Mitochondrialne Hsp70 funkcja i ewolucja. Jarosław Marszałek

Transkrypt

1 Mitochondrialne Hsp70 funkcja i ewolucja STRESZCZENIE Zdolność do cyklicznego oddziaływania z substratami białkowymi umożliwiła białkom opiekuńczym Hsp70 udział w różnorodnych procesach komórkowych takich jak: fałdowanie łańcucha polipeptydowego białek, transport polipeptydów przez błony, modulowanie odziaływań pomiędzy białkami, zapobieganie agregacji polipeptydów oraz rozbijanie agregatów białkowych. Aktywności te wymagają współpracy białka Hsp70 z białkami pomocniczymi typu-j oraz czynnikami wymiany nukleotydów. Białka pomocnicze regulują cykl hydrolizy ATP katalizowanej przez Hsp70, który umożliwia odwracalne wiązanie substratu białkowego. W poszczególnych przedziałach komórki eukariotycznej może współwystępować kilka różnych Hsp70 oraz białek typu-j. Dlatego ich funkcjonowanie w różnorodnych procesach wymaga specjalizacji albo samego Hsp70 albo też zdolności wielofunkcyjnego Hsp70 do oddziaływania z zestawem wyspecjalizowanych białek typu-j. Badane przez nas systemy Hsp70 funkcjonujące w mitochondriach dostarczają przykładów obydwu typów specjalizacji. Tym samym stanowią dogodny model badawczy umożliwiający poznanie zarówno molekularnych jak też ewolucyjnych podstaw funkcjonalnego różnicowania systemów Hsp70. WPROWADZENIE Systemy opiekuńcze Hsp70 występują we wszystkich przedziałach komórki eukariotycznej funkcjonując w wielu procesach niezbędnych dla życia. Mechanizm ich działania opiera się na odwracalnym, cyklicznym wiązaniu krótkich hydrofobowych sekwencji reszt aminokwasowych eksponowanych na powierzchni białek nazywanych substratami. Ten uniwersalny mechanizm umożliwia białkom opiekuńczym Hsp70 pełnienie wielu ważnych funkcji [1-3]. Hsp70 uczestniczą w fałdowaniu łańcucha polipeptydowego nowo syntetyzowanych białek, modulują oddziaływania pomiędzy białkami wpływając na ich konformację, napędzają transport polipeptydów przez błony biologiczne. Systemy Hsp70 umożliwiają również ponowne fałdowanie łańcuchów polipeptydowych białek, które utraciły natywną konformację pod wpływem warunków stresowych. Zaś w przypadku, gdy ich ponowne zwinięcie do natywnej konformacji nie jest możliwe, Hsp70 kierują polipeptydy do systemów proteolitycznych komórki. Zaangażowanie białek Hsp70 w tak wiele różnorodnych procesów komórkowych, podczas gdy ich podstawowa aktywność biochemiczna ogranicza się do regulowanego przez wiązanie i hydrolizę ATP cyklicznego oddziaływania z krótkimi fragmentami łańcucha polipeptydowego substratów białkowych, jest zaskakujące i wymaga wyjaśnienia. W tej pracy omówię mechanizmy molekularne oraz ewolucję funkcjonalnego różnicowania systemów Hsp70 występujących w mitochondriach. Systemy te dobrze ilustrują dwie główne strategie: (1) zwielokrotnienie i specjalizację genów kodujących białka Hsp70 oraz (2) zwielokrotnienie i specjalizację genów kodujących białka pomocnicze typu-j. Skoncentruję się na mitochondrialnych Hsp70 drożdży, gdyż dla tej grupy organizmów dostępne są zarówno dane genomowe jak też liczne dane doświadczalne uzyskane w wyniku prac z zastosowaniem klasycznych organizmów modelowych takich jak Saccharomyces cerevisiae, Sichzosaccharomyces pombe czy Neurospora crassa. Drożdże są też głównym obiektem badań