Endokrynologia Pediatryczna Pediatric Endocrinology

Marek-Trzonkowska N. i inni: Terapia limfocytami T regulatorowymi Szewczyk L. i inni CD4 Aktywność + CD25 high CD127 opioidowa - chroni u dziewcząt komórki z nadczynnością ß trzustki w cukrzycy i niedoczynnością typu 1 u tarczycy dzieci Vol. 11/2012 Nr 4(41) Endokrynologia Pediatryczna Pediatric Endocrinology Terapia limfocytami T regulatorowymi CD4 + CD25 high CD127 - chroni komórki β trzustki w cukrzycy typu 1 u dzieci Administration of CD4 + CD25 high CD127 - Regulatory T Cells Preserves β-cell Function in Type 1 Diabetes in Children 1* Natalia Marek-Trzonkowska, 2* Małgorzata Myśliwiec, 1 Anita Dobyszuk, 1 Marcelina Grabowska, 2 Ilona Techmańska, 4 Jolanta Juścińska, 3 Magdalena A. Wójtewicz, 5 Piotr Witkowski, 6 Wojciech Młynarski, 2 Anna Balcerska, 7 Jolanta Myśliwska, 1,8 Piotr Trzonkowski * Autorzy o równym wkładzie pracy, 1 Katedra Medycyny Rodzinnej, Gdański Uniwersytet Medyczny, Polska, 2 Klinika Pediatrii Hematologii Onkologii i Endokrynologii, Gdański Uniwersytet Medyczny, Polska, 3 Regionalne Centrum Krwiodawstwa i Krwiolecznictwa w Gdańsku, Polska, 4 Katedra Anestezjologii i Intensywnej Terapii,Polska, 5 Katedra Chirurgii, Uniwersytet Chicago, USA, 6 Klinika Pediatrii, Onkologii, Hematologii i Diabetologii, Uniwersytet Medyczny w Łodzi, Polska, 7 Zakład Immunologii, Gdański Uniwersytet Medyczny, Polska, 8 Trójmiejska Akademicka Zwierzętarnia Doświadczalna, Gdański Uniwersytet Medyczny, Polska * These authors equally contributed to this study, 1 Department of Family Medicine, Medical University of Gdańsk, Poland, 2 Department of Pediatrics, Hematology, Oncology and Endocrinology, Medical University of Gdańsk, Poland, 3 Blood Bank of Pomerania Region, Gdańsk Unit, Poland, 4 Department of Anesthesiology and Critical Care, Medical University of Gdańsk, Poland, 5 Department of Surgery, University of Chicago, USA, 6 Department of Pediatrics, Oncology, Haematology and Diabetology, Medical University of Lodz, Poland, 7 Department of Immunology, Medical University of Gdańsk, Poland, 8 Tricity Academic Experimental Facility, Medical University of Gdańsk, Poland Copyright 2012 American Diabetes Association From Diabetes Care, Vol. 35, 2012; 1817 1820 Reprinted by permission of the American Diabetes Association. Adres do korespondencji: Natalia Marek-Trzonkowska, Gdański Uniwersytet Medyczny Katedra Medycyny Rodzinnej, ul. Dębinki 2, 80-211 Gdańsk, Polska, tel. 0048 58 3491575, 0048 58 3491592; fax 0048 58 3491576, 0048 58 3491591, e-mail: natalia.marek@gumed.edu.pl Słowa kluczowe: cukrzyca typu 1, komórki T regulatorowe (Tregs), ekspansja in vitro, terapia komórkowa, remisja Key words: diabetes type 1, regulatory T cells (Tregs), in vitro expansion, cellular therapy, remission STRESZCZENIE/ABSTRACT Wstęp. Cukrzyca typu 1 rozwija się w wyniku niszczenia wysp trzustkowych przez autoreaktywne limfocyty T. Proces ten dodatkowo nasila deficyt liczby limfocytów T regulatorowych (Tregs). W pracy prezentujemy po raz pierwszy terapię będącą dowodem, że infuzja autologicznych komórek Tregs przedłuża remisję u dzieci ze świeżo rozpoznaną DM1. Materiały i metody. Terapii poddano 10 dzieci z cukrzycą typu 1 (8 16 lat) w ciągu 2 miesięcy od rozpoznania choroby. 4 pacjentom podano 10x10 6 Tregs/kg masy ciała, natomiast pozostałych 6 leczonych dzieci otrzymało 20 x10 6 Tregs/kg masy ciała. Preparat terapeutyczny składał się z wyizolowanych autologicznych komórek Tregs CD3 + CD4 + CD25 high CD127 - namnożonych w warunkach dobrej praktyki produkcyjnej. Wyniki. Nie 17

