Mikroorganizmy kolonizujące drewno w warunkach anoksji na stanowisku 4 w Biskupinie. Identyfikacja mikroflory i wstępna ocena degradacji drewna

Transkrypt

1 Julitta Gajewska, Agnieszka Sadowska, Leszek Babiński 1 Mikroorganizmy kolonizujące drewno w warunkach anoksji na stanowisku 4 w Biskupinie. Identyfikacja mikroflory i wstępna ocena degradacji drewna Microorganisms colonizing the wood at site 4 in Biskupin in conditions of anoxia. Identification of microflora and initial evaluation of the degradation of the wood I. WSTĘP 1 Po zakończeniu badań wykopaliskowych na terenie osiedla kultury łużyckiej w Biskupinie, zachowane fragmenty drewnianych konstrukcji osady pozostały na stanowisku. Część drewna wyeksponowano in situ. Reszta znajduje się w zalanych wodą wykopach lub pod powierzchnią ziemi. Pomimo wielu sezonów wykopaliskowych, znacznych ilości odsłanianych konstrukcji i dużego zainteresowania odwiedzających rezerwat turystów, w Muzeum Archeologicznym w Biskupinie nie stworzono profesjonalnej ekspozycji drewna wykopaliskowego. Zadanie to może być zrealizowane dopiero w przyszłości przy wykorzystaniu skuteczniejszych metod jego konserwacji. Do tego czasu konieczne jest monitorowanie warunków, w jakich zabytkowy materiał pozostaje. Drewno narażone jest na oddziaływanie szerokiego spektrum abiotycznych i biologicznych czynników destrukcyjnych (Zabel, Morrell 1992; Eaton, Hale 1993; Ważny 1993). W przypadku mokrego drewna archeologicznego głównym czynnikiem niszczącym są bakterie i grzyby. Potwierdzają to liczne badania przeprowadzone przy wykorzystaniu analizy mikroskopowej (Blanchette i in. 1990; Blanchette, Hoffmann 1994; Kim i in. 1996; Björdal i in. 1999). W drewnie znajdującym się w warunkach zbliżonych do beztlenowych najczęściej ob- 1 Julitta Gajewska, Agnieszka Sadowska Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie, Wydział Rolnictwa i Biologii; Leszek Babiński Muzeum Archeologiczne w Biskupinie, Dział Konserwacji Muzealiów. serwowano bakterie erozyjne. Bakterie tunelowe i grzyby rozkładu szarego pojawiają się głównie w zewnętrznych partiach obiektu, w których zawartość tlenu jest wyższa (Nilsson, Daniel 1992; Björdal i in. 1999). Z kolei obecność zgnilizny białej lub brunatnej związana jest z rozkładem drewna w okresie, w którym nie było ono jeszcze przesycone wodą (Nilsson, Daniel 1992) lub pozostawało na stanowisku przy okresowo zmieniających się stosunkach wilgotnościowych (Björdal, Nilsson 2002). W 2003 roku na stanowisku 4 w Biskupinie rozpoczęto badania interdyscyplinarne, których celem było określenie aktualnego stanu zachowania drewna biskupińskiego, rozpoznanie warunków, w jakich materiał ten pozostaje oraz zbadanie dynamiki jego rozkładu (Babiński 2009a). Badania mikroorganizmów zasiedlających drewno w warunkach analizowanego stanowiska przeprowadzone zostały początkowo na materiale zabytkowym (Gajewska i in. 2006). W celu określenia dynamiki rozkładu drewna, do monitorowanego stanowiska wprowadzono próbki współczesnego drewna dębu i sosny. Materiał ten wyjmowany jest co dwa lata. Badane są zmiany jego właściwości fizycznych i chemicznych (Babiński i in. 2006; Zborowska i in. 2007; Babiński 2009b; Zborowska i in. 2009). Oznaczane są także rodzaje i gatunki mikroorganizmów oraz ich liczebność. Wyniki badań mikrobiologicznych przeprowadzonych na próbkach wydobytych po dwóch i czterech latach przedstawiono we wcześniejszych publikacjach 329

2 Julitta Gajewska, Agnieszka Sadowska, Leszek Babiński (Gajewska i in. 2007a; Gajewska i in. 2007b; Gajewska i in. 2009; Gajewska i in. 2011). Celem niniejszej pracy była jakościowa i ilościowa identyfikacja mikroflory bakteryjnej i grzybowej kolonizującej współczesne drewno w czasie sześciu lat pozostawania w warunkach, w jakich zalegają drewniane pozostałości zabudowy osiedla. Wyniki badań mikrobiologicznych uzupełniła wstępna ocena stopnia degradacji drewna przeprowadzona na podstawie jego wybranych właściwości fizycznych i ubytku masy. II. MATERIAŁ I METODY II.1. Drewno Badania przeprowadzono na drewnie twardzieli dębu (Quercus sp.) i bielu sosny zwyczajnej (Pinus sylvestris L.). W eksperymencie użyto próbek o wymiarach mm (L T R). Podstawowe cechy makroskopowe materiału badawczego podano we wcześniejszych publikacjach (Babiński i in. 2006; Babiński 2009b). II.2. Eksperyment Próbki drewna nasycano wodą przez 10 dni w warunkach próżni (20 cykli nasycań przy ciśnieniu 50 hpa) do wilgotności około 60 65% w przypadku twardzieli dębu i około % dla bielu sosny. Na części nasyconych próbek kontrolnych oznaczono ubytek masy drewna, jaki wystąpił w wyniku ekstrakcji substancji rozpuszczalnych w zimnej wodzie. Mokre próbki drewna przemieszano z torfem, zapakowano po 20 sztuk do siatek z tworzywa i zakopano na stanowisku 4 w Biskupinie przy stacji