naszego zespołu. Zanim jednak przejdę do systemów mitochondrialnych omówię cykl wiązania substratu białkowego oraz mechanizmy odpowiedzialne za zwielokrotnienie liczby genów kodujących białka systemów Hsp70. Jarosław Marszałek Pracownia Biochemii Ewolucyjnej, Międzyuczelniany Wydział Biotechnologii, Uniwersytet Gdański i Gdański Uniwersytet Medyczny, Gdańsk Pracownia Biochemii Ewolucyjnej, Międzyuczelniany Wydział Biotechnologii, Uniwersytet Gdański i Gdański Uniwersytet Medyczny, ul Antoniego Abrahama 58, Gdańsk; tel.: (58) ; jaroslaw. marszalek@biotech.ug.edu.pl Artykuł otrzymano 26 kwietnia 2016 r. Artykuł zaakceptowano 18 maja 2016 r. Słowa kluczowe: białka typu-j, mitochondrialne DNA, import białek mitochondrialnych, centra żelazo-siarkowe, ewolucja białek Podziękowania: Dr hab. Rafałowi Dutkiewiczowi, prof. Elizabeth Craig oraz dr Brendzie Schilke (University of Wisconsin-Madison) dziękuję za wieloletnią współpracę. Opisane tutaj wyniki badań naszego zespołu powstały dzięki pracy doktorantów: Marleny Duchniewicz, Aleksandry Germaniuk, Heleny Knieszner, Małgorzty Macierzanki, Sebastiana Pukszty, Bogusławy Paterkiewicz, Magdaleny Płotki, Grzegorza Ciesielskiego, Szymona Ciesielskiego, Jacka Kominka, Julii Majewskiej, Mateusza Manickiego, Michała Rogaczewskiego, Wojciecha Delewskiego, BartłomiejaTomiczka i Małgorzaty Nowak. Praca finansowana z Subsydium Profesorskiego w Programie Mistrz (6/2014) Fundacji na Rzecz Nauki Polskiej. CYKL WIĄZANIA SUBSTRATU BIAŁKOWEGO Struktura domenowa białek rodziny Hsp70 pochodzących z różnych organizmów jest bardzo podobna (Ryc. 1). Każde z nich składa się z dwóch domen połączonych elastycznym łącznikiem. N-końcowa domena ATPazowa (~44 Postępy Biochemii 62 (2)

2 Rycina 1. Struktura białka Hsp70 oraz domeny-j. Struktura Hsp70 jest zachowana w ewolucji. Domena ATPazowa (żółta) ma głęboką szczelinę w której wiąże się ATP. W domenie wiążącej substrat zbudowana z β-kartek szczelina (niebieska), oddziałująca z grupą aminokwasów hydrofobowych, jest przykryta przez α-helikalne wieczko (zielone). Elastyczny łącznik (czerwony) umożliwia allosteryczną komunikację pomiędzy domenami (rycina w oparciu o PDB id:2kho). Każda funkcjonalna domena-j posiada trójpeptyd HPD, niezbędny do stymulacji ATPazy partnerskiego Hsp70 (rycina w oparciu o PDB id:1xbl). kda) zbudowana jest z dwóch płatów tworzących szczelinę wewnątrz której znajduje się miejsce wiązania ATP. C- -końcowa domena wiążąca substrat białkowy (~26 kda) [3] składa się z dwóch części: domeny o strukturze β-kanapki, która tworzy kieszeń wiążącą sekwencje kilku reszt aminokwasowych o charakterze hydrofobowym eksponowaną na powierzchni substratu białkowego oraz domeny o strukturze α-helisy, która tworzy wieczko przykrywające miejsce wiązania substratu białkowego. Łącznik pomiędzy domeną ATPazową i wiążącą substrat pełni istotną rolę w procesie allosterycznej komunikacji pomiędzy domenami [4]. Podstawowa aktywność biochemiczna Hsp70 to cykliczne wiązanie substratu białkowego regulowane przez hydrolizę ATP oraz wynikające z niej zmiany konformacji obu domen (Ryc. 2). W wyniku wiązania ATP domena ATPazowa przyjmuje konformację umożliwiającą jej bezpośrednie oddziaływanie zarówno z sekwencją łącznika jak też z domeną wiążącą substrat. Przy