli mrna, synergistycznie stym uluje proces biosyntezy białka, praw dopodobnie angażując rybosomy po zakończeniu pierwszej rundy do wznowienia inicjacji translacji. Specyficzne elementy regulatorowe, wpływające na metabolizm danego transkryptu, w ystępują powszechnie w obrębie 3 -UTR, pełniąc nie całkowicie jeszcze scharakteryzowaną rolę w stabilizacji mrna i translacji [32], N ależą do nich, przykładowo, struktury trzeciorzędow e w RNA wirusa m ozaiki tytoniu (ang. pseudoknot), pirym idynow e sekwencje mrna lipoksygenazy, AU-bogate elementy ARE destabilizujące mrna niektórych onkogenów, struktury drugorzędowe zastępujące poliadenylację w mrna histonów, oddziałujące z białkam i sekwencje maskujące elementy rozpoznawane przez nukleazy, oraz sekwencje odpowiedzialne za włączanie selenocysteiny w miejsce poprzedzającego kodonu terminacyjnego. Obserwowana różnorodność 3 -końcowych elem entów regulatorowych, wynika praw dopodobnie z mniejszej presji ewolucyjnej niż ta, której poddane są ważne w inicjacji translacji, bardziej uniwersalne sekwencje liderowe. III. Helikazy w inicjacji translacji Stosunkowo dawno stwierdzono, że jednym z czynników ograniczających wydajność translacji jest obecność struktury drugorzędowej typu spinka w liderze mrna [26]. W prawdzie większość mrna zawiera krótkie sekwencje liderowe, gdzie m ożliwość uform owania lokalnej stabilnej struktury w y daje się ograniczona, praktycznie jednak nie daje się przewidzieć wzajem nego wpływu odległych sekwencji i wykluczyć potencjalnego oddziaływania między np. regionami lidera i ORF. Udział helikaz w przygotowaniu jednoniciowego miejsca wiązania rybosomu na 5 -końcu mrna jest zatem logicznie uzasadniony. W rzeczyw istości, wspom niany pow y żej kompleks eif4f, który jako pierwszy przyłącza się do 5 -końcowej struktury czapeczki, fizjologicznie pełni rolę helikazy mrna. Czynnik inicjacyjny eif4f składa się z trzech pełniących różne funkcje podjednostek eif4a, 4E i 4G o zróżnicowanej wielkości, liczącej odpowiednio: 46, 24 i 170 kda. Pierwsze z wymienionych, niezbędne w życiu komórki białko eif4a ma własności RNA-zależnej ATP-azy i jednocześnie rozplatającej dwuniciowe RNA helikazy [33]. N ależy ono do rozległej grupy białek, której cechą wyróżniającą jest obecność motywu DEAD lub DEAFI [34]. Białka te ogólnie biorą udział w metabolizmie mrna, w szczególności w procesach alternatyw nego składania, translacji, syntezy rybosomu i rozwoju organizmu. Istnieją trzy formy eif4a u ssaków (eif4ai do eif4aiii), funkcjonalnie tylko częściowo równorzędne, w ykazujące tkankow ą specyficzność ekspresji. Inny z towarzyszących kom ponentów, ewolucyjnie zakonserwowany czynnik eif4e, przyłącza się bezpośrednio do struktury czapeczki. Jego roślinny wariant eifiso4e i nigdzie poza tym niewystępujący eif4e, przyłączają się odpowiednio do eifiso4g i eif4g, w różniących się konformacyjnie, ale nie funkcjonalnie, kompleksach eifiso4f i 4F [35]. Badania struktury eif4e, oparte na NMR i krystalografii, uwidoczniły centrum aktywne jako domenę obejm ującą czapeczkę w obustronnym zacisku, pomiędzy dwiema resztami aromatycznymi tryptofanu [36, 37]. Wydajność wiązania czapeczki przez samo eif4e jest dość słaba, ale ulega wzmocnieniu w kontekście mrna i w obecności eif4g [38]. Największy komponent eif4g oddziałuje nie tylko z dwoma pozostałymi składnikami kompleksu 4F, ale dodatkowo z eif3 i PABP, a także dzięki obecności domeny RRM (ang. RNA recognition motive), bezpośrednio i niespecyficznie wiąże się