Praca oryginalna Endokrynol. Ped., 11/2012;4(41):17-26 zaobserwowano żadnych niepożądanych efektów terapii. Od dnia podania preparatu u pacjentów doszło do wzrostu odsetka limfocytów Tregs we krwi obwodowej. Obserwacje prowadzono równolegle w grupie kontrolnej, którą stanowili pacjenci dobrani odpowiednio pod względem klinicznym niepoddani terapii komórkami Tregs. Pół roku od rozpoznania cukrzycy typu 1 (4 5 miesięcy od infuzji komórek Tregs) 8 pacjentów poddanych terapii przyjmowało dzienną dawkę insuliny w wysokości 0,5 UI/kg m.c., natomiast 2 pozostałych pacjentów nie wymagało podaży egzogennej insuliny. Poziom C-peptydu w surowicy był istotnie wyższy u dzieci, które otrzymały komórki Treg niż w grupie kontrolnej. Wnioski. Badanie wykazuje, że terapia komórkami Tregs jest bezpieczna i dobrze tolerowana przez dzieci ze świeżo rozpoznaną cukrzycą typu 1. Endokrynol. Ped. 11/2012;4(41):17-26. Objective. Type 1 diabetes is a condition in which pancreatic islets are destroyed by selfreactive T cells. The process is facilitated by deficits in the number and suppressive activity of regulatory T cells (Tregs). Here, we show for the first time that the infusion of autologous Tregs prolongs remission in recently diagnosed type 1 diabetes in children. Research design and methods. We have administered Tregs in 10 type 1 diabetic children (aged 8 16 years) within 2 months since diagnosis. In total, 4 patients received 10 x 10 6 Tregs/kg body wt, and the remaining 6 patients received 20 x10 6 Tregs/kg body wt. The preparation consisted of sorted autologous CD3+CD4+CD25highCD1272 Tregs expanded under good manufacturing practice conditions. Results. No toxicity of the therapy was noted. A significant increase in the percentage of Tregs in the peripheral blood has been observed since the day of infusion. These patients were followed along withmatched type 1 diabetic patients not treated with Tregs. Half a year after type 1 diabetes onset (4 5 months after Tregs infusion), 8 patients treated with Tregs still required,0.5 UI/kg body wt of insulin daily, with 2 patients out of insulin completely, whereas the remission was over in the nontreated group. In addition, plasma C-peptide levels were significantly higher in the treated group as compared with those not treated. Conclusions. This study shows that the administration of Tregs is safe and tolerable in children with recent-onset type 1 diabetes. Pediatr. Endocrinol. 11/2012;4(41):17-26. Wstęp Cukrzyca typu 1 (DM1) jest obecnie jedną z najczęściej występujących chorób przewlekłych wieku dziecięcego. Szacuje się, że zachorowalność na DM1 w Polsce ulega podwojeniu co 10 lat [1]. Choroba rozwija się w wyniku niszczenia komórek β trzustki przez autoreaktywne limfocyty T [2 3]. W badaniach na zwierzętach zaobserwowano, że autoreaktywne limfocyty T pochodzące od myszy chorych na DM1 indukują rozwój choroby u osobników zdrowych [4]. Badania z zastosowaniem zwierzęcych modeli DM1 wykazały ponadto, że proces autoimmunologicznego niszczenia wysp trzustkowych może być zahamowany/spowolniony przez limfocyty T regulatorowe (Tregs; CD4+CD25highCD127- FoxP3+) [5 8]. Do podobnych wniosków skłaniają wyniki badań nad występującym u człowieka zespołem immunodysregulacji, poliendokrynopatii związanym z chromosomem X (ang. immunodysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, X linked syndrome, IPEX). U podłoża IPEX leży mutacja w genie FoxP3, czego konsekwencją jest brak funkcjonalnych komórek Treg i wystąpienie szeregu zaburzeń, w tym DM1 [9]. Wiadomo ponadto, że komórki Tregs biorą udział w hamowaniu fizjologicznych reakcji immunologicznych, co ma na celu utrzymanie równowagi w ukladzie immunologicznym. W roku 2009 nasz zespół badawczy po raz pierwszy podał, otrzymując efekt terapeutyczny, namno- żone sztucznie komórki Tregs pacjentowi z chorobą przeszczep przeciw gospodarzowi (ang. graft-versus-host