czym α-helikalne wieczko domeny wiążącej substrat odchyla się na skutek oddziaływania z domeną ATPazową odsłaniając miejsce wiązania polipeptydu [5]. Taka konformacja umożliwia zarówno szybkie wiązanie jak też szybkie uwalniane substratu białkowego. W wyniku hydrolizy ATP do ADP dochodzi do zmiany konformacji obu domen. Domena wiążąca substrat odłącza się od domeny ATPazowej a helikalne wieczko zamyka miejsce wiązania polipeptydu stabilizując tym samym oddziaływanie z substratem białkowym [6]. Z kolei wymiana ADP na ATP indukuje kolejną zmianę konformacji umożliwiając odłączenie polipeptydu i inicjację nowego cyklu wiązania substratu. Białka Hsp70 nie funkcjonują samodzielnie. Dwie kluczowe aktywności: hydroliza ATP oraz wymiana ADP na ATP (Ryc. 2); stymulowane są przez białka pomocniczekolejno białko typu-j oraz czynnik wymiany nukleotydu [7,8]. Cechą charakterystyczną wszystkich białek typu-j jest obecność domeny-j (Ryc. 1B). Typowa domena-j składa się z czterech α-helis, przy czym helisy II i III tworzą strukturę palca zbudowanego z przeciw równoległych łańcuchów połączonych elastyczną pętlą. W obrębie pętli znajduje się motyw 3 reszt aminokwasowych (histydyna, prolina i kwas asparaginowy, HPD) obecny we wszystkich aktywnych domenach-j [9]. Funkcja domeny-j to stymulacja aktywności ATPazowej partnerskiego Hsp70 wymagająca bezpośredniego oddziaływania obu białek przy udziale reszt aminokwasowych motywu HPD. Białka typu-j posiadają dodatkowe domeny warunkujące ich współdziałanie z partnerskim Hsp70. Jednak struktura tych domen różni się pomiędzy poszczególnymi białkami. W niektórych przypadkach obecność dodatkowych domen umożliwia białkom typu-j wiązanie substratu białkowego i przekazanie go do partnerskiego Hsp70 (Ryc. 2). Inne białka typu-j, posiadają domeny umożliwiające ich specyficzną lokalizację komórkową, blisko miejsca w którym wymagane jest działanie partnerskiego Hsp70 [1]. Czynniki wymiany nukleotydu to ewolucyjnie zróżnicowana grupa białek, których wspólną cechą jest zdolność oddziaływania z Hsp70 co prowadzi do zmian konformacyjnych umożliwiających dysocjację ADP powstałego w wyniku hydrolizy ATP [8]. Tym samym białka te inicjują wiązanie kolejnej cząsteczki ATP skutkujące uwolnieniem substratu białkowego związanego przez Hsp70. Oddziaływanie Hsp70 z białkami pomocniczymi reguluje przebieg cyklu wiązania substratu białkowego. Białka typu-j poprzez stymulację ATPazy promują powstanie stabilnego kompleksu Hsp70-substrat białkowy, zaś czynniki wymiany nukleotydu regulują częstotliwość cyklu wiązania substratu białkowego. Rycina 2. Cykl wiązania substratu białkowego przez Hsp70. (1) Kompleks białka typu-j z częściowo rozfałdowanym substratem białkowym oddziałuje z Hsp70 w kompleksie z ATP (konformacja otwarta). Wieczko przykrywające miejsce wiązania polipeptydu jest otwarte. Jednoczesne oddziaływania domeny-j białka typu-j oraz substratu białkowego z Hsp70 stymulują ATPazę. Po hydrolizie ATP do ADP wieczko domeny wiążącej substrat jest zamknięte stabilizując kompleks Hsp70-substrat białkowy. Białko typu-j odłącza się od Hsp70. (2) Przyłączenie czynnika wymiany nukleotydu Mge1. (3) Dysocjacja ADP oraz czynnika wymiany nukleotydu umożliwia przyłączenie ATP, otwarcie wieczka oraz uwolnienie substratu białkowego. ZWIELOKROTNIENIE LICZBY GENÓW KODUJĄCYCH BIAŁKA HSP70 I BIAŁKA TYPU-J Hsp70 i białka typu-j są wyjątkiem pośród białek opiekuńczych gdyż występują jako wielogenowe rodziny w organizmach należących do wszystkich domen życia (Ryc. 3). Przykładowo drożdże S. cerevisiae kodują 14 Hsp70 i 23 białka typu-j, podczas gdy w genomie człowieka zidentyfikowano 17 genów Hsp70 współpracujących z 41 genami ko- 70