pomiarowej SP1 w warstwie torfu na głębokości 100 cm (poziom drewnianych konstrukcji osiedla). Identyczną partię próbek umieszczono w torfie na dnie zalanego wodą wykopu ze stacją pomiarową SP4 (Babiński 2009a). Drewno pozostawało na stanowisku od sierpnia 2003 do sierpnia Po wydobyciu drewna poddano je badaniom mikrobiologicznym oraz określono ubytek substancji drzewnej i wybrane właściwości fizyczne. II.3. Badania mikrobiologiczne Do badań mikrobiologicznych wybrano losowo po jednej próbce drewna dębu i sosny ze stacji pomiarowych SP1 i SP4 oraz próbki otaczającej drewno gleby. Materiał badawczy z drewna pobierano w postaci wiórów pochodzących z zewnętrznej i wewnętrznej (z głębokości około 3 5 mm) warstwy próbki. Oceniano zdolność kolonizacji drewna przez bakterie właściwe, promieniowce, drożdże i grzyby mikroskopowe oraz ich występowanie w otaczającej glebie. Do badań zastosowano następujące podłoża: agar odżywczy (MLA), agar odżywczy z 10% dodatkiem odwłóknionej krwi baraniej, podłoże wg Bunta i Roviry hodowla bakterii oraz promieniowców, podłoże wg McConkey a różnicowanie bakterii lac (+) i lac (-) oraz izolacja drobnoustrojów z rodziny Enterobacteriaceae, podłoże EMB (Eosin Methylene Blue Agar) izolacja i różnicowanie gramujemnych drobnoustrojów z rodziny Enterobacteriaceae, podłoże wg Martina izolacja i hodowla mikroskopowych grzybów strzępkowych i drożdży, podłoże wg Sabourand identyfikacja grzybów, podłoże wg Chapek-Doxa identyfikacja grzybów, podłoże Kinga B izolacja bakterii z rodzaju Pseudomonas, podłoże wg Wilsona-Blair a izolacja i hodowla bakterii Clostridium perfringens, podłoże wg Dubos a izolacja i hodowla tlenowych bakterii celulolitycznych, podłoże wg Weimer i Zeikus z dodatkiem bibuły filtracyjnej jako jedynego źródła węgla izolacja i hodowla beztlenowych bakterii celulolitycznych (mezo- i termofilnych), podłoże wg Pochona hodowla promieniowców, podłoże wg Wrzoska hodowla przetrwalnikujących bakterii beztlenowych, podłoże MSA (Mannitol Salt Agar) różnicowanie gronkowców koagulazododatnich (np. Staphylococcus aureus) i gronkowców koagulazoujemnych. Hodowle bakterii beztlenowych mezofilnych prowadzono w temperaturze 30 C, a termofilnych w temperaturze C. Przynależność gatunkową wyizolowanych szczepów bakterii oceniano na podstawie cech morfologicznych i biochemicznych. Charakterystykę morfologiczną przeprowadzono na podstawie oceny wzrostu mikroorganizmów na różno- 330

3 Mikroorganizmy kolonizujące drewno w warunkach anoksji na stanowisku 4 w Biskupinie... rodnych podłożach oraz obserwacji preparatów mikroskopowych. Preparaty obserwowano pod mikroskopem po wcześniejszym wybarwieniu ich metodą Grama, Ziehl-Neelsena oraz barwieniu negatywnym nigrozyną. Charakterystykę biochemiczną i fizjologiczną badanych szczepów prowadzono w oparciu o testy kodowe API firmy BioMerieux. Testy wykonane były zgodnie z instrukcją producenta. Po 24 i 48 godzinach testy odczytywano i na podstawie wyników tworzono siedmiocyfrowe kody, odpowiadające poszczególnym rodzajom i gatunkom bakterii opisanych w katalogach API. Analizy dokonano przy użyciu następujących testów: API 20E identyfikacja bakterii z rodzaju Enterobacteriaceae i innych pałeczek gramujemnych o niewysokich wymaganiach odżywczych, API 20A identyfikacja bakterii beztlenowych, API 20NE identyfikacja gramujemnych, niejelitowych pałeczek niefermentujących o niewysokich wymaganiach odżywczych, API 50CH zestaw asymilacyjnych testów identyfikacyjnych (5). Niektóre szczepy bakterii identyfikowano według Bergey s Manual of Systematic Bacteriology (Bergey 2001). Oceny gatunkowej wyizolowanych grzybów mikroskopowych oraz drożdży dokonano na podstawie obserwacji cech morfologicznych. Cechy te określano w oparciu o wzrost kolonii na podłożach stałych oraz obserwację preparatów przyżyciowych. Identyfikację wyizolowanych grzybów i drożdży przeprowadzono przy pomocy klucza opracowanego przez O. Fassatiová (1983). Do oznaczenia ogólnej liczby bakterii w analizowanych próbkach drewna i gleby wykorzystano metodę płytkową posiewu wgłębnego z zastosowaniem stałego podłoża wg Bunta i Roviry. Z każdej zawiesiny rozcieńczonej dziesięciokrotnie pobierano 1 ml i wysiewano go na szalki w dwóch powtórzeniach. Szalki inkubowano przez 48 godzin w temperaturze 37 C, a następnie policzono wyrosłe kolonie, wybierając płytki, na których wyrosło od 10 do 300 kolonii. Próbki drewna pobrano w odpowiednio mniejszych proporcjach. Metoda oznaczania liczby drobnoustrojów przez posiew na podłoże stałe zakłada, że liczba powstających kolonii odpowiada liczbie żywych komórek w badanej próbie. Dlatego wynik przeliczono na jtk (jednostka tworząca kolonię)/1 g analizowanej próbki. Ogólną liczbę tlenowych mezofilnych bakterii celulolitycznych określano metodą trójprobówkową. Z przygotowanych sześciu rozcieńczeń wykonano posiewy na płynne podłoże Dubos a, które inkubowano przez 7 dni w temperaturze 30 C. Za wynik pozytywny przyjęto zmianę zabarwienia pożywki na żółty oraz częściowy rozkład bibuły filtracyjnej. Jeżeli wynik negatywny występował we wszystkich trzech powtórzeniach dla danego rozcieńczenia, oznaczano go jako 0, jedna próba pozytywna 1, dwie próby pozytywne 2, trzy próby pozytywne 3. Wynik odczytano z tablic McCrady ego (Meynell, Meynell 1970). Ogólną liczbę beztlenowych mezofilnych oraz termofilnych bakterii celulolitycznych oznaczono metodą trójprobówkową. Z przygotowanych rozcieńczeń pobrano po 1 ml i przeniesiono do trzech probówek (dla każdego rozcieńczenia). Hodowle beztlenowych mezofilnych bakterii celulolitycznych inkubowano w temperaturze 30 C, natomiast probówki z hodowlą bakterii termofilnych w temperaturze około 60 C przez 7 dni. Za wynik pozytywny przyjęto zmianę zabarwienia podłoża (rezazuryna jako wskaźnik) oraz częściowy rozkład paska bibuły. Po inkubacji dokonano oceny i charakterystyki liczbowej wzrostu, a wynik odczytano w analogiczny sposób jak w przypadku oceny ogólnej liczby tlenowych mezofilnych bakterii celulolitycznych. II.4. Właściwości fizyczne i ubytek masy drewna Wydobyte próbki mokrego drewna oczyszczano z torfu, ważono i nasycano wodą w komorze próżniowej (50 hpa). Drewno nasycone do wilgotności maksymalnej ważono w powietrzu i w wodzie, a następnie suszono w temperaturze C do absolutnie suchej masy. Ważenia wykonywano z dokładnością do 0,0001 g. Uzyskane wyniki posłużyły do obliczenia wilgotności, wilgotności maksymalnej, gęstości umownej, porowatości oraz ubytku substancji drzewnej. Wilgotność drewna (W) określano jako procentowy stosunek masy wody w drewnie i absolutnie suchej masy drewna. Wilgotność maksymalną (W max ) przedstawiano jako procentowy stosunek maksymalnej masy wody (jaką można wprowadzić do badanego drewna) 331

4 Julitta Gajewska, Agnieszka Sadowska, Leszek Babiński i absolutnie suchej masy drewna. Gęstość umowną drewna (ρ u ) określano jako stosunek masy próbki absolutnie suchej i jej objętości w stanie maksymalnego nasycenia wodą. Porowatość drewna (P) określano jako procentowy stosunek objętości wszystkich porów w drewnie i objętości zajmowanej przez drewno w stanie maksymalnego nasycenia. Właściwości fizyczne drewna po 6 latach przebywania w warunkach stanowiska porównano z właściwościami próbek kontrolnych. Ubytek masy drewna (UM) obliczano na podstawie wzoru: UM = m 0 m m 0 gdzie: UM ubytek masy (%), m 0 masa drewna absolutnie suchego przed zakopaniem (g), m 1 masa drewna absolutnie suchego po wydobyciu (g). III. WYNIKI BADAŃ III.1. Badania mikrobiologiczne Bakterie wyizolowane z gleby i drewna zakopanego przy stacjach SP1 i SP4 przedstawiono w tabelach 1 i 2. Z torfu pobranego ze stacji SP1 wyizolowano 16 gatunków bakterii. Drewno było uboższe we florę bakteryjną. Zewnętrzną warstwę drewna dębu zasiedlało 12, a zewnętrzną warstwę drewna sosny 15 gatunków. Zdecydowanie mniejszą różnorodność flory bakteryjnej odnotowano w wewnętrznych strefach próbek (5 gatunków dla drewna dębu i 8 gatunków dla próbek sosnowych) (tab. 1). Z gleby pobranej ze stacji SP4 wyizolowano 21 gatunków bakterii. Zewnętrzne warstwy drewna zostały skolonizowane przez 12 (dąb) i 14 (sosna), podczas gdy wewnętrzne części próbek zasiedlało już tylko 6 (dąb) i 9 (sosna) gatunków (tab. 2). Tab. 1. Bakterie wyizolowane z próbek gleby i drewna zakopanego przy stacji SP1 Table 1. Bacteria isolated from soil and wood samples buried at SP1 station próbka / sample G1 Dz1 Dw1 Sz1 Sw1 bakterie / bacteria fluorescens, Aeromonas hydrophila/caviae, Bacillus lentus, Bacillus mycoides, Burkholderia cepacia, Pantoea sp., Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, Pseudomonas stutzeri, Sphingomonas paucimobilis, Sporocytophaga sp., Streptomyces sp., Cellulomonas sp., Brevundimonas vesicularis fluorescens, Aeromonas hydrophila/caviae, Burkholderia cepacia, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas alcaligenes, Pseudomonas luteola, Pseudomonas putida, Pseudomonas stutzeri, Sporocytophaga sp., Streptomyces sp. fluorescens, Aeromonas hydrophila/caviae, Sporocytophaga sp. fluorescens, Aeromonas hydrophila/caviae, Bacillus lentus, Bacillus mycoides, Pantoea sp., Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas alcaligenes, Pseudomonas putida, Pseudomonas stutzeri, Sphingomonas paucimobilis, Sporocytophaga sp., Streptomyces sp., Cellulomonas sp. fluorescens, Aeromonas hydrophila/caviae, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas alcaligenes, Pseudomonas putida, Sporocytophaga sp. Oznaczenie próbek ze stacji SP1: G1 gleba; Dz1 drewno dębu, warstwa zewnętrzna; Dw1 drewno dębu, warstwa wewnętrzna; Sz1 drewno sosny, warstwa zewnętrzna; Sw1 drewno sosny, warstwa wewnętrzna. Symbols of samples from SP1 station: G1 soil; Dz1 oak wood, outer zone; Dw1 oak wood, inner zone; Sz1 pine wood, outer zone; Sw1 pine wood, inner zone. 332

5 Mikroorganizmy kolonizujące drewno w warunkach anoksji na stanowisku 4 w Biskupinie... Tab. 2. Bakterie wyizolowane z próbek gleby i drewna zakopanego przy stacji SP4 Table 2. Bacteria isolated from soil and wood samples buried at SP4 station próbka / sample G4 Dz4 Dw4 Sz4 Sw4 bakterie / bacteria Clostridium perfringens redukujące siarczyny, Escherichia coli, Bacillus polymyxa, Pseudomonas fluorescens, Aeromonas hydrophila/caviae, Enterobacter cloace, Alcaligenes faecalis, Bacillus lentus, Bacillus mycoides, Brevundimonas vesicularis, Burkholderia cepacia, Pantoea sp., Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas alcaligenes, Pseudomonas luteola, Pseudomonas putida, Pseudomonas stutzeri, Sphingomonas paucimobilis, Sporocytophaga sp., Streptomyces sp., Brevundimonas vesicularis Clostridium perfringens redukujące siarczyny, Escherichia coli, Bacillus polymyxa, Bacillus mycoides, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas luteola, Pseudomonas putida, Aeromonas hydrophila/caviae, Clostridium thermocellum, Streptomyces sp., Brevundimonas vesicularis, Cellulomonas sp. fluorescens, Aeromonas hydrophila/caviae, Sporocytophaga sp., Cellulomonas sp. Clostridium perfringens redukujące siarczyny, Escherichia coli, Bacillus polymyxa, Pseudomonas fluorescens, Aeromonas hydrophila/caviae, Clostridium thermocellum, Pantoea sp., Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas alcaligenes, Pseudomonas luteola, Pseudomonas putida, Sporocytophaga sp., Streptomyces sp., Cellulomonas sp. fluorescens, Clostridium thermocellum, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas alcaligenes, Pseudomonas luteola, Pseudomonas stutzeri, Sporocytophaga sp. Oznaczenie próbek ze stacji SP4: G4 gleba; Dz4 drewno dębu, warstwa zewnętrzna; Dw4 drewno dębu, warstwa wewnętrzna; Sz4 drewno sosny, warstwa zewnętrzna; Sw4 drewno sosny, warstwa wewnętrzna. Symbols of samples from SP4 station: G4 soil; Dz4 oak wood, outer zone; Dw4 oak wood, inner zone; Sz4 pine wood, outer zone; Sw4 pine wood, inner zone. W tabeli 3 podano Najbardziej Prawdopodobną Liczbę bakterii występujących w próbkach drewna i gleby. Większą liczebność bakterii odnotowano w materiale (gleba, drewno) ze stacji SP4. Ogólna liczba bakterii występujących w glebie ze stacji SP1 była o rząd wielkości niższa od ogólnej liczby bakterii w glebie ze stacji SP4. Różnice w liczebności bakterii odnotowano także w przypadku zewnętrznych i wewnętrznych warstw drewna z obydwu stacji pomiarowych. Mniejsze różnice zaobserwowano natomiast w przypadku liczebności tlenowych mezofilnych bakterii celulolitycznych występujących w analogicznych próbkach drewna z obydwu stacji pomiarowych (tabela 3). Wyniki badań należą do tego samego rzędu wielkości. Podobnie jak w przypadku ogólnej liczby bakterii, ilość tlenowych mezofilnych bakterii celulolitycznych w wewnętrznych warstwach próbek była niższa niż w powierzchniowej strefie drewna. Można jednak stwierdzić, że dla takich samych warstw drewna różnica w liczebności rozpatrywanych bakterii w obydwu stacjach nie jest tak duża, jak w przypadku ogólnej liczby bakterii. Podobna sytuacja ma miejsce także dla gleby ze stacji SP1 i SP4. Wyniki te są jednak nieznacznie tylko większe w porównaniu z badanym drewnem i oscylują na podobnym poziomie. W analogicznych warstwach drewna i gleby ze stacji SP1 i SP4 Najbardziej Prawdopodobna Liczba beztlenowych mezofilnych bakterii celulolitycznych (tab. 3) była o rząd wielkości wyższa niż dla tlenowych mezofilnych bakterii celulolitycznych. Nie stwierdzono również różnicy w liczebności bakterii beztlenowych zasiedlających materiał pobrany z obydwu stacji pomiarowych. 333

6 Julitta Gajewska, Agnieszka Sadowska, Leszek Babiński próbka / sample Tab. 3. Najbardziej Prawdopodobna Liczba (NPL) tlenowych i beztlenowych bakterii celulolitycznych w próbkach gleby i drewna Table 3. The Most Probable Number (MPN) of cellulolytic aerobic and anaerobic bacteria in soil and wood samples bakterie ogółem / bacteria total bakterie tlenowe mezofilne / aerobic mesophilic bacteria NPL / MPN bakterie beztlenowe mezofilne / anaerobic mesophilic bacteria bakterie beztlenowe termofilne / anaerobic thermophilic bacteria G1 5, , , , Dz1 8, , , , Dw1 6, , , Sz1 7, , , , Sw1 9, , , G4 6, , , , Dz4 8, , , , Dw4 9, , , Sz4 9, , , , Sw4 6, , , Oznaczenie próbek jak w tab. 1 i 2. Symbols of Samples as in Table 1 and 2. Tab. 4. Grzyby i drożdże wyizolowane z próbek gleby i drewna Table 4. Fungi and yeasts isolated from soil and wood samples próbka / sample G1 Dz1 Dw1 Sz1 Sw1 G4 Dz4 Dw4 Sz4 Sw4 grzyby i drożdże / fungi and yeasts Aspergillus sp., Aspergillus niger, Penicillium roqueforti, Trichoderma viride Aspergillus sp. Aspergillus sp., Aspergillus niger, Trichoderma viride Aspergillus sp., Trichoderma viride Aspergillus sp., Aspergillus niger, Candida albicans, Penicillium roqueforti, Trichoderma viride Aspergillus sp., Aspergillus niger, Candida albicans, Penicillium roqueforti, Trichoderma viride Aspergillus sp., Aspergillus niger, Trichoderma viride Aspergillus sp., Aspergillus niger, Candida albicans, Penicillium roqueforti, Trichoderma viride Aspergillus sp., Aspergillus niger, Penicillium roqueforti, Trichoderma viride Oznaczenie próbek jak w tab. 1 i 2. Symbols of Samples as in Table 1 and

7 Mikroorganizmy kolonizujące drewno w warunkach anoksji na stanowisku 4 w Biskupinie Zewnętrzne partie próbek drewna dębu i sosny były zasiedlone na podobnym poziomie jak otaczająca je gleba. Mniej bakterii stwierdzono natomiast w wewnętrznych warstwach próbek drewna. Beztlenowe termofilne bakterie celulolityczne nie występowały w wewnętrznych partiach drewna (tab. 3). W pozostałych przypadkach (warstwy zewnętrzne drewna, gleba) zaobserwowano te same tendencje jak dla beztlenowych bakterii mezofilnych, lecz Najbardziej Prawdopodobna Liczba bakterii termofilnych była aż o dwa rzędy wielkości mniejsza. Wyniki badań mykologicznych przedstawiono w tabeli 4. Gleba ze stacji SP1 zawierała 4 rodzaje mikroorganizmów. Zewnętrzna strefa drewna dębu została skolonizowana jedynie przez Aspergillus sp., a wewnętrzne partie próbki były wolne od grzybów. Z powierzchniowej warstwy drewna sosny wyizolowano trzy gatunki, natomiast do głębszych partii próbki wniknęły tylko Aspergillus sp. oraz Trichoderma viride. Materiał pobrany ze stacji SP4 charakteryzował się większą różnorodnością występujących grzybów. Z gleby wyizolowano pięć mikroorganizmów. Poza grzybami zasiedlającymi glebę ze stacji SP1, stwierdzono także obecność Candida albicans. Zewnętrzne warstwy drewna dębu i sosny zostały skolonizowane przez te same mikroorganizmy, jakie wyizolowano z otaczającej je gleby. Natomiast wewnętrzna strefa drewna dębu została zasiedlona przez Aspergillus sp., Aspergillus niger i Trichoderma viride, a wewnętrzna strefa próbki sosnowej zawierała dodatkowo Penicillium roqueforti. III.2. Właściwości fizyczne i ubytek masy drewna Właściwości fizyczne i ubytki masy badanego drewna dębu i sosny podano w tabeli 5. Po sześciu latach pozostawania w mokrym torfie wzrosła wilgotność drewna. Wzrost zawartości wody w drewnie dębu (od wilgotności początkowej wynoszącej około 60 65%) wynikał głównie z długiego okresu eksperymentu, a w mniejszym stopniu z rozkładu i związanego z nim wzrostu porowatości badanego materiału. Jednocześnie wilgotność drewna dębu kształtowała się na poziomie jego wilgotności maksymalnej. Wilgotność bielu sosny uległa także podwyższeniu (od początkowej zawartości wody wynoszącej około %). W mokrym drewnie sosny znajdowała się jednak pewna ilość powietrza. Świadczy o tym wzrost wilgotności drewna wynoszący około 9 punktów procentowych, odnotowany po impregnacji próbek w warunkach próżni. Porównując właściwości fizyczne drewna dębu i sosny ze stacji SP1 i SP4, zaobserwowano, że dla obydwu rodzajów drewna wyższe wilgotności maksymalne i porowatości oraz niższe gęstości umowne występują w przypadku materiału wydobytego ze stacji SP4. Może to świadczyć o większej degradacji drewna pozostawionego w dennej warstwie zalanego wodą wykopu. Z drugiej strony, zarejestrowane różnice są niewielkie i mogą również wynikać z niejednorodności materiału badawczego. Zdecydowanie lepszym wskaźnikiem zaawansowania rozkładu tkanki drzewnej jest ubytek masy. W badanym materiale ubytki masy są nieco większe dla drewna pozostawionego przy stacji SP4. Porównując ubytki masy dla obydwu rodzajów drewna, można stwierdzić, że zdecydowanie odporniejszym na procesy rozkładu było drewno twardzieli dębu. W przypadku obydwu miejsc zakopania próbek ubytki masy drewna dębu były około trzykrotnie mniejsze niż ubytki masy bielu sosny. W rzeczywistości ubytki masy drewna dębu były mniejsze o około 1, a ubytki masy drewna sosny mniejsze o około 0,5 punktu procentowego od wartości podanych w tab. 5. Wynikało to z ekstrakcji części substancji rozpuszczalnych w wodzie jeszcze w czasie impregnacji próbek przed ich zakopaniem na stanowisku (Babiński i in. 2006; Babiński 2009b). Na podstawie wyników wcześniejszych badań ustalono, że ubytek masy drewna dębu pozostawionego przez cztery lata w torfie przy stacjach SP1 i SP4 wynosił odpowiednio 2,3% i 2,6%. W przypadku bielu sosny ubytek masy wynosił dwukrotnie więcej (4,7% dla próbek przy SP1 i 5,3% dla próbek przy SP4) (Babiński 2009b). Po sześciu latach pozostawania na stanowisku, ubytek masy drewna dębu nie uległ wyraźnej zmianie, natomiast ubytek masy drewna bielu sosny zwiększył się o około 50% (próbki przy SP1) i wzrósł do 9,2% (próbki przy SP4) (tab. 5). 335

8 Julitta Gajewska, Agnieszka Sadowska, Leszek Babiński nej strefie próbki drewna. W głębszych warstwach drewna zmniejszała się różnorodność i liczba wyizolowanych gatunków. Na podstawie zestawionych wartości można wysunąć wniosek, że niezależnie od tego, w jakiej stacji pomiarowej były pozostawione próbki drewna, zawsze zachodzi analogiczna zależność dotycząca ogólnej liczby bakterii. Jest ona związana z możliwościami pepróbki / samples Tab. 5. Właściwości fizyczne i ubytek masy drewna Table 5. Physical properties and mass loss of wood W (%) W max (%) ρ u (kg m -3 ) dąb, SP1 min ,1 2,1 oak, SP1 max ,5 3,0 x , 1 2, 4 s , 3 0, 2 dąb, SP4 min ,9 1,8 oak, SP4 max ,7 3,2 x , 4 2, 7 s , 6 0, 3 dąb, kontrolne min oak, control max x s 3 35 sosna, SP1 min ,6 6,5 pine, SP1 max ,4 10,5 x , 2 7, 6 s , 4 1, 0 sosna, SP4 min ,9 7,3 pine, SP4 max ,7 10,5 x , 0 9, 2 s , 1 1, 0 sosna, kontrolne min pine, control max x s Właściwości fizyczne: W wilgotność, W max wilgotność maksymalna, ρ u gęstość umowna, P porowatość, UM ubytek masy. Physical properties: W moisture content, W max maximum moisture content, ρ u basic density, P porosity, UM mass loss. Wartości statystyczne: min wartość minimalna, max wartość maksymalna, x wartość średnia, s odchylenie standardowe. Statistical values: min minimum, max maximum, x mean, s standard deviation. P (%) UM (%) IV. DYSKUSJA Wyniki przeprowadzonych badań mikrobiologicznych wykazały dużą różnorodność bakterii i promieniowców kolonizujących zakopane drewno i otaczającą je glebę. Obserwowano różnice w składzie gatunkowym mikroorganizmów występujących w glebie, oraz zewnętrznej i wewnętrz- 336

9 Mikroorganizmy kolonizujące drewno w warunkach anoksji na stanowisku 4 w Biskupinie netracji bakterii z gleby do drewna. Pomiędzy kolejnymi miejscami kolonizacji (gleba zewnętrzna strefa próbki drewna wewnętrzna strefa próbki drewna) różnica w liczebności bakterii jest o jeden rząd wielkości niższa w stosunku do poprzedniej warstwy. Wyraźne różnice w liczebność bakterii oraz ilość gatunków bakterii i grzybów zasiedlających powierzchniowe i wewnętrzne strefy próbek odnoszą się do warstw drewna oddalonych zaledwie o 3 5 mm. Należy przypuszczać, że różnice w ilościowym i jakościowym składzie mikroflory występują także w zabytkowym drewnie biskupińskim (tym bardziej, że jest to głównie trudno nasycalna twardziel dębu, a odległość między powierzchnią i centralną częścią przekroju poprzecznego obiektu może przekraczać nawet 10 cm). Potwierdzają to badania wykonane na próbkach drewna dębu biskupińskiego pobieranych z różnych głębokości (Ważny 1976; Gajewska i in. 2006). Można również przyjąć, że z uwagi na niższą liczebność mikroorganizmów zasiedlających wewnętrzne strefy drewna, ich rozkład będzie następował wolniej niż degradacja powierzchniowych warstw zabytku. Na ścisły związek pomiędzy stopniem rozkładu tkanki drzewnej i odległością od powierzchni wskazują liczne odkrycia zabytkowych obiektów wykonanych z drewna dębu. Gleba torfowa, w której pozostają zachowane fragmenty konstrukcji osiedla, charakteryzuje się neutralnym (SP1) lub lekko alkalicznym (SP4) odczynem oraz niskim potencjałem oksydoredukcyjnym (Babiński i in. 2007; Babiński, Fejfer 2009; Zmiany wybranych w tym tomie). Środowisko takie określane jest jako silnie redukcyjne (Patrick, Mahapatra 1968). Panujące w nim warunki zbliżone są do beztlenowych, a rozkład materiałów organicznych jest niewielki. Badane próbki drewna pozostawały w czasie eksperymentu poniżej poziomu wody gruntowej. Wykluczało to rozwój grzybów powodujących biały lub brunatny rozkład drewna. Osuszenie warstwy gleby, w której znajdują się pozostałości osady, może doprowadzić do zasiedlenia zabytkowego drewna przez podstawczaki i szybkiej jego degradacji (Björdal, Nilsson 2002). Pomimo kilkuletniego okresu zalegania w warunkach mokrego torfu, stopień degradacji badanego drewna trudno ocenić jedynie na podstawie jego właściwości fizycznych lub podstawowego 10 drewno d bu - oak wood 8 drewno sosny - pine wood Ubytek masy (%) Mass loss (%) lata/years SP1 2 lata/years SP4 4 lata/years SP1 4 lata/years SP4 6 lat/years SP1 6 lat/years SP4 Ryc. 1. Ubytki masy drewna współczesnego zakopanego na stanowisku 4 w Biskupinie Fig. 1. Mass losses in fresh wood buried at the archaeological site 4 in Biskupin 337

