WYKORZYSTANIE ŻELOWEJ CHROMATOGRAFII PRZEPŁY- WOWEJ DO OKREŚLANIA WAŻNYCH GRUP POLUTANTÓW ORGANICZNYCH W JĘCZMIENIU I SŁODZIE BROWARNICZYM

Transkrypt

1 E COLOGICAL CHEMIST RY AND ENGIN EE RIN G T. 14, Nr S Tomáš HORÁK, Marie JURKOVÁ*, Jiří ČULÍK*, Pavel ČEJKA* i Vladimír KELLNER* WYKORZYSTANIE ŻELOWEJ CHROMATOGRAFII PRZEPŁY- WOWEJ DO OKREŚLANIA WAŻNYCH GRUP POLUTANTÓW ORGANICZNYCH W JĘCZMIENIU I SŁODZIE BROWARNICZYM USE OF GEL PERMEATION CHROMATOGRAPHY FOR THE DETERMINATION OF THE IMPORTANT GROUPS OF ORGANIC POLLUTANTS IN MALTING BARLEY AND MALT Streszczenie: Opracowana została metoda, która w ramach jednej ekstrakcji umożliwia określenie 9 wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych (PAHs) - benzo[a]antracenu, chryzenu, benzo[b]fluorantenu, benzo[k]fluorantenu, benzo[a]pirenu, dibenzo(a,h)antracenu, indeno[1,2,3-c,d]pirenu, dibenzo[a,i]pirenu, dibenzo[a,h]pirenu - oraz 7 związków wskaźnikowych polichlorowanych bifenyli (PCBs) - kongenerów nr 28, 52, 101, 118, 138, 153 i w matrycach roślinnych, przede wszystkim w jęczmieniu i słodzie. Sposób określania obejmuje opis ekstrakcji i oczyszczenia uzyskanego ekstraktu za pomocą metody żelowej chromatografii przepływowej z wykorzystaniem żelu na bazie polimeru styrenodiwinylobenzenu (Bio-Beads SX-3). W ten sposób uzyskuje się ekstrakt o dostatecznej czystości, umożliwiający określenie zarówno PAHs, jak i PCBs. Definitywne określenie PAHs zostało przeprowadzone metodą wysokoefektywnej chromatografii cieczowej, określenie PCBs metodą chromatografii gazowej z wykorzystaniem detektora wychwytu elektronowego. Wszystkie analizowane związki można określić w mikrogramowych ilościach ze względnym odchyleniem standardowym < 25%. Praca zawiera charakterystyki metody dla wszystkich określanych substancji oraz przykładowe chromatogramy. Słowa kluczowe: PAHs, PCBs, żelowa chromatografia przepływowa, jęczmień słodowy Wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne (PAHs) i polichlorowane bifenyle (PCBs) stanowią znaczącą grupę związków zanieczyszczających środowisko naturalne, które mogą wpływać również na wartości zdrowotne artykułów spożywczych. Jak wynika z rezultatów najnowszych badań przeprowadzonych w Czechach, związkom tym należy poświęcać stałą uwagę z powodu ich znacznego rozpowszechnienia [1, 2]. Maksymalna dopuszczalna zawartość powyższych substancji w różnych artykułach spo- Research Institute of Malting and Brewing, Plc., Lípová 15, Prague 2, Czech Republic, horak@beerresearch.cz

2 208 Tomáš Horák, Marie Jurková, Jiří Čulík, Pavel Čejka i Vladimír Kellner żywczych łącznie z piwem w zależności od ich charakteru została określona w rozporządzeniu Ministerstwa Zdrowia RCz nr 298/1997 Dz.Urz. RCz. w obowiązującym brzmieniu do ustawy nr 110/1997 Dz.Urz. RCz. o artykułach spożywczych i wyrobach tytoniowych. Większa część zanieczyszczeń występujących w piwie pochodzi z surowców, a ponieważ podstawowym surowcem do produkcji piwa jest jęczmień słodowy, to jego ewentualne zanieczyszczenia mogą przedostać się do piwa. Z tego powodu nasz instytut bierze również udział w rozwiązywaniu zadań badawczych projektu badawczego Ministerstwa Rolnictwa Republiki Czeskiej Jakość zdrowotna jęczmienia słodowego, w ramach którego została opracowana przedstawiana metoda. Analityczne sposoby określania PAHs i PCBs obejmują następujące główne kroki: izolację, oczyszczenie ekstraktów ewentualnie natężenie analizowanych związków oraz ich identyfikację i oznaczenie. Do ekstrakcji z matryc stałych stosowana jest często ekstrakcja za pomocą aparatu Soxhleta lub sonifikacja z odpowiednim rozpuszczalnikiem [3, 4], np. acetonitrylem. Lawrence wykorzystywał ekstrakcję mieszaniną wodorotlenek potasu-aceton-etanol- -woda z następną reekstrakcją za pomocą izooktanu [5]. Jako rozpuszczalnik ekstrakcyjny stosowany był także chloroform [6, 7]. Konieczność usunięcia koekstrahowanych substancji, szczególnie lipidów i pigmentów, wynika z możliwego bezpośredniego zakłócania separacji chromatograficznej, a tym samym uniemożliwienia identyfikacji i oznaczenia PAHs i PCBs, a także z ewentualnego zmniejszenia efektywności kolumn HPLC lub GC, spowodowanej rozdzielaniem niedostatecznie oczyszczonych próbek [8]. Do oczyszczania ekstraktów stosowane są metody chromatografii adsorpcyjnej i żelowej. Proces ten metodą chromatografii adsorpcyjnej prowadzony jest zazwyczaj na następujących sorbentach: Florisil (krzemian magnezu), silikażel, tritlenek diglinu lub tlenek magnezu. Trudności pojawiające się przy stosowaniu tych sorbentów polegają na zmianie aktywności wypełnienia kolumny lub adsorpcji nieodwracalnej [9]. Inną możliwość oczyszczania ekstraktów daje żelowa chromatografia przepływowa (Gel Permeation Chromatography - GPC) [10-13]. GPC to technika separacyjna korzystająca z podziału w kolumnie związków w zależności od ich masy molekularnej i struktury. Substancje o większej masie molekularnej (których efektywna objętość przekracza wymiary porów danego żelu) przechodzą przez kolumnę bez zatrzymania. Z drugiej strony mniejsze molekuły wchodzą do wewnętrznej struktury żelu, a do ich elucji dochodzi później. Rozmiary porów i związane z nimi pęcznienie żelu zależą od zastosowanej fazy mobilnej i struktury żelu. Na kolumnach GPC można uzyskać rozdzielenie lipidów i ekstrahowalnych pigmentów, które mogą przeszkadzać w oznaczaniu analitów. Do zalet GPC należy długa żywotność zawartości kolumny bez zmiany krzywej oczyszczania analizowanych związków lub zdolności do oczyszczania [14]. Do oczyszczania frakcji PAHs i PCBs na kolumnach GPC stosowane są następujące żele: XAD-2 [11, 13], Bio-Beads SX-3 [15, 7] i SX-12 [15] oraz bardzo często Sephadex LH-20 [5, 10, 12, 15]. W końcowym etapie oznaczania PAHs najczęściej jest stosowana metoda HPLC z detekcją fluorescencyjną, a w przypadku PCBs - chromatografia gazowa z detektorem wychwytu elektronowego [17].

3 Wykorzystanie żelowej chromatografii przepływowej do określania ważnych grup polutantów Celem niniejszej pracy było opracowanie, zgodnie z wymaganiami przepisów prawnych, metody określania PAHs i PCBs w matrycach roślinnych, przede wszystkim w jęczmieniu i słodzie, która umożliwiałaby wspólne natężenie wszystkich analizowanych związków z jednej fazy ekstrakcyjnej, a jednocześnie uzyskanie za pomocą żelowej chromatografii przepływowej dostatecznie czystego ekstraktu. Definitywne określenie PAHs zostało przeprowadzone metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej, natomiast oznaczenie PCBs metodą chromatografii gazowej z wykorzystaniem detektora wychwytu elektronowego. Część eksperymentalna Stosowane związki i wzorce chloroform, n-heksan SupraSolv, acetonitryl do analizy gradientowej Bio-Beads S-X mesh, Bio-Rad Laboratories, USA woda ultraczysta - Milli-RO 5plus, Millipore, USA azot w butli ciśnieniowej o jakości 4,6 i o jakości ECD, hel w butli ciśnieniowej o jakości 5,0 - MGO, RCz. PCBs - Mix 3, zawierający następujące jednorodne kongenery PCBs nr 28, 52, 101, 118, 138, 153, 180 roztwory izooktanowy i acetonitrylowy, każdy o koncentracji 10 ng/mm 3 - Dr. Ehrenstorfer, RFN PAHs: benzo[a]antracen, benzo[b]fluoranten, chryzen, dibenzo[a,h]antracen, benzo[a]piren, benzo[k]fluoranten, indeno[1,2,3-c,d]piren, dibenzo[a,i]piren, dibenzo- [a,h]piren roztwory acetonitrylowe o koncentracji 10 ng/mm 3 - Dr. Ehrenstorfer, RFN Metodyka postępowania Ekstrakcja Dokładnie zhomogenizowana odważka 30 g próbki była ekstrahowana za pomocą 40 cm 3 chloroformu w czasie 20 min w wanience ultradźwiękowej. Następnie wodny ekstrakt o objętości około 30 cm 3 został odparowany do sucha w rotacyjnym tyglu próżniowym, a potem rozpuszczony w 4 cm 3 chloroformu. Oczyszczanie ekstraktu za pomocą GPC Zagęszczony ekstrakt chloroformowy był dozowany do systemu GPC za pomocą 2 cm 3 pętli. Biorąc pod uwagę, że ekstrakty zawierają często nierozpuszczalne cząstki koloidalne przed jego aplikacją na kolumnę GPC należy go przefiltrować przez teflonowy mikrofiltr 0,2 µm (Alltech, USA). Do badania stopnia oczyszczenia ekstraktu został zastosowany żel na bazie polimeru styrenodiwinylobenzenu Bio-Beads SX-3. Oczyszczanie przebiegało w następujących warunkach:

4 210 Tomáš Horák, Marie Jurková, Jiří Čulík, Pavel Čejka i Vladimír Kellner pompa tłokowa HPLC: HPP 4001 (Laboratorní přístroje Praha) sześciodrożny preparatywny zawór dozujący z pętlą 2 cm 3 (ECOM, RCz.) kolumna ze stali nierdzewnej 10 x 500 mm napełniona sorbentem Bio-Beads S-X3 faza mobilna: chloroform przepływ: 0,9 cm 3 /min Jak wynika z krzywych oczyszczenia dla PAHs (rys. 1) i PCBs (rys. 2), była zebrana frakcja cm 3. Pole powierzchni [jednostki umowne] ,5 22,5-24,3 24,3-26,1 26,1-27,9 27,9-29,7 Krzywe elucji PAHs 29,7-31,5 31,5-33,3 33,3-35,1 35,1-36,9 36,9-38,7 38,7-40,5 frakcje [cm 3 ] 40,5-42,3 42,3-44,1 44,1-45,9 45,9-47,7 47,7-49,5 49,5-51,3 51,3-53,1 Rys. 1. Krzywa oczyszczenia PAHs na kolumnie 10 x 500 mm napełnionej sorbentem Bio-Beads SX-3 przy przepływie chloroformu 0,9 cm 3 /min Oznaczanie PCBs Uzyskany eluat zostanie odparowany do sucha na rotacyjnym tyglu próżniowym (temperatura kąpieli wodnej maks. 40 C). Następnie sucha pozostałość była rozpuszczona w 1 cm 3 heksanu. Do analizy chromatograficznej używano 2 mm 3 oczyszczonego ekstraktu. Właściwe oznaczenie PCBs przebiegało w następujących warunkach: chromatograf gazowy: Chrompack CP 9001 kolumna: DB-5, długość 30 m, średnica 0,32 mm, grubość filmu 0,25 µm (J&W Scientific) przepływ gazu nośnego (hel): 1,8 cm 3 /min detektor ECD, temperatura detektora: 310 C temperatura injektora: 260 C nastrzyk: bez podziału (splitless) przez 36 s, następnie stosunek podziału 1:20 program temperaturowy 70 C (zwłoka 2 min); 25 C/min do 200 C (zwłoka 0 min); 2 C/min do 250 C (zwłoka 0 min); 50 C/min do 290 C (zwłoka 10 min)

5 Wykorzystanie żelowej chromatografii przepływowej do określania ważnych grup polutantów objętość nastrzyku: 2 mm 3 Krzywe elucji PCBs Pole powierzchni [jednostki umowne] ,5 22,5-24,3 24,3-26,1 26,1-27,9 27,9-29,7 29,7-31,5 31,5-33,3 33,3-35,1 frakcje [cm 3 ] 35,1-36,9 36,9-38,7 38,7-40,5 40,5-42,3 42,3-44,1 44,1-45,9 45,9-47,7 47,7-49,5 49,5-51,3 51,3-53,1 Rys. 2. Krzywa oczyszczenia związków PCBs na kolumnie 10 x 500 mm napełnionej sorbentem Bio-Beads SX-3 przy przepływie chloroformu 0,9 cm 3 /min Oznaczanie PAHs Po oznaczeniu PCBs heksanowy ekstrakt zostanie odparowany do sucha pod bardzo lekkim strumieniem azotu, rozpuszczony w 1 cm 3 acetonitrylu i naniesiony na kolumnę chromatografu cieczowego. Rozdział chromatograficzny przebiega w następujących warunkach: chromatograf cieczowy: TSP SpectraSYSTEM P 4000 z programowanym detektorem fluorescencyjnym JASCO FP-1520 kolumna: LiChrospher PAH 250x4 (Merck, RFN) faza ruchoma: acetonitryl-woda; gradient 0 20 min (80 100% acetonitrylu), min (100% acetonitrylu), min (100 80% acetonitrylu) przepływ: 1 cm 3 /min detekcja: fluorescencyjna z następującym programem wzbudzających (ex.) i emisyjnych (em.) długości fal: 0 10,5 min ex. λ = 264 nm, em. λ = 384 nm; 10,5 17,9 min ex. λ = 280 nm, em. λ = 430 nm; 17,9 44 min ex. λ = 290 nm, em. λ = 484 nm nastrzyk: 20 mm 3 Szacunek chromatogramów zarówno dla PCBs, jak i PAHs został przeprowadzony metodą standardu zewnętrznego.

6 212 Tomáš Horák, Marie Jurková, Jiří Čulík, Pavel Čejka i Vladimír Kellner Omówienie wyników i ich analiza Zastosowanie żelowej chromatografii przepływowej umożliwia efektywne oddzielenie wszystkich analizowanych substancji od innych koekstrahowanych substancji. Charakterystyka metody została przedstawiona w tabeli 1. Wydajność i względne odchylenie standardowe zostały określone na podstawie 7 dodatków acetonitrylowego roztworu standardów do próbek pochodzących z jęczmienia słodowego (PCBs na poziomie 5 µg/kg dla każdego kongeneru, PAHs na poziomie 2 µg/kg dla każdego węglowodoru wielopierścieniowego). Granica wykrywalności została określona jako koncentracja, przy której stosunek sygnału odpowiadającego tej koncentracji do szumu wynosi 3:1, granica oznaczalności jako dziesięciokrotność tego stosunku. Tabela 1 Charakterystyka metody wielopowtórzeniowej określania PAHs i PCBs w matrycach roślinnych; stopień ekstrakcji, odchylenie standardowe, granica wykrywalności oraz granica oznaczalności Analit Stopień ekstrakcji [%] Odchylenie standardowe [%] Granica wykrywalności [µg/kg] Granica oznaczalności [µg/kg] Benzo[a]antracen ,05 0,2 Benzo[b]fluoranten ,15 0,5 Benzo[k]fluoranten ,3 0,9 Chryzen ,04 0,1 Dibenzo[a,h]antracen ,2 0,7 Benzo[a]piren ,08 0,3 Indeno[1,2,3-c,d]piren ,13 0,4 Dibenzo[a,i]piren ,1 0,3 Dibenzo[a,h]piren ,2 0,7 PCB ,03 0,1 PCB ,03 0,1 PCB ,03 0,1 PCB ,02 0,07 PCB ,02 0,07 PCB ,02 0,07 PCB ,01 0,03 Efektywność została sprawdzona na podstawie wydajności, która we wszystkich substancjach z wyjątkiem dibenzo[a,h]pirenu leży w zakresie od 80 do 111%, średnia dla PAHs wynosi 92%, dla PCBs 95%. Stosunkowo mała wydajność dibenzo[a,h]pirenu świadczy o dużej sorpcji tego związku w środowisku naturalnym. Okoliczność ta jest zgodna ze stosunkowo wysoką retencją tego węglowodoru na kolumnie chromatograficznej w warunkach oczyszczania za pośrednictwem bardzo silnego rozpuszczalnika organicznego, jakim jest acetonitryl (patrz warunki chromatograficzne).

7 Wykorzystanie żelowej chromatografii przepływowej do określania ważnych grup polutantów Dokładność metody została określona przez względne odchylenie standardowe i ma wartości < 25%, wartość średnia dla PAHs wynosi 10,6%, a dla PCBs 19,5%. Biorąc pod uwagę, że chodzi tu o śladową analizę ilości mikrogramowych, czyli o wartości leżące o rząd wielkości poniżej zwykłych analiz w browarnictwie, uzyskane wartości względnego odchylenia reprezentują zadowalający poziom. Granica oznaczalności znajduje się poniżej 1 µg/kg i jest z punktu widzenia wymagań prawnych w pełni wystarczająca. Podsumowanie Opisana metoda wielopowtórzeniowa rozwiązuje problem oczyszczania ekstraktu uzyskanego z matryc roślinnych. Umożliwia określenie wybranych PAHs i wskaźnikowych związków jednorodnych PCBs wymaganych przez przepisy prawne Republiki Czeskiej w ilościach mikrogramowych oraz przy względnym odchyleniu standardowym < 25%. Jest to metoda bardzo efektywna, ponieważ w ramach jednej fazy ekstrakcyjnej możliwe jest określenie wszystkich powyższych zanieczyszczeń, co pozwala porównaniu z odrębną ekstrakcją dla każdego typu analizy na osiągnięcie znacznej oszczędności czasu i rozpuszczalnika ekstrakcyjnego. Oprócz tego przy zastosowaniu odpowiedniej aparatury możliwa jest automatyzacja całego sposobu postępowania, a tym samym jeszcze wyższa jego efektywność. Literatura [1] Hajšlová J., Volka K., Suchánek M., Böhm S., Skácel F., Kocourek V., Tomaniová M. i Radová Z.: Výsledky nejvýznamnějších pilotních studií realizovaných v Projektu MŽP Hodnocení stavu životního prostředí ČR. Proceedings of the XIV Conference Kontaminaty a další rizikové látky v potravinách a ekosystémech. VŠCHT, Praha [2] Cuhra P. i in.: Trendy v kontaminaci potravin na českém trhu. Proceedings of the XIV Conference Kontaminaty a další rizikové látky v potravinách a ekosystémech. VŠCHT, Praha [3] Coates J. i Elzerman A.W.: J. Assoc. Off. Anal. Chem., 1986, 69, 110. [4] Kicinski H.G., Adamek S. i Kettrup A.: Chromatographia, 1989, 28, 203. [5] Lawrence J.F.: Int. J. Environ. Anal. Chem., 1986, 24, 113. [6] Merhaut J.: diplomová práce: PAH ve vybraných biologických materiálech, VŠCHT, Praha [7] Hajšlová J., Holadová K., Kocourek V., Poustka J., Cuhra P. i Raverdino V.: Z. Lebensm. Unters. Forsch., 1993, 197, 562. [8] Frehse H.: Trends in Pesticide Residue Methology, from Pest. Sci. and Biotechn. Blackwell Scietific Publications, [9] Lawrence J.F. i Weber D.F.: J. Agric. Food Chem., 1984, 32, 789. [10] Creaser C. i Purchase R.: Food Contaminants Sources and Surveillance. The Royal Society of Chemistry, Cambridge [11] Vaessen H.A.G., Wagstaffe P.J. i Lindsey A.S.: Fresenius J. Anal. Chem., 1990, 336, 503. [12] Grimmer G., Böhnke H.: J. Assoc. Off. Anal. Chem., 1975, 58, 725. [13] Claessens H.A., Rhemrev M.M., Wevers J.P., Janssen A.A.J. i Brasser L.J.: Chromatographia, 1991, 10, 569. [14] Tuinstra L.G.M.T., Driesson J.M.J., Keukens H.J., Van Munsteren T.J., Ross A.H. i Traag W.A.: Int. J. Environ. Anal. Chem., 1988, 14, 147.

8 214 Tomáš Horák, Marie Jurková, Jiří Čulík, Pavel Čejka i Vladimír Kellner [15] Fernandéz P., Porte C., Barceló D., Bayona J.M. i Albaigés I.: J. Chromatog., 1988, 456, 155. [16] Leníček J., Holoubek J., Sekyra M. i Kociánová S.: Chem. Listy, 1993, 87, 852. USE OF GEL PERMEATION CHROMATOGRAPHY FOR THE DETERMINATION OF THE IMPORTANT GROUPS OF ORGANIC POLLUTANTS IN MALTING BARLEY AND MALT Summary: The multiresidue method for the determination of 9 polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) - benzo[a]anthracene, chrysene, benzo[b]fluoranthene, benzo[k]fluoranthene, benzo[a]pyrene, dibenzo[a,h] anthracene, indeno[1,2,3-c,d]pyrene, dibenzo[a,i]pyrene, dibenzo[a,h]pyrene - and 7 indicating congeners of polychlorinated biphenyls (PCBs) - no. 28, 52, 101, 118, 138, 153 and in vegetable matrixes, mainly in barley and malt was developed. The assay process includes the description of extraction and purification of the extract by the gel permeation chromatography using gel based on the polymer of styrenedivinylbenzene (Bio-Beads SX-3). The final determination of PAHs was carried out by the high-performance liquid chromatography and the determination of PCBs by gas chromatography using the electron capture detector. All analytes can be determinated in micrograms with a relative standard deviation < 25%. The study contains characteristics of the method for all determinated compounds. Keywords: PAHs, PCBs, gel permeation chromatography, malting barley