z mrna. Złożona budowa eif4g zapew nia jednoczesne oddziaływanie kom pleksu eif4f ze strukturą cap (poprzez 4E) i eif3, pośrednio wiążąc mrna i rybosom (porównaj Ryc. 1). Różnorodne, sklonowane formy eif4g wykazują podobne własności biochemiczne [39, 40]. Uformowanie kom pleksu eif4f poprzedza oddziaływanie z czapeczką i mrna [8]. Rola eif4f polega na doprowadzeniu helikazy eif4a do 5 -końca mrna, poprzez wykorzystanie powinowactwa białka eif4e do struktury czapeczki. Odpowiednio umiejscowiona helikaza rozplata strukturę mrna, przygotowując miejsce wiązania rybosomu. Sama helikaza eif4a wykazuje tylko um iarkow aną aktyw ność, która w kontekście kompleksu eif4f ulega 20-krotnej stym ulacji, przez niezależne białko eif4b [41]. Co więcej, dzięki silnemu niespecyficznemu powinowactwu do RNA, eif4b oddziałuje zarówno z mrna, rrna i trna, wspom aga parowanie zasad 122 POSTĘPY BIOCHEMII 47(2), 2001

i być może w spółdziałanie w kom pleksie inicjacyjnym pom iędzy mrna, rybosom em i M et-trnai [42]. IV. Mechanizmy wyboru kodonu inicjacyjnego Po przyłączeniu do mrna, kompleks preinicjacyjny 43S, zaw ierający m ałą podjednostkę ryboso- V. Główne mechanizmy inicjacji Scanning. Absolutna większość eukariotycznych mrna zaw iera wolny 5 -koniec i czapeczkę rozpoznaw aną przez aparat translacyjny w procesie inicjacji, opisanym jako scanning [9]. Zgodnie z tym modelem, m ała podjednostka rybosom alna w kom pleksie 43 S przyłącza się w pobliżu 5-końca mrna i migruje w kierunku 3, w poszukiwaniu kodonu inicja- Ryc. 3. Główne mechanizmy wyboru kodonu inicjacyjnego. Czerwona linia reprezentuje mrna zawierający ORF (białe ramki), czapeczkę (czerwony owal), strukturę spinki lub IRES. Przerywana linia oznacza kowalencyjnie połączone końce mrna. Zielone owale przedstawiają małą (40S) i dużą podjednostkę rybosomalną. Czarne strzałki pokazują drogę małej podjednostki. Opisy przedstawionych modeli inicjacji translacji objaśniono w tekście. mu oraz liczne czynniki inicjacyjne, m igruje w poszukiwaniu właściwego kodonu inicjacyjnego. W iadomo, że tylko niektóre z obecnych w mrna tripletów AUG biorą udział w inicjacji translacji. O funkcji kodonu AUG decyduje jego lokalizacja w mrna, otaczający kontekst, a także struktura lidera mrna. W yróżnia się dwa główne m echanizm y doprow a dzające kompleks preinicjacyjny 43 S do właściwego kodonu inicjacyjnego: zależny od 5 -końcowej m o dyfikacji scanning i niezależną od 5 -końca w ew nętrzną inicjację. Istniejące dodatkow e w arianty m e chanizm u typu scanning uw zględniają specjalne w y mogi niektórych liderów mrna i obejm ują niedokładny scanning (ang. leaky scanning), w znow ienie inicjacji (ang. reinitiation), oraz nieliniow ą m i grację rybosom u (ang. nonlinear ribosom e m igration, discontinuous scanning lub shunting). Poniżej przedstawiono charakterystykę głównych (Ryc. 3) i alternatywnych (Ryc. 4) mechanizmów inicjacji translacji, uwzględniając wpływ struktury drugo- i trzeciorzędowej lidera mrna na m igrację i funkcję rybosomu. cyjnego (Ryc. 3A). Sposób migracji kompleksu jest w zasadzie nieznany. Nie wiadomo czy rybosom przesuwa się aktywnie, czerpiąc energię z hydrolizy ATP, czy migracja odbywa się np. na drodze dyfuzji. Zazwyczaj pierw szy napotkany kodon AUG, w ystępujący w w iększości naturalnych mrna w optym alnym kontekście GCCPuCCĄUGG, staje się m iejscem inicjacji translacji (ang. the fir s t- AUG rule', [10]). Przypuszcza się, że optym alny kontekst pow o duje spowolnienie migracji kompleksu, i tym samym ułatwia rozpoznanie kodonu AUG przez antykodon Met-tRNAi. Ważną rolę pełnią również, ostatnio scharakteryzowane, czynniki białkowe elf l i elf l A, które wspomagają scanning i trwałe osadzenie kompleksu w m iejscu właściwego kodonu inicjacyjnego [43]. Mimo obecności helikaz i innych czynników w spom agających, scanning wykazuje dużą w rażliwość na obecność motywów strukturalnych w liderze mrna. Wydajność represji zależy od stabilności term odynam icznej m otywu strukturalnego i położenia w odniesieniu od 5 -końca mrna [27]. POSTĘPY BIOCHEMII 47(2), 2001 123

Przykładowo, spinka o energii (-)30 kcal/m ol, zapobiega przyłączeniu kompleksu 43 S gdy usytuowana jest blisko czapeczki, ale nie ma znaczenia w odległości 52 nt od 5 -końca mrna. Bez względu na położenie, spinki o stabilności równej lub większej niż (-) 50 kcal/mol, a także struktura trzeciorzędowa typu węzeł (ang. pseudoknot), blokują całkowicie scanning, powodując nagromadzenie podjednostek 40S rybosom u (ang. stalling) wzdłuż sekwencji poprzedzającej m otyw strukturalny ([44]; Ryc. 3B). Ryc. 4. Alternatywne mechanizmy wyboru kodonu inicjacyjnego. Czerwona linia reprezentuje mrna zawierający ORF (białe ramki), czapeczkę (czerwony owal) i strukturę spinki. Zielone owale przedstawiają małą (40S) i dużą podjednostkę rybosomalną. Czarne strzałki pokazują drogę małej podjednostki. Opisy przedstawionych modeli inicjacji translacji objaśniono w tekście. Wewnętrzna inicjacja. Zasadnicza różnica między rybosomami prokariotycznymi i eukariotycznymi w inicjacji polega na wym ogach substratowych: pierw sze z nich mogą przyłączyć się do cyrkularnego mrna, a rybosomy eukariotyczne nie mogą [45], chyba że w obecności specjalnej struktury IRES (ang. jnternal Ribosome Entry Site; [46]; Rys. 3C). Struktury IRES wchodzą w skład długich, liczących kilkaset nt liderów mrna, pozbaw ionych 5 -końcowej czapeczki. Dotychczas scharakteryzowano ok. 30 sekwencji formujących IRES w obrębie transkryptów, zarówno w irusow ych [47, 48], jak i kom órkowych [49-51], wykazujących jednak zadziwiający brak podobieństwa zarówno na poziomie struktury pierwszo- jak i drugorzędowej. Ostatnio L e i M a i z e 1 [52] zasugerowali wspólną strukturę trzeciorzędową, opartą na motywie pseudoknot (w kształcie litery Y), dla sekwencji IRES kilku genów wirusowych i komórkowych. Stwierdzono, że wewnętrzna inicjacja wymaga obecności wszystkich czynników, biorących udział w inicjacji typu scanning, z wyjątkiem eif4e (picornavirus; [53]) ale w innym przypadku tylko eif2 i eif3 (hepatitis C virus', [54]). Zidentyfikowano również nieliczne białka komórkowe (np. autoantygen La), wspomagające w ew nętrzną inicjację w przypadku zmutowanych sekwencji IRES [55]. Dane te pozwoliły zasugerować udział chaperonów w wewnętrznej inicjacji. Ich rola miałaby polegać na uformowaniu i stabilizacji odpowiednich struktur IRES, wymaganych w procesie wewnętrznej inicjacji. W odróżnieniu od zależnego od 5 -końca scanningu, wewnętrzna inicjacja pozostaje na ogół niew rażliwa na obecność, blokującej scanning, struktury drugorzędowej w liderze (Ryc. 3D). W łaściwość tę wykorzystuje się w analizie polegającej na w prow a dzeniu stabilnej struktury spinki w pobliżu 5 -końca testowanego mrna. Brak wpływu na translację sugeruje, że mamy do czynienia z wewnętrzną inicjacją translacji. Trzeba jednak pam iętać, że uzyskanie negatywnego wyniku nie wyklucza udziału w ew nętrznej inicjacji. Stabilna spinka w liderze, równie dobrze może zablokować scanning, jak i udaremnić wewnętrzną inicjację, wskutek interferencji między wymaganą strukturą IRES, a wprowadzoną stabilną strukturą spinki. Wymieniony przykład ilustruje złożoność problem u struktury RNA w analizie m e chanizmu translacji nieznanego mrna. W efekcie przeprowadzenie pojedyńczego eksperymentu nie wystarcza do określenia typu inicjacji. VI. Alternatywne mechanizmy inicjacji Niedokładny scanning (ang. leaky scanning) oznacza proces, w którym kolejny z napotkanych kodonów AUG staje się miejscem inicjacji, z pom inięciem lub częściowym tylko wykorzystaniem 5 -proksymalnych (Ryc. 4A). Najczęstszą przyczyną jest brak odpowiedniego kontekstu otaczającego niewykorzystane w inicjacji triplety [28]. Wiele w irusów, nie wyłączając HIV, używa tego sposobu inicjacji i syntetyzuje dwa białka o zróżnicowanej długości z pojedyńczej sekwencji kodującej [57]. W ydajność rozpoznania kodonu może się znacznie różnić: bez względu na kontekst, nadmierna bliskość do 5 -końca zapobiega inicjacji [58]. Obecność struktu 124 POSTĘPY BIOCHEMII 47(2), 2001

ry drugorzędowej może spowolnić rybosom zw iększając szansę praw idłowego rozpoznania poprzedzającego ją kodonu inicjacyjnego, zwłaszcza, jeśli jest on usytuowany w suboptymalnym kontekście [28], Podobnie, optymalny kontekst, otaczający inny niż AUG kodon, może spowodować wykorzystanie nietypowego tripletu w inicjacji [58]. W ykorzystanie lub pom inięcie kodonu inicjacyjnego może ulec dodatkowej regulacji poprzez zm ianę warunków m etabolicznych lub środow iskow ych [59]. Wznowienie inicjacji (ang. reinitiation) zachodzi w przypadku transkryptów, zaw ierających sekwencję kodującą poprzedzoną krótką ramką odczytu (Ryc. 4B). W ówczas, po zakończeniu syntezy pierw szego krótkiego peptydu, duża podjednostka oddysocjowuje, a mała pozostaje przyłączona do mrna, reaktywuje scanning i inicjację, wykorzystując następny kodon inicjacyjny [9]. Wydajność reinicjacji jest tym wyższa, im dłuższa odległość między cistronami [60], umożliwiająca powtórne nabycie niektórych czynników inicjacyjnych, głównie eif2 w kom pleksie z GTP i Met-tRNAi [61]. W znowienie inicjacji zależy od długości uorf, która powinna wynosić nie więcej niż 30 kodonów [62, 63]. W niektórych przypadkach częstość reinicjacji zależy od peptydu kodowanego w obrębie uorf [25, 64]. Przykładowo, synteza specyficznego, krótkiego peptydu hamuje translację głównej ORF, położonej dalej w kierunku 3 -końca transkryptu, kodującej AdoM etdc u ssaków [65], czy CPA1 u drożdży [66]. Przypuszczano i potwierdzono to eksperymentalnie, że wymienione peptydy oddziałują z rybosomem i blokują hydrolizę peptydu z peptydyl-trna, uwięziwszy rybosom w miejscu kodonu term inacyjnego [67, 68]. W przeciw ieństwie do w ym ienionych przykładów, wznowienie inicjacji w przypadku drożdżowego genu GCN4 zależy od 10-cio nukleotydowej sekwencji, występującej za kodonam i term inacyjnym i [69], Wydajna reinicjacja zachodzi po terminacji uo R Fl, a represja następuje po term inacji uorf4 [70]. Wynik ten wskazuje, że wydajność terminacji może determinować wznow ienie inicjacji. W przypadku rozm aitych organizmów, wydajność term inacji i rola rybosom u po zakończeniu translacji rzeczywiście zależy od sekwencji otaczającej kodon terminacyjny [71]. Rozszerzony kodon terminacyjny u drożdży obejmuje dodatkowo czw artą zasadę sąsiadującą z 3 -końcem kodonu stop, która może modulować odziaływanie czynnika terminacji erfl z mrna [72]. Wpływ kontekstu kodonu stop na terminację wydaje się mieć szczególne znaczenie dla transkryptów wyposażonych w dodatkowe, krótkie ram ki odczytu. Zarówno reinicjacja, jak i niedokładny scanning, zachodzące w obecności krótkich uorf, m ogą stanowić sposób regulacji translacji, obniżający syntezę białka z głównej sekwencji kodującej. Tego typu regulacji podlega synteza niektórych czynników wzrostowych, produktów onkogenów, czy kluczowych enzymów niebezpiecznych dla życia komórki w warunkach zawyżonej ekspresji [57,73]. Retrowirusy w ykorzystują ten sposób regulacji do ograniczenia translacji, umożliwiając zaangażowanie mrna w enkapsydacji i replikacji [74]. W przeciwnej sytuacji, wymagającej wyższego poziom u translacji, inhibitorowe uorf ulegają eliminacji poprzez np. zmianę prom otora lub miejsc splicingowych. Nieliniowa migracja rybosomu (ang. discontinuous scanning, shunting). Niektóre transkrypty w irusowe zawierają czapeczkę, długie sekwencje liderowe z licznymi uorf i złożonymi strukturami drugorzędowymi. Inicjacja translacji, zachodząca pod kontrolą tego typu sekwencji, wymaga obecności 5 -końcowej modyfikacji, ale nie stosuje sie do modelu scanningu (Rye. 4C). Nietypowy mechanizm, zgodnie z którym rybosomy rozpoczynają scanning od 5 -końca mrna, lecz przerywają liniową migrację, omijając znaczną cześć lidera, został odkryty przy okazji analizy ekspresji mrna wirusa Sendai [75, 76], adenowirusa [77] i wirusa mozaiki kalafiora (ang. cauliflower mosaic virus; CaMV; [78, 79]). We w szystkich wym ienionych przypadkach zlokalizowano takie regiony w obrębie lidera mrna, które nie podlegają procesowi scanningu. Wprowadzone w tych miejscach stabilne struktury drugorzędowe nie interferują z procesem translacji, położonej dalej w kierunku 3 -końca mrna, sekwencji kodującej. Z biegiem czasu ustalono kilka równorzędnych term i nów, określających bliżej niezdefiniowany transfer rybosomu. Obecnie stosowane nazwy, nieliniowa migracja rybosomu albo shunting, oznaczają sam proces przeniesienia rybosomu, jak i związany z nim typ inicjacji translacji. Przez dłuższy czas intensywne badania nad m e chanizmem nieliniowej m igracji rybosomu, koncentrowały się głównie wokół lidera pregenomowego RNA wirusa CaMV. Inicjacja translacji, pod kontrolą tej 600 nt sekwencji, wym aga obecności trzech elementów: 5 -końcowej czapeczki [80], 5 -proksymalnej krótkiej ramki odczytu (uorfa; [81, 82]) i centralnie położonej wydłużonej spinki [83]. Struktura spinki zbudowana jest z 480 nt i składa się z trzech części o zróżnicowanej stabilności, zw ieńczonych dom eną przypom inającą strukturę liścia koniczyny (Ryc. 5; [84]). Uformowanie spinki pozwala wykluczyć centralną część lidera z procesu translacji POSTĘPY BIOCHEMII 47(2), 2001 125

[83, 85]. Pominięte w translacji sekwencje mogą oddziaływać z wirusowym białkiem płaszcza [86], pełniąc praw dopodobnie rolę w replikacji lub pakowaniu pregenom owego RNA. Zestaw ienie obu w y ników wyjaśnia znaczenie procesu nieliniowej m i gracji rybosomu, dzięki któremu translacja i inne procesy, istotne w cyklu życiowym wirusa, m ogą zachodzić równolegle. Ryc. 5. Struktura i funkcje lidera pregenomowego RNA wirusa CaMV. Lider (czerwona linia) poprzedza główną ramkę odczytu (ORF VII) i zawiera 5 -końcową czapeczkę (czarny owal), sześć uorf (od A do F) i wydłużoną spinkę, która składa się z trzech części o zróżnicowanej stabilności, zwieńczonych strukturą liścia koniczyny. Inicjacja translacji zachodzi poprzez shunting i wymaga obecności trzech elementów: czapeczki, 5 -proksymalnej uorf i stabilnej spinki (spinka 1), umożliwiając jednoczesne oddziaływanie z białkiem płaszcza (niewypełniony owal). Badania nad m olekularnym m echanizm em nieliniowej migracji rybosomu okazały się utrudnione, z powodu wielofunkcyjności lidera 35S RNA wirusa CaMV. Przeprowadzona w roztworze, szczegółowa analiza struktury drugorzędowej wykazała jednak, że najsilniej sparowana część stanowi podstawę struktury wydłużonej spinki [83, 84]. Z punktu w i dzenia translacji m ożna ją zastąpić syntetyczną sekwencją o długości 40 nt, która ulega sfałdowaniu w stabilną spinkę o energii (-)50 kcal/mol (ang. Kozak stem; [27]). W efekcie uzyskano znacznie skrócony syntetyczny lider mrna, wykazujący wszystkie cechy oryginalnej wirusowej sekwencji w promocji nieliniowej migracji rybosomu in vivo i in vitro [85]. W dalszych studiach zastosowano modelowy lider mrna do analizy funkcji 5 -proksymalnej, krótkiej uorf w inicjacji. Okazało się, że pełny cykl translacji, włączając inicjację, elongację i terminację uorf warunkuje przeniesienie czyli shunt rybosomu [87]. W przypadku wydajnej term inacji, praw dopodobnie mała podjednostka rybosomu omija strukturę spinki, po czym wznawia scanning i inicjację, um o żliwiając translację, położonej poniżej, właściwej sekwencji kodującej. W ymiana uorf jest możliwa, zarówno w kontekście syntetycznego, jak i w irusowego lidera mrna, ale tylko przez krótkie sekw encje kodujące od 2 do 14 aminokwasów, które nie blokują reinicjacj i [87, 88]. Opisane wyniki wskazują, że inicjacja poprzez shunting stanowi specjalny przypadek reinicjacj i (Ryc. 5). Przedstawiony model funkcjonuje zarówno w systemie roślinnym [80], drożdżowym [87], jak i zw ierzęcym [88], potw ierdzając uniwersalny charakter nieliniowej migracji rybosomu. Uw arunkow ana obecnością krótkiej uorf, nieliniowa migracja rybosomu zachodzi prawdopodobnie w czasie inicjacji translacji wielu innych pararetro-wirusów roślinnych, należących razem z CaMV do grupy caulimo- lub spokrewnionej grupy bad- /mwirusów. Porównanie sekwencji liderowych w y kazało, że we wszystkich tych przypadkach, pregenom owy RNA zaw iera filogenetycznie zakonserw o waną kombinację elementów istotnych w inicjacji typu shunt [89]. W przeciwieństwie do wirusa CaMV, nieliniowa migracja rybosomu, w przypadku 5 -UTR późnego mrna adenowirusa, wymaga obecności trzech krótkich sekwencji kom plem entarnych do 3 -końca 18S rrna [90]. Typowy dla ludzkiego adenowirusa mechanizm inicjacji zachodzi ze znacznie wyższą wydajnością niż charakterystyczny dla roślinnego w irusa CaMV, uor F-zależny shunting, sugerując zróżnicowane podłoże molekularne obydwu procesów, których wyjaśnienie wymaga oczywiście dalszych badań. VII. Podsumowanie Ze w zględu na interesujące m echanizm y regulacji, inicjacja translacji wcześnie stała się obiektem intensywnych badań, które obecnie koncentrują się nie tylko na białkowych czynnikach inicjacyjnych, ale i roli samego mrna. Zwrócenie uwagi na istotną rolę struktury mrna w translacji podyktowane jest, z jednej strony, znakom itym w ostatnich czasach postępem badań strukturalnych, a z drugiej, zmianą spojrzenia na RNA. W świetle obecnie uznawanej koncepcji Świata RNA [91] przyjmuje się, że RNA pełnił zasadniczą, aktyw ną rolę we wczesnych etapach rozwoju życia na Ziemi. Wynikający stąd wzrost zainteresow ania cecham i RNA, jego struk 126 POSTĘPY BIOCHEMII 47(2), 2001

turą i wpływem struktury na funkcję, stanowi impuls dla rozwoju dalszych badań w wielu dziedzinach, gdzie RNA odgrywa wiodącą rolę, uwzględniając proces replikacji, alternatywnego składania czy translacji. Przytoczone w niniejszym opracowaniu badania struktury lidera 35S RNA wirusa CaMV przyczyniły się do w yjaśnienia zarówno m echanizmu nieliniowej migracji rybosom u, jak i cyklu życiowego pararetrow irusów roślinnych. Piśmiennictwo Artykuł otrzymano 3 lipca 2000 r. Zaakceptowano do druku 12 lutego 2001 r. 1. KadonagaJT (1998) Celi 92: 307-313. 2. Shatkin AJ (1976) Celi 9: 645-653 3. Staley JP, Guthrie C (1998) Celi 92: 315-326 4. BarabinoSML, Keller W (1999) Celi 99: 9-11 5. Dreyfuss G, Matunis MJ, Pintl-Roma S, Burd CG (1993) Annu Rev Biochem 62: 289-321 6. Krecie A, Swanson MS (1999) Curr Opin Cell Biol 11: 363-371 7. Stutz F, Rosbash M (1998) Genes Dev 12: 3303-3319 8. Merrick W, Ftershey JWB (1996) W: Fiershey J, Matthews M, Sonnenberg N (red) Translational control. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y, str. 31-69 9. Kozak M (1989) J Cell Biol 108: 229-241 10. Kozak M (1986) Cell 44: 283-292 11. Wilson KS, NollerHF (1998) Cell 92: 337-349 12.Cate JH, Yusupov MM, Yusupova GZ, Earnest TN, Noller HF (1999). Science 285: 2095-2104 13.Song H, Mugnier P, Das AK, Webb HM, Evans DR, Tuite MF, Hemmings BA, Barford D (2000) Cell 100: 311-321 14.Gingras A-C, Raught B, Sonenberg N (1999) Annu Rev Biochem 68: 913-963 15. Kozak M (1983) Microbiol Rev 47: 1-11 16. Kozak M, Shatkin AJ (1976) J Biol Chem 251: 4259-4266 17. Konarska MM, Padgett RA, Sharp PA (1984) Cell 38: 731-736 18. Varan i G (1997) Structure 5: 855-858 19. Kozak M (1991) Gene Expression 1: 117-125 20. Hentze MW, Caughman SW, Casey JL, Koeller DM, Rouault TA, Harford JB, Klausner RD (1988) Gene 72: 201-208 21.Meyuhas O, Avni D, Shama S (1996) W: Hershey J, Matthews M, Sonnenberg N (red) Translational control. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y, str. 363-388 22. Hentze MW, Kühn LC (1996) Proc Natl Acad Sei USA 93: 8175-8182 23. Jefferies HB, Reinhard C, Kozma SC, Thomas G (1994) Proc Natl Acad Sei USA 91: 4441-4445 24. Kozak M { m i ) Nucleic Acids Res 15: 8125-8145 25.Geballe AP (1996) W: Hershey J, Matthews M, Sonnenberg N (red) Translational control. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y, str. 173-197 26. Pelletier J, Sonenberg N (1985) Cell 40: 515-526 27. Kozak M (1989) Mol Cell. Biol 9: 5134-5142 28. Kozak M (1990) Proc Natl Acad Sei USA 87: 8301-8305 29. Sachs AB, Sarnów P, Hentze MW (1997) Cell 89: 831-838 30.Craig AW, Haghighat A, Yu AT, Sonenberg N (1999) Nature 392: 520-523 31. P r e i s s T, Hentze MW (1998) Nature 392: 516-520 32. Ross J (1996) Trends in Genetics 12: 171-175 33. Grifo JA, Abramson RD, SatlerCA, Merrick WC (1984) J Biol Chem 259: 8648-8654 34. Linder P, Lasko PF, Ashburner M, Leroy P, Nielsen PJ i i n. (1989) Nature 337: 121-122 35. Browning KS, Goss DJ, Roth DA, Gallie DR (1998) W: Bailey-Serres J, Gallie DR (red)a look beyond transcription. American Society of Plant Physiologists, New York, NY, str. 68-83 36. Marcotrigiano J, Gingras A-C, Sonenberg N, Burley SK (1997) Cell 89: 951-961. 37. Matsuo H, Li H, McGuire AM, Fletcher CM i in. (1997) Nat Struct Biol 4: 717-724. 38. Haghighat A, Sonenberg N (1997) J Biol Chem 272: 21677-21680 39. Browning KS (1996) Plant Mol Biol 32: 107-144 40. Gradi A, Imataka H, Svitkin YV, Rom E. Raught B i i n. (1998) Mol Cell Biol 18: 334-342 41.Rozen F, Edery I, Meerovitch K, Dever TE, Merrick WC, Sonenberg N (1990) Mol Cell Biol 10: 1134-1144 42. Altman M, Wittmer B, Methot N, Sonenberg N, Trachsel H (1995) EMBO J 14: 3820-3827 43. Pestova TV, Borukhov SI, Hellen CUT ( 1998)Nature 394: 854-859 44. Kozak M (1998) Nucleic Acids Res 26: 4853-4859 45. Kozak M {1919) Nature i m 82-85 46. Chen CY, Sarnow P (1995) Science 268: 415-417 47. Pelletier i Sonenberg N (1988) Nature 334: 320-325 48. Belsham GJ, Sonenberg N (1996) Microbiol Rev 60: 499-511 49. Macejak DG, Sarnow P (1991) Nature 353: 90-94 50. Akiri G, Nahari D, Finkeistein Y, Le SY, Elroy-Stein O, Levi BZ (1998) Oncogene 17: 227-236 51. S tone 1ey M, Paulin FE, Le Quesne JP, Chappell S A, Willis A E (1998) Oncogene 16: 423-428 52. Le S Y, Maizel JVJ (1997) Nucleic Acids Res 25: 362-369 53. Pestova TV, Hellen CUT, Shutsky IN (1996) Mol Cell Biol 16: 6859-6869 54. Pestova TV, Shutsky IN, Fletcher SP, Jackson RJ, Hellen CUT (1998) Genes Dev 12: 67-83 55. Y o o C J, Wolin SL (1997) C e//89: 393-402 56. Kaminski A, Jackson RJ (1998) RNA 4: 626-638 57. Kozak M (1991) J Cell Biol 115: 887-903 58. Kozak M (1991) J Biol Chem 266: 19867-19870 59. Wang Z, Fang P, Sachs MS (1998) Mol Cell Biol 18: 7528-7536 60. K o z a k M (1987) Mol Cell Biol 7: 3438-3445 öl.hinnebusch AG (1997) J Biol Chem 272: 21661-21664 62.Luukkonen BG, Tan W, Schwartz S (1995) J Virol 69: 4086-4094 63.Fütterer J, Hohn T (1992) Nucleic Acids Res 20: 3851-3857 64. Lovett PS, Rogers EJ (1996) Microbiol Rev 60: 366-385 65. Hill JR, Morris DR (1992) J Biol Chem 267: 21886-21893 66.Delbecq P, Werner M, Feller A, Filipkowski RK, Messenguy F, PiJrard A (1994) Mol Cell Biol 14: 2378-2390 67. Wang Z, Sachs MS (1997) Mol Cell Biol 17: 4904-4913 68. Wang Z, Gaba A, Sachs MS (1999) J Biol Chem 274: 37565-37574 69. Miller PF, Hinnebusch AG (1989) Genes Dev 3: 1217-1225 70. Hinnebusch AG (1994) Trends Biochem Sei 19: 409-414 71. McCarthy JEG (1998) Microbiol Mol Biol Rev 62: 1492-1553 72. Tate WP, Poole ES, Mannering SA 1996) Nucleic Acid Res Mol Biol 52: 293-333 73.Wera S, Fernandez A, Lamb NJC, Turowski P, H e m m i n g s - M i e s z c z ak M, Mayer-Jaekel RE, Hemmings BA (1995) J Biol Chem 270:21374-21381 74. Moustakas A, Sonstegard TS, Hackett PB (1993) J Virol 67: 4350-4357 75.Curran J, Kolakofsky D (1988) EMBO J l: 2869-2874 76. Curran J, Kolakofsky D (1989) EMBO J 8 : 521-526 77. Yueh A, Schneider RJ (1996) Genes Dev 10: 1557-1567 POSTĘPY BIOCHEMII 47(2), 2001 127

78. Fütterer J, Gordon K, Pfeiffer P, San façon H, Pisan B, Bonneville JM, Hohn T (1989) Virus Genes 3 : 45-55 79. Fütterer J, Kiss-Fâszlô Z, Hohn T (1993) Cell 73: 789-802 80. Schmidt-Puchta W, Dominguez D, Fewetag D, H o h n T (1997) Nucleic Acids Res 25: 2854-2860 81.Pooggin MM, Hohn T, Fütterer J (1998) J Virol 72: 4157-4169 82. Dominguez DI, Ryabova LA, Pooggin MM, Schmidt-Puchta W, Fütterer J, Hohn T (1998)JBiol Chem 273: 3669-3678. 83. Hemmings-Mieszczak M, Steger G, Hohn T (1998) RNA 4: 101-111 84. Hemmings-Mieszczak M, Steger G, Hohn T (1997) J Mol Biol 267: 1075-1088 85. Hemmings-Mieszczak M, Hohn T (1999) RNA 5: 1149-1157 86. Guerra-Peraza O, de Tapia M, Hohn T, Hemmings-Mieszczak M (1999) J Virol 74: 2067-2072 87. Hemmings-Mieszczak M, Hohn T, Preiss T (2000) Mol Cell Biol 20: 6212-6223 88. Ryabova LA, Hohn T (2000) Genes Dev. 14: 817-829 89.Pooggin MM, Fütterer J, Skryabin KG, Hohn T (1999) J Gen Virol 80: 2217-2228 90. Y ueha, Schneider RJ (2000) Genes Dev 14: 414-421 91. C r i c k F (1993) W: Gesteland RF, Atkins JF (red) The RNA World. Cold Spring Harbor Laboratory, NY, str. XI-XIV 128 POSTĘPY BIOCHEMII 47(2), 2001