10 Julitta Gajewska, Agnieszka Sadowska, Leszek Babiński składu chemicznego. O niewielkim zakresie zmian świadczy porównanie wyników badań przeprowadzonych obecnie i w latach poprzednich (Babiński i in. 2006; Zborowska i in. 2007; Babiński 2009b; Zborowska i in. 2009). Zmiany zachodzące w drewnie zdecydowanie wyraźniej widać na podstawie ubytku masy drewna. Ubytek masy drewna następował w wyniku rozkładu chemicznych składników drewna (głównie układu hemicelulozowego), ale także ekstrakcji substancji rozpuszczalnych w zimnej wodzie. Na podstawie wyników badań przeprowadzonych obecnie i w latach wcześniejszych (Babiński 2009b) stwierdzono, że jedynie w przypadku bielu drewna sosny przyrost ubytku masy następował wraz z czasem przebywania próbek na stanowisku (ryc. 1). Wyniki uzyskane po dwóch, czterech i sześciu latach mają tu wyraźną tendencję wzrostową. Natomiast dla zdecydowanie trwalszego twardzielowego drewna dębu, po czterech i sześciu latach przebywania na stanowisku, nie obserwowano już wyraźnego wzrostu ubytku substancji drzewnej. Trudno jednak ocenić, czy wynika to tylko z braku rozkładu materiału tworzącego ściany komórkowe, czy niewielkiego tempa jego degradacji, połączonego ze zmianami chemicznymi, które na obecnym etapie nie powodują jeszcze zmian masy drewna. Odpowiedzi na to pytanie należy szukać w wynikach badań przeprowadzonych przy wykorzystaniu instrumentalnej analizy chemicznej, w tym warstw drewna pochodzących zarówno z powierzchniowej, jak i wewnętrznej strefy próbki (różniących się liczebnością zasiedlających je mikroorganizmów). V. WNIOSKI Próbki współczesnego drewna twardzieli dębu (Quercus sp.) i bielu sosny zwyczajnej (Pinus sylvestris L.) pozostawione przez sześć lat w warunkach stanowiska 4 w Biskupinie zostały skolonizowane przez szerokie spektrum celulolitycznej, tlenowej i beztlenowej, mikroflory bakteryjnej i grzybowej występującej w glebie (torfie), w której znajdują się zachowane fragmenty osiedla kultury łużyckiej. Spośród wyizolowanych mikroorganizmów największym zagrożeniem dla drewna są szczepy bakterii celulolitycznych z rodzajów: Bacillus, Pseudomonas, Sporocytophaga, Clostridium oraz grzyby z rodzajów: Penicillium, Trichoderma i Aspergillus. Liczba występujących mikroorganizmów i ubytek masy drewna pozostawionego w dennej warstwie zalanego wodą wykopu (stacja SP4) są wyraźnie większe w porównaniu z wynikami uzyskanymi dla materiału zakopanego w glebie torfowej przy stacji SP1. Może to być związane z lekko alkalicznym odczynem wody wypełniającej wykopy w północnej części półwyspu Jeziora Biskupińskiego. Utrzymywanie wysokiego poziomu wody w jeziorze otaczającym stanowisko może w znaczący sposób ograniczyć stopień kolonizacji degradujących drewno mikroorganizmów i zapewnić optymalne warunki do przetrwania drewnianej zabudowy biskupińskiego osiedla. Wzrost zawartości tlenu oraz wyższa temperatura wody i gleby mogą powodować intensywniejszy rozwój mikroorganizmów i zwiększyć dynamikę degradacji materiału drzewnego pozostającego na stanowisku. BIBLIOGRAFIA SKRÓTY BIBLIOGRAFICZNE Stan i perspektywy L. Babiński (red.), Stan i perspektywy zachowania drewna biskupińskiego, Biskupińskie Prace Archeologiczne nr 7, Biskupin. Babiński L. 2009a Geneza i zakres badań nad stanem i perspektywami zachowania drewna wykopaliskowego na stanowisku nr 4 w Biskupinie, (w:) Stan i perspektywy, s b Zmiany właściwości fizycznych i ubytek masy współczesnego drewna dębu i sosny pozostawionego na stanowisku nr 4 w Biskupinie, (w:) Stan i perspektywy, s Babiński L., Fejfer M Monitorowanie wybranych parametrów środo wiska na stanowisku nr 4 w Biskupinie, (w:) Stan i perspektywy, s Babiński L., Fejfer M., Prądzyński W Environmental monitoring at the Lusatian culture settlement in Biskupin, Poland, Journal of Wetland Archaeology, 7, s

11 Mikroorganizmy kolonizujące drewno w warunkach anoksji na stanowisku 4 w Biskupinie Babiński L., Zborowska M., Gajewska J., Waliszewska B., Prądzyński W Decomposition of the contemporary oak wood (Quercus sp.) in conditions of the wet archaeological site in Biskupin, Folia Forestalia Polonica, Seria B, 37, s Bergey 2001 Bergey s Manual of Systematic Bacteriology, Bergey s Manual Trust, 2nd edition, Springer Verlag. Björdal C.G., Nilsson T Waterlogged archaeological wood a substrate for white rot fungi during drainage of wetlands, International Biodeterioration and Biodegradation, 50, s Björdal C.G., Nilsson T., Daniel G Microbial decay of waterlogged archaeological wood found in Sweden, International Biodeterioration and Biodegradation, 43, s Blanchette R.A., Hoffmann P Degradation processes in waterlogged archaeological wood, (w:) P. Hoffmann, T. Daley, T. Grant (red.), Proceedings of the 5th ICOM- -WOAM Conference, Portland/Maine 1993, Bremerhaven, s Blanchette R.A., Nilsson T., Daniel G., Abad A.R Biological degradation of wood, (w:) R.M. Rowell, R.J. Barbour (red.), Archaeological Wood: Properties, Chemistry and Preservation, Advances in Chemistry, Series 225, Washington DC, s Eaton R.A., Hale M.D.C Wood: Decay, Pests and Protection, London. Fassatiová O Grzyby mikroskopowe w mikrobiologii technicznej, Warszawa. Gajewska J., Borkowski A., Babiński L Degradation of oak wood from flooded archaeological trenches in Biskupin, Polish Journal of Environmental Studies, 5d, vol. 15, part II, s Gajewska J., Jacak P., Babiński L Badania mikrobiologiczne współczesnego drewna dębu i sosny po czterech latach zalegania w glebie na stanowisku nr 4 w Biskupinie, (w:) Stan i perspektywy, s Influence of anoxic condition on the composition of microorganisms colonized a contemporary wood samples in archaeological site in Biskupin, Ecological Chemistry and Engineering A, 18 (2), s Gajewska J., Kostecka J., Babiński L. 2007a Mikroorganizmy zasiedlające współczesne drewno dębu (Quercus sp.) zalegające w warunkach mokrego stanowiska archeologicznego w Biskupinie, Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych, 520, cz. II, s b Mikroorganizmy zasiedlające współczesne drewno sosny (Pinus sylvestris L.) w glebie torfowej stanowiska archeologicznego w Biskupinie, Acta Agraria et Silvestria, Series Silvestris, 45, s Kim Y.S., Singh A.P., Nilsson T Bacteria as important degraders in waterlogged archaeological woods, Holzforschung, 50, s Meynell G.G., Meynell G Theory and practice in experimental bacteriology, 2nd edition, Cambridge. Nilsson T., Daniel G Preservation of basidiomycete hyphae in ancient waterlogged wood materials, International Research Group on Wood Preservation, IRG/ WP/ Patrick W.H.Jr., Mahapatra I.C Transformation and availability to rice of nitrogen and phosphorus in waterlogged soils, Advances in Agronomy, 20, s Ważny J Deterioration of ancient wood in Biskupin archaeological excavations, Material und Organismen, 3, s The present classification of wood degradation factors, Folia Forestalia Polonica, seria B, 24, s Zabel R.A., Morrell J.J Wood Microbiology: Decay and its Prevention, San Diego. Zborowska M., Babiński L., Gajewska J., Waliszewska B., Prądzyński W Physical and chemical properties of contemporary pine wood (Pinus sylvestris L.) in conditions of a wet archaeological site in Biskupin, Folia Forestalia Polonica, Seria B, 38, s Zborowska M., Prądzyński W., Waliszewska B Zmiany składu chemicznego współczesnego drewna sosny (Pinus sylvestris L.) i dębu (Quercus sp.) w warunkach mokrego stanowiska archeologicznego w Biskupinie po dwu- i czteroletnim okresie zalegania, (w:) Stan i perspektywy, s

12 Julitta Gajewska, Agnieszka Sadowska, Leszek Babiński Summary The object of the research being presented here was to identify the microorganisms which are endangering the wooden structures of the Lusatian culture settlement at Biskupin and to evaluate the dynamics of the decomposition process under anoxic conditions. Tests were carried out on samples of fresh oak (Quercus sp.) and Scots pine (Pinus sylvestris L.), left for six years in conditions in which the Biskupin timber is lying. Samples mm were buried at a depth of 100 cm in a layer of peat lying below groundwater level (by measurement station SP1) and at the bottom of a water-filled trench in the northern part of the site (by station SP4). The introduced test material remained in the neighbourhood of the preserved wooden settlement structures. It was possible to identify bacterial and fungal microflora colonizing the wood and surrounding soil. Eubacteria, actinomycetes, fungi and yeasts were identified in the external and internal wood sample zone and the Most Probable Number (MPN) method was used to estimate aerobic and anaerobic cellulolytic, mezo and thermophilic bacteria, inhabiting the investigated material. The physical properties (maximum moisture content, basic density and porosity of the buried wood was compared with the properties of control samples. The dynamics of wood decomposition is shown through mass loss in the wood after two, four and six years of remaining at the site. The examined material contained a wide variety of aerobic and anaerobic microflora capable of decomposing the ancient Biskupin wood. For wood, the most dangerous of the isolated microorganisms are strains of cellulolytic bacteria of the genus: Bacillus, Pseudomonas, Sporocytophaga, Clostridium and fungi of the genus: Penicillium, Trichoderma and Aspergillus. It was found that the number of microorganisms and mass loss for wood left in the bottom layer of the water-filled trench was decidedly larger than for material buried in peat soil. Maintaining a high water level in the lake surrounding the site may help to considerably limit the colonization of the wood by microorganisms and assure optimal conditions for preserving the wooden structures of the settlement. An increase in oxygen content and higher temperature of the water and soil can cause a more intensive growth of microflora and increase the dynamics of wood degradation. Translated by Alicja Petrus-Zagroba