disease, GVHD) [10]. Skuteczność tej metody została potwierdzona niedawno w profilaktyce GVHD [11,12]. W niniejszej pracy przedstawiamy wyniki terapii komórkami Tregs dzieci ze świeżo zdiagnozowaną DM1. Materiały i metody 10 pacjentów w wieku 8 16 lat (6 dziewcząt i 4 chłopców), u których zdiagnozowano DM1, w oparciu o zalecenia Światowej Organizacji Zdrowia (World Health Organization) zostało poddanych terapii komórkami Tregs [13] (supl. ryc.1). Przyjęto następujące kryteria włączenia: wiek 8 18 lat; 2 miesiące od rozpoznania choroby; obecność przeciwciał przeciw dekarboksylazie kwasu glutaminowego 65 (anty-gad65), przeciw insulinie (IAA), przeciwwyspowych (ICA), C- peptyd na czczo 0,4 ng/ml podczas dwóch kolejnych pomiarów, BMI 25 75 percentyla ± 1,5 SD odpowiednio dla wieku, odpowiedni dostęp żylny. Kryteria wykluczenia były następujące: cytopenia; niski poziom hemoglobiny; nosicielstwo allelu HLA- DQB1*0602; pozytywny test w kierunku wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV), typu C (HCV), HIV oraz Treponema pallidum; aktywna choroba zakaźna; historia choroby nowotworowej; nadmierny lęk pacjenta lub jego rodziców/opiekunów 18

Marek-Trzonkowska N. i inni: Terapia limfocytami T regulatorowymi CD4 + CD25 high CD127 - chroni komórki ß trzustki w cukrzycy typu 1 u dzieci Supl. ryc. 1. Schemat terapii. Pacjenci przyjmowani są na oddział pediatryczny w celu pobrania krwi (1). Krew jest przetwarzana w Stacji Krwiodawstwa i Krwiolecznictwa (2). Kożuszek leukocytarny i surowica przesyłane są do laboratorium GMP (ang. good manufacturing practice), gdzie limfocyty T regulatorowe CD127-CD25highCD4+CD3+lin-doublet- są izolowane i namnażane (3). Gotowy preparat jest podawany pacjentowi we wlewie dożylnym (4). Pacjent znajduje się pod kontrolą ambulatoryjną Suppl. fig. 1. Overview of the study. The patients were admitted to the hospital, where peripheral blood was drawn (1). Blood was processed in the Blood Center (2). Buffy coat and plasma were sent to the GMP laboratory, which sorted CD127- CD25highCD4+CD3+lin-doublet- T regulatory cells and expanded them under GMP conditions (3). The final product was released and administered to the patient (4). The patient was then followed in the outpatient clinic wobec procedur stosowanych w badaniu; choroba przewlekła wymagająca przyjmowania leków innych niż insulina. Od każdego pacjenta pobierano do 250 ml krwi obwodowej pod kontrolą anestezjologa. W przypadku dzieci o masie ciała 50 kg objętość pobranej krwi wynosiła 0,5% masy ciała. Komórki Tregs przygotowywano zgodnie z wcześniej opisaną procedurą [10,14]. Z pobranej krwi izolowano limfocyty Tregs o następującym fenotypie: CD3+CD4+C- D25highCD127-lin-doublet, stosując połączenie metody izolacji magnetycznej i cytometrycznej. W efekcie otrzymywano czystą populację komórek Tregs (mediana [minimum maksimum]; odpowiednio: 98% [97 99]). W porównaniu do wcześniej stosowanego protokołu istotną modyfikacją podczas pozyskiwania komórek było zastosowanie sortera komórkowego zaadaptowanego do pracy w warunkach GMP (ang. good manufacturing practice dobra praktyka produkcyjna), wyposażonego 19

Praca oryginalna Endokrynol. Ped., 11/2012;4(41):17-26 w wymienny system rurek, przez który przepływa materiał biologiczny pacjentów (Influx; BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Zastosowanie tego rodzaju urządzenia eliminuje ryzyko krzyżowej kontaminacji próbek. Kolejną modyfikacją stosowanej wcześniej metody było użycie pożywki hodowlanej CellGro (CellGenix, Breisgau, Niemcy) spełniającej standardy GMP, którą suplementowano 10% surowicą pacjenta. Do hodowli dodawano ponadto interleukinę 2 (IL-2; 1000 UI/ml; Proleukin; Chiron, San Diego, USA) oraz dopuszczone do użytku klinicznego mikrosfery magnetyczne opłaszczone przeciwciałami anty-cd3 i anty-cd28 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) w liczbie równej liczbie komórek. Komórki hodowano do momentu otrzymania wymaganej dawki terapeutycznej, lecz nie dłużej niż 2 tygodnie (mediana [minimum maksimum]; odpowiednio: 10 dni [7 14]). Wprowadzone modyfikacje pozwoliły istotnie poprawić stabilność i jakość hodowanych komórek. Kliniczne zastosowanie komórek Tregs poprzedzała kontrola jakości. W terapii były używane jedynie komórki spełniające następujące kryteria: ekspresja czynnika FoxP3 90% (mediana [minimum maksimum]; odpowiednio: 93% [90 97]); pozytywny wynik testu hamowania produkcji IFN-γ przez komórki efektorowe oraz czystość mikrobiologiczna (negatywny wynik badania na obecność wirusów: HBV, HCV i HIV, negatywny wynik badania na obecność bakterii w nadsączu hodowlanym). Przed infuzją komórki Tregs kilkukrotnie płukano, usuwając pożywkę hodowlaną i kulki magnetyczne, a następnie zawieszano w 250 ml 0,9% roztworu soli fizjologicznej (Polfa, Polska). Tak przygotowane komórki podawano pacjentowi w powolnym wlewie kroplowym pod kontrolą anestezjologa w ciągu 1h od momentu zwolnienia produktu z laboratorium. Stosowana dawka komórek wynosiła 20 x 10 6 / kg m.c. (n=6) lub 10x10 6 / kg m.c. (n=4) (niższą dawkę podawano w przypadku, kiedy protokół wymagał przerwania hodowli komórek po upływie 2 tyg.). Grupę kontrolną stanowiło 10 pacjentów dobranych pod względem klinicznym w stosunku do grupy badanej, którzy zostali wykluczeni z udziału w terapii ze względu na dostęp żylny uniemożliwiający pobranie wymaganej objętości krwi. Badanie nie było randomizowane ani zaślepione, a grupa kontrolna nie była poddana żadnej interwencji, jak pobranie wymaganej objętości krwi do ekspansji komórek Tregs czy symulacja podania gotowej szczepionki. Porównanie klinicznej charakterystyki badanych grup przedstawiono w tabeli 1. Jako punkty końcowe badania przyjęto stężenie C-peptydu na czczo, poziom HbA1c oraz zapotrzebowanie na insulinę, uznając dobową dawkę insuliny (DDI) 0,5 IU/kg m.c. za wartość wskazującą na remisję. Badanie prowadzono zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Niezależną Komisję Bioetyczną do Spraw Badań Naukowych przy GUMed (nr zgody NKEBN/8/ 2010). Przed przystąpieniem do procedury pacjent i/lub jego rodzice wyrażali pisemną zgodę na udział w badaniu. Wyniki W momencie podania komórek ani podczas całego okresu prowadzenia obserwacji u pacjentów poddanych terapii nie zaobserwowano przypadków ciężkich infekcji, epizodów ostrej hypo- lub hiperglikemii czy żadnych innych efektów niepożądanych. W przypadku jednego pacjenta w dniu infuzji doszło do koincydentalnej manifestacji grypy, co potwierdzono laboratoryjnie w dzień po przeprowadzeniu procedury (badanie wydzieliny jamy nosowo-gardłowej [bionexia Influenza; biomérieux, Marcy l Etoile, Francja]). Dwa tygodnie po podaniu komórek Tregs zaobserwowano istotny spadek zapotrzebowania na egzogenną insulinę oraz obniżenie się poziomu HbA- 1c u wszystkich leczonych pacjentów (ryc. 1 i supl. ryc. 2 3). Ponadto od dnia podania komórek Tregs obserwowano istotny wzrost ich odsetka we krwi obwodowej (test Wilcoxona, P = 0,04) (ryc. 2 i supl. ryc. 2 3). Istotne statystycznie różnice pomiędzy grupą badaną i kontrolną wykazano po raz pierwszy w 6 miesiące od zdiagnozowania DM1 (4 5 mies. po podaniu komórek Tregs). Spośród 10 pacjentów 8 pozostaje w klinicznej remisji, zdefiniowanej jako DDI 0,5 IU/kg m.c (DDI grupy badanej: mediana [minimum maksimum]; odpowiednio: 0,22 UI/kg m.c. [0 0,60]). Dwoje dzieci spośród 8 będących w remisji nie wymaga podaży egzogennej insuliny. W tym samym czasie remisja dobiegła końca u 6 spośród 10 pacjentów z grupy kontrolnej (DDI mediana [minimum maksimum]; odpowiednio: 0,52 UI/kg m.c. [0,18 0,69]; test U Manna-Whitneya, P = 0,04). Ponadto poziom C-peptydu na czczo był istotnie wyższy u dzieci poddanych terapii komórkami Tregs w porównaniu z pacjentami, którzy nie otrzymali szczepionki (mediana [minimum-mak- 20

Marek-Trzonkowska N. i inni: Terapia limfocytami T regulatorowymi CD4 + CD25 high CD127 - chroni komórki ß trzustki w cukrzycy typu 1 u dzieci Tabela I. Kliniczna charakterystyka pacjentów. Dane przedstawiono jako mediany wraz z zakresem wartości przyjmowanych przez daną zmienną w nawiasach; n = liczba przypadków, BMI = indeks masy ciała, po 2 ciśnienie parcjalne tlenu, pco 2 = ciśnienie parcjalne dwutlenku węgla, BE= nadmiar zasad, anty-gad65 = przeciwciała przeciw dekarboksylazie kwasu glutaminowego, ICA= przeciwciała przeciw wyspowe, IAA= przeciwciała przeciw insulinie Table I. Clinical characteristics of the patients. Data are median (minimum maximum) or number of patients. BE, base excess; pco 2, pressure of carbon dioxide; po 2, pressure of oxygen; SatO 2, oxygen saturation Parametr Grupa badana (n=10) Grupa kontrolna (n=10) Wiek (lata) 12.2 (8-16) 11.8 (7-16) BMI (kg/m 2 ) 16.9 (14.2-21.5) 16.9 (14.2-20.7) Glukoza na czczo w dniu diagnozy (mg%) 354 (151-588) 354 (151-598) Polidypsja w momencie diagnozy 5 8 Poliuria w momencie diagnozy 5 8 Spadek masy ciała w momencie diagnozy 4 3 ph w dniu diagnozy (krew włośniczkowa) 7.39 (7.36-7.46) 7.39 (7.34-7.53) po2 w dniu diagnozy (krew włośniczkowa, mmhg) 69.3 (63.4-88.0) 69.0 (56.9-86.2) pco2 w dniu diagnozy (krew włośniczkowa, mmhg) 39.1 (28.0-41.8) 38.0 (24.0-41.0) HCO3 w dniu diagnozy (krew włośniczkowa, mmhg) 23.85 (18.8-25.0) 23.3 (21.3-25.2) Równowaga kwasowo zasadowa w dniu diagnozy (BE, meq/l) -0.55 (-7.8 do 1.0) -0.6 (-7.0 do 0.9) Saturacja O2 w dniu diagnozy (krew włośniczkowa, %) 94.1 (90.2-97.3) 95.5 (92.4-98.0) Anty-GAD65 10 10 ICA 5 5 IAA 9 8 simum]; odpowiednio: 0,75 ng/ml [0,38 2,11] vs. 0,48 ng/ml [0,15 0,56]; test U Manna-Whitneya, P = 0,01) (ryc. 1). Nie zaobserwowano różnic w skuteczności terapii pomiędzy pacjentami, którzy przyjęli dwie różne dawki komórek Tregs, dlatego wyniki leczonych pacjentów prezentowane są bez podziału na grupy. Dyskusja Wcześniejsze badania wykazały, że komórki Tregs pochodzące od chorych z DM1 wykazują taką samą zdolność do proliferacji, jak komórki osób zdrowych. W zwiąku z tym przeprowadzenie ekspansji tych komórek w warunkach in vitro nie jest problemem [15]. Niemniej istniały do tej pory wątpliwości, czy zastosowanie autologicznych Tregs w leczeniu DM1 może przynieść efekt terapeutyczny. Wcześniej wykazano bowiem, że u pacjentów z DM1 występuje subpopulacja komórek Tregs FoxP3+IFN-γ+, którą charakteryzuje obniżona aktywność immunosupresyjna [16]. W przypadku naszych pacjentów populacja ta była bardzo nieliczna (~1% komórek Tregs) i nigdy nie zauważono jej negatywnego wpływu na efekt testów funkcjonalnych in vitro. Obserwacje te sugerują więc, że za większość zaburzeń immunologicznych leżących u podłoża DM1 odpowiedzialne są aktywowane autoreaktywne komórki efektorowe (Teff), a nie defekt funkcji/proliferacji limfocytów Tregs [17,18]. Pogląd ten popiera fakt, że obecność aktywowanych komórek Teff rozpoznających antygeny własnych wysp trzustkowych jest udokumentowana u człowieka [19]. Wcześniejsze badania z zastosowaniem zwierzęcych modeli DM1 wykazały, że podanie zwielokrotnionej liczby komórek Tregs hamuje działanie autoreaktywnych limfocytów Teff i chroni przed wystą- 21

Praca oryginalna Endokrynol. Ped., 11/2012;4(41):17-26 Ryc. 1. Na wykresach przedstawiono: C-peptyd, DDI (dobowa dawka insuliny), HbA1c oraz poziom glukozy na czczo u dzieci z cukrzycą typu 1 poddanych terapii komórkami Tregs (n = 10) podczas okresu obserwacji. Wartości dla grupy kontrolnej (n = 10) oznaczono szarym kolorem. Wyniki przedstawiono jako mediany (minimum maksimum); symbolem * oznaczono różnice istotne statystycznie Fig. 1. C-peptide, DDI, HbA1c, and fasting glucose in type 1 diabetic children treated with Tregs infusions (n = 10) during follow-up. Values for matched comparison patients not treated with Tregs (n = 10) are shown as gray columns. Values are given as median (minimum maximum). *Significant differences Supl. ryc. 2. Wartości C-peptydu, dobowej dawki insulin/kg m.c., HbA1c, glukozy na czczo oraz poziomu limfocytów Tregs badanych pacjentów w punkcie początkowym i końcowym obserwacji. Każdemu pacjentowi przypisano jeden kolor, który użyto do przedstawienia jego wyników na wszystkich wykresach. W przypadku grupy kontrolnej poziom limfocytów Tregs oznaczono dla 6 badanych Suppl. fig. 2. Individual results of C-peptide, daily doses of insulin/kg b.w. (DDI/kg), HbA1C, fasting glucose and levels of Tregs in studied groups. The same symbol and colour are assigned to particular patients throughout the charts. Tregs levels were available only for six patients from the comparison group 22

Marek-Trzonkowska N. i inni: Terapia limfocytami T regulatorowymi CD4 + CD25 high CD127 - chroni komórki ß trzustki w cukrzycy typu 1 u dzieci Ryc. 2. Na wykresie przedstawiono poziom komórek Tregs CD3 + CD4 + CD25 high CD127 - FoxP3 + u pacjentów z cukrzycą typu 1 poddanych terapii komórkami Tregs (n = 10) podczas okresu obserwacji. Wartości dla punktu -10 oznaczają dzień pobrania krwi w celu izolacji komórek Tregs. Wartości dla grupy kontrolnej oznaczono szarym kolorem (dostępne dane jedynie dla 6 pacjentów). Wyniki przedstawiono jako mediany (minimum maksimum); symbolem * oznaczono różnice istotne statystycznie Fig. 2. Levels ofcd3+cd4+cd25highcd127- FoxP3+ Tregs in type 1 diabetic children treated with Tregs infusions (n = 10) during follow-up. Value for the -10- days point refers to the day of blood drawing for Tregs sorting. Gray column depicts values measured for the matched comparison patients not treated with Tregs (only six patients were available). Data are shown as medians (minimum maximum). *Significant differences Supl. ryc. 3. Wartości C-peptydu, dobowej dawki insulin/kg m.c., HbA1c, glukozy na czczo oraz poziomu limfocytów Tregs badanych pacjentów w punktach kontrolnych badania. Każdemu pacjentowi przypisano jeden kolor, który użyto do przedstawienia jego wyników na wszystkich wykresach Suppl. fig. 3. Individual results of C-peptide, daily doses of insulin/kg b.w. (DDI/kg), HbA1C, fasting glucose and levels of Tregs in the treated group. The same symbol and colour are assigned to particular patients throughout the charts 23

Praca oryginalna Endokrynol. Ped., 11/2012;4(41):17-26 pieniem DM1 [20]. Przedstawiona przez nas terapia jest pierwszym tego rodzaju działaniem przeprowadzonym u człowieka, a jej wyniki potwierdzają celowość proponowanego podejścia również w leczeniu DM1 u ludzi. Dawka zastosowana w naszym badaniu była dawką o biologicznym znaczeniu, o czym świadczy wzrost poziomu komórek Tregs FoxP3+ we krwi obwodowej pacjentów. Wydaje się, że u podstaw pozytywnego biologicznego efektu zastosowanej przez nas metody leży sposób izolacji komórek Tregs. We wszystkich opublikowanych dotychczas badaniach klinicznych komórki Tregs pozyskiwano na drodze izolacji magnetycznej. Metoda ta pozwala na uzyskanie maksymalnie 60% czystości komórek Tregs FoxP3+, która podczas ekspansji in vitro spada nawet do 20% [11,12]. W związku z tym przynajmniej 40% komórek, które trafiają do pacjenta, nie jest komórkami Tregs. W tej sytuacji niezwykle trudne jest oszacowanie, ile spośród podawanych pacjentowi limfocytów wykazuje rzeczywiście właściwości immunosupresyjne. Wprowadzając sorter komórkowy do procedury pozyskiwania komórek Tregs otrzymujemy ~100% limfocytów o fenotypie CD3+CD4+CD25highCD127lowFoxP3+. Dzięki temu w dniu podania czystość preparatu wynosi nie 20, lecz 90%. Izolacja komórek z zastosowaniem sortera nie jest zatwierdzoną procedurą GMP. Użycie jednak nowych sorterów komórkowych z wymiennym układem rurek, przez które przepływa materiał biologiczny pacjenta, stawia ją pod względem bezpieczeństwa na równi z metodami immunomagnetycznymi. Należy również pamiętać, iż zastosowanie sortera komórkowego zapewnia znacznie wyższą precyzję izolacji niż technika magnetyczna, dlatego właśnie cytometria powinna stać się metodą z wyboru stosowaną do izolacji komórek w celach terapeutycznych. Kolejnym problemem, z którym spotykają się współczesne terapie komórkowe, jest ocena jakości i dawki terapeutycznej końcowego produktu ekspansji. W przypadku komórek Tregs powszechnie proponowanym w literaturze testem funkcjonalnym jest ocena hamowania proliferacji komórek Teff przez namnożone in vitro komórki Tregs. W naszej opnii test ten nie zapewnia miarodajnej oceny jakości komórek Tregs. Wynika to z faktu, że test trwa 5 7 dni. Po uzyskaniu wyniku testu rezultat jest już nieaktualny, ponieważ w ciągu kilku dni aktywność supresorowa komórek Tregs może zmienić się dramatycznie. W naszym badaniu zaproponowaliśmy analizę hamowania produkcji IFN-γ. Test ten został włączony do naszych kryteriów zwolnienia produktu, ponieważ jego wyniki są dostępne w ciągu godzin, dzięki czemu aktywność supresyjna komórek Tregs jest potwierdzana w dniu podania komórek pacjentowi. Nasze badanie ma jednak pewne ograniczenia. Wśród nich wymienić należy liczbę pacjentów poddanych terapii oraz czas obserwacji. Z tego względu nie można wykluczyć, że szybki początkowy spadek poziomu HbA1c u pacjentów był wynikiem poprawy ich stanu klinicznego oraz interwencji medycznej innej niż podanie komórek Tregs. Jednak nawet na tak wczesnym etapie kontroli, jak cztery miesiące, kiedy porównaliśmy naszych pacjentów z dokładnie wyselekcjonowaną grupą kontrolną, zaobserwowaliśmy istotną różnicę w poziomie dziennej dawki przyjmowanej insuliny oraz poziomie C-peptydu. Dalsza kontynuowana obserwacja, potwierdzi, czy obserwowany przez nas efekt jest trwałą remisją, czy jedynie opóźnieniem progresji choroby. Zgodnie z naszymi obserwacjami manewrowanie dawką komórek Tregs jest bezpiecznym i dobrze tolerowanym zabiegiem, który stanowi potencjalną metodę kontroli DM1. Podsumowując, nasze badania wskazują, że u dzieci ze świeżo rozpoznaną DM1 podanie autologicznych namnożonych in vitro limfocytów Tregs prowadzi do poprawy funkcji komórek β trzustki, o czym świadczy wyższy poziom C-peptydu u grupy chorych poddanych terapii. Wyniki te powinny zachęcić do dalszych badań klinicznych opartych na przedstawionej przez nas metodzie. Podziękowania Badanie zostało zrealizowane dzięki grantom Ministra Nauki i Szkolnictwa Wyższego (grant nr NN402-3530-38 oraz NR13-0126-10) oraz Fundacji Kościuszkowskiej (grant dla N.M.-T.). Autorzy nie zgłaszają konfliktów interesów. Pragną również podziękować pani Lucynie Szumacher-Sharma z Kliniki Pediatrii Hematologii Onkologii i Endokrynologii GUMed za Jej nieocenioną pomoc podczas pobierania krwi od pacjentów. 24

Marek-Trzonkowska N. i inni: Terapia limfocytami T regulatorowymi CD4 + CD25 high CD127 - chroni komórki ß trzustki w cukrzycy typu 1 u dzieci PIŚMIENNICTWO/REFERENCES [1] Jarosz-Chobot P., Polanska J., Szadkowska A. et al.: Rapid increase in the incidence of type 1 diabetes in Polish children from1989 to 2004, and predictions for 2010 to 2025. Diabetologia, 2011:54, 508-515. [2] Gepts W., Lecompte P.M.: The pancreatic islets in diabetes. Am. J. Med., 1981:70, 105-115. [3] Eisenbarth G.S.: Type I diabetes mellitus. A chronic autoimmune disease. N. Engl. J. Med., 1986:314, 1360-1368. [4] Bendelac A., Carnaud C., Boitard C. et al.: Syngeneic transfer of autoimmune diabetes from diabetic NOD mice to healthy neonates. Requirement for both L3T4+ and Lyt-2+ T cells. J. Exp. Med., 1987:166, 823-832. [5] Sakaguchi S., Sakaguchi N., Asano M. et al.: Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases. J. Immunol., 1995: 155, 1151-1164. [6] Salomon B., Lenschow D.J., Rhee L. et al.: B7/CD28 costimulation is essential for the homeostasis of the CD4+CD25+ immunoregulatory T cells that control autoimmune diabetes. Immunity, 2000:12, 431-440. [7] Green E.A., Gorelik L., McGregor C.M. et al.: CD4+CD25+ T regulatory cells control anti-islet CD8+ T cells through TGF-beta-TGFbeta receptor interactions in type 1 diabetes. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 2003:100, 10878-10883. [8] You S., Slehoffer G., Barriot S. et al.: Unique role ofcd4+cd62l+ regulatory T cells in the control of autoimmune diabetes in T cell receptor transgenic mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 2004:101 (Suppl. 2), 14580-14585. [9] Bennett C.L., Christie J., Ramsdell F. et al.: The immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, X-linked syndrome (IPEX) is caused by mutations of FOXP3. Nat. Genet., 2001:27, 20-21. [10] Trzonkowski P., Bieniaszewska M., Juscinska J. et al.: First-in-man clinical results of the treatment of patients with graft versus host disease with human ex vivo expanded CD4+CD25+CD127- T regulatory cells. Clin. Immunol., 2009:133, 22-26. [11] Di Ianni M., Falzetti F., Carotti A. et al.: Tregs prevent GVHD and promote immune reconstitution in HLA-haploidentical transplantation. Blood, 2011:117, 3921-3928. [12] Brunstein C.G., Miller J.S., Cao Q. et al.: Infusion of ex vivo expanded T regulatory cells in adults transplanted with umbilical cord blood: safety profile and detection kinetics. Blood, 2011:117, 1061-1070. [13] Alberti K.G., Zimmet P.Z.: Definition, diagnosis and classification of diabetes mellitus and its complications. Part 1: diagnosis and classification of diabetes mellitus provisional report of a WHO consultation. Diabet Med, 1998:15, 539-553. [14] Marek N., Bieniaszewska M., Krzystyniak A. et al.: The time is crucial for ex vivo expansion of T regulatory cells for therapy. Cell Transplant. 1 April 2011 [Epub ahead of print]. [15] Putnam A.L., Brusko T.M., Lee M.R. et al.: Expansion of human regulatory T-cells from patients with type 1 diabetes. Diabetes, 2009: 58, 652-662. [16] McClymont S.A., Putnam A.L., Lee M.R. et al.: Plasticity of human regulatory T cells in healthy subjects and patients with type 1 diabetes. J. Immunol., 2011:186, 3918-3926. [17] D Alise A.M., Auyeung V., Feuerer M. et al.: The defect in T-cell regulation innodmice is an effect on the T-cell effectors. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 2008:105, 19857-19862. [18] Schneider A., Rieck M., Sanda S. et al.: The effector T cells of diabetic subjects are resistant to regulation via CD4+ FOXP3+ regulatory T cells. J. Immunol., 2008:181, 7350-7355. [19] Velthuis J.H., Unger W.W., Abreu J.R. et al.: Simultaneous detection of circulating autoreactivecd8+ T-cells specific for different islet cell-associated epitopes using combinatorial MHC multimers. Diabetes, 2010:59, 1721-1730. [20] Bluestone J.A., Tang Q.: Therapeutic vaccination using CD4+CD25+ antigen-specific regulatory T cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 2004:101(Suppl. 2), 14622-14626. 25