3 Rycina 3. Ewolucja funkcjonalnego różnicowania systemów Hsp70. W wielu przedziałach komórki eukariotycznej pojedyncze białko Hsp70 funkcjonuje z kilkoma białkami typu-j. Każde z nich warunkuje udział partnerskiego Hsp70 w innym procesie komórkowym (środkowy panel). Proces funkcjonalnego różnicowania systemów Hsp70 wynika z zaangażowania nowego białka typu-j (lewy panel) i/lub z duplikacji oraz specjalizacji białka Hsp70 (prawy panel). dującymi białka typu-j [1,10,11]. Również niektóre genomy wirusowe kodują białka Hsp70 i białka typu-j [12]. To zróżnicowanie genetyczny wyróżnia systemy Hsp70 od innych klas białek opiekuńczych. Dlaczego tak się dzieje? Jednym z czynników sprzyjających tej różnorodności może być to, że odwracalne wiązania polipeptydów jest mechanizmem, który może być wykorzystywany w różnorodnych procesach komórkowych. Ponad to cykl wiązania i dysocjacji substratu białkowego przez Hsp70 jest precyzyjnie regulowana na kilku poziomach. Po pierwsze, poprzez modyfikację miejsca wiązania polipeptydu Hsp70 może rozróżniać określone substraty białkowe lub też o wiązaniu określonych substratów może decydować białko typu-j wiążąc i dostarczając substrat do partnerskiego Hsp70. Po drugie, szybkość i częstotliwość cyklu wiązania substratu białkowego może być regulowana poprzez oddziaływanie ze specyficznym czynnikiem wymiany nukleotydów. Funkcjonalnej różnorodności białek Hsp70 sprzyja również to, że w przeciwieństwie do innych białek opiekuńczych funkcjonujących jako oligomery złożone z kilku podjednostek, Hsp70 funkcjonują jako monomery [3]. Dzięki temu ich nowe funkcje, na przykład wiązanie białek innych niż substraty białkowe, nie są ograniczane poprzez wymagania strukturalne niezbędne do tworzenia stabilnych oligomerów. Te właściwości mogły doprowadzić to sytuacji, w której białka Hsp70 zaangażowane są w wiele istotnych funkcji komórkowych nie związanych z procesem fałdowania łańcuchów polipeptydowych uważanym za pierwotną funkcję białek opiekuńczych. FUNKCJA I EWOLUCJA MITOCHONDRIALNYCH SYSTEMÓW HSP70 PODSTAWOWY MITOCHONDRIALNY SYSTEM HSP70 Mitochondria powstały w procesie endosymbiozy komórki będącej prawdopodobnie przedstawicielem α-proteobakterii [13]. Nie zaskakuje więc fakt, że podstawowy mitochondrialny system Hsp70 jest blisko spokrewniony z bakteryjnymi białkami opiekuńczymi: Hsp70 DnaK, białkiem typu-j DnaJ oraz czynnikiem wymiany nukleotydów GrpE [14]. U drożdży S. cerevisiae odpowiedniki tych białek znane są jako Hsp70 Ssc1, białko typu-j Mdj1 oraz czynnik wymiany nukleotydów Mge1 (Ryc. 4). Białka drożdżowe i bakteryjne charakteryzuje znaczny stopień podobieństwa zarówno strukturalnego jak też sekwencyjnego. W niektórych przypadkach białka bakteryjne pochodzące z E. coli mogą zastępować białka mitochondrialne i to zarówno w doświadczeniach biochemicznych jak też w żyjącej komórce drożdżowej [15,16]. System białek Ssc1/Mdj1/Mge1 zlokalizowany jest w macierzy mitochondrialnej gdzie pełni funkcje podobne do bakteryjnego odpowiednika (DnaK/ DnaJ/GrpE). Przykładowo zarówno badania biochemiczne jak też badania z wykorzystaniem żyjących komórek drożdży pokazały, że podstawowy mitochondrialny system Hsp70 uczestniczy w fałdowaniu łańcuchów polipeptydowych białek mitochondrialnych zarówno w warunkach fizjologicznych jak też w warunkach stresu cieplnego [17-19]. Po obniżeniu temperatury białka systemu Ssc1/Mdj1/Mge1 umożliwiają ponowne fałdowanie łańcuchów polipeptydowych oraz reaktywację białek które uległy agregacji [19]. Dotychczasowe badania sugerują, że procesy te przebiegają zgodnie z opisanym powyżej mechanizmem cyklicznego wiązania i uwalniania substratu białkowego regulowanym przez hydrolizę ATP. Reakcję rozpoczyna Mdj1 wiążąc zdenaturowane białko i przekazując je na Ssc1. Jednocześnie domena-j Mdj1 stymuluje ATPazę Hsp70 stabilizując wiązanie substratu białkowego. Mge1 uwalnia ADP umożliwiając zarówno wiązanie nowej cząsteczki ATP jak też dysocjację substratu białkowego, tym samym inicjując nowy cykl wiązania substratu. Chociaż większość badań prowadzono stosując modelowe substraty białkowe, zidentyfikowano również kilka natywnych substratów białkowych systemu Ssc1/Mdj1/Mge1. Należy do nich mitochondrialna polimeraza DNA Mip1 oraz podjednostka rybosomu mitochondrialnego Var1 [17,19,20]. Pomimo oczywistego podobieństwa systemów bakteryjnego i mitochondrialnego ten ostatni zaangażowany jest również w funkcje typowe dla mitochondriów. System ten odpowiada za utrzymywanie i propagację mitochondrial- Rycina 4. Systemy Hsp70 funkcjonujące w macierzy mitochondrialnej drożdży S. cerevisiae. Wielofunkcyjne Hsp70 Ssc1 współdziała z białkami typu-j; z Mdj1 w procesach fałdowania łańcuchów polipeptydowych białek oraz w utrzymywaniu i propagacji mtdna, z Pam18 w procesie importu białek. Wyspecjalizowane Hsp70 Ssq1, które powstało w wyniku duplikacji genu SSC1, współpracuje z Jac1 w procesie biogenezy centrów żelazo-siarkowych (FeS). Postępy Biochemii 62 (2)

4 nego DNA [20,21]. To zaangażowanie może świadczyć o tym, że system Ssc1/Mdj1/Mge1 ewoluował pod działaniem presji selekcyjnej wywołanej specyfiką funkcjonowania mitochondriów. Mitochondria posiadają własny genom (mtdna) kodujący ograniczoną liczbę białek mitochondrialnych, mitochondrialne trna oraz podjednostki mitochondrialnego rybosomu [22,23]. Utrzymanie i replikacja mtdna są warunkiem prawidłowego funkcjonowania zarówno samych mitochondriów jak też komórki eukariotycznej. Za procesy te odpowiada kompleks białek związanych z mtdna znany jako mitochondrialny nukleoid [22, 24]. Komponenty systemu Ssc1/Mdj1/Mge1 występują w kompleksie nukleoidu podobnie jak wiele innych białek mitochondrialnych, których podstawowa aktywność nie jest w oczywisty sposób powiązana z metabolizmem DNA [22,25]. Dotychczas niewiele wiadomo na temat roli tych białek w utrzymywaniu i replikacji mtdna. Jednak w przypadku Mdj1 wyniki badań są jednoznaczne. Zarówno delecja genu kodującego Mdj1 jak też zamiana sekwencji HPD domeny-j tego białka prowadzi do szybkiej utraty mtdna nawet w optymalnych warunkach hodowli drożdży [21], w których mitochondrialna polimeraza DNA jest w pełni aktywna [20]. Ponad to większość Mdj1 zlokalizowana jest w kompleksie nukleoidu prawdopodobnie dzięki bezpośredniemu oddziaływaniu Mdj1 z mtdna [21]. Chociaż molekularny mechanizm warunkujący udział Mdj1 w utrzymywaniu i replikacji mtdna nie został dotychczas poznany uzyskane wyniki sugerują, że wymaga on zarówno lokalizacji Mdj1 w obrębie kompleksu nukleoidu jak też jego współpracy z partnerskim Hsp70 Ssc1 [21]. Można spekulować, że mechanizm ten polega na modyfikacji stabilności kompleksów białkowych zaangażowanych w przemiany mtdna. Podobną aktywność wykazują homologiczne białka bakteryjne (DnaK/DnaJ/GrpE), które w przypadku replikacji DNA bakteriofaga λ, będącego pasożytem E. coli, modyfikują stabilność kompleksu białek zaangażowanych w inicjację replikacji fagowego DNA [26,27]. Aktywność ta jest niezbędna dla namnażania wirusa w komórce bakteryjnej. Białka systemu Hsp70 uczestniczą również w procesie replikacji genomu niektórych wirusów namnażających się komórkach eukariotycznych [12]. WYSPECJALIZOWANY SYSTEM HSP70 ZAANGAŻOWANY W IMPORT BIAŁEK DO MITOCHONDRIÓW Chociaż podstawowy system Ssc1/Mdj1/Mge1 pełni funkcje typowe dla białek opiekuńczych związane z fałdowaniem łańcuchów polipeptydowych białek substratowych zarówno w warunkach fizjologicznych jak też stresowych składniki tego systemu: Ssc1 i Mge1 zaangażowane są też w inne procesy, w których współpracują z wyspecjalizowanymi białkami typu-j (Ryc. 4). Jednym z takich procesów jest import białek do macierzy mitochondrialnej [28,29]. W procesie ewolucji mitochondriów wiele genów uległo translokacji z genomu endosymbionta do genomu jądrowego komórki gospodarza. Chociaż geny zmieniły lokalizację to kodowane przez nie białka nadal funkcjonują w mitochondriach. Było to możliwe dzięki powstaniu systemu transportu białek z cytoplazmy do mitochondriów [30,31]. W procesie ewolucji tego systemu mitochondrialne Hsp70 (Ssc1 u S. cerevisiae) przyjęło funkcję czynnika bezpośrednio odpowiedzialnego za transport polipeptydów przez kanał wewnętrznej błony mitochondriów. W procesie tym wykorzystywana jest typowa aktywność Hsp70 czyli odwracalne wiązanie substratów białkowych. Ssc1 wiąże hydrofobowe sekwencje pojawiające się w miarę jak rozfałdowany polipeptyd przesuwa się przez kanał transportowy napędzany różnicą potencjałów pomiędzy zewnętrzną i wewnętrzną powierzchnią błony mitochondrialnej. Odwracalne wiązanie Ssc1 zapobiega cofaniu się łańcucha polipeptydowego w kanale tym samym umożliwiając jego przesuwanie się do wnętrza mitochondriów [29]. W procesie tym za stymulację aktywności ATPazowej Ssc1 odpowiada wyspecjalizowane białko typu-j nazywane u S. cerevisiae Pam18 lub Tim14 [32,33]. Zaś inicjacja kolejnego cyklu wiązania polipeptydu przez cząsteczkę Ssc1 stymulowana jest przez czynnik wymiany nukleotydu Mge1[34]. Pochodzenie ewolucyjne Pam18 jest nieznane. Wiadomo, że jego odpowiedniki występują we wszystkich komórkach eukariotycznych a ich unikatowa i zachowana w procesie ewolucji struktura domenowa odróżnia je od innych białek typu-j, z którymi łączy je jedynie obecność domeny-j [35,36]. W przeciwieństwie do Mdj1 czy DnaJ, Pam18 nie wiąże substratu białkowego [32,33]. Dlatego jego jedyną funkcją w procesie translokacji polipeptydu jest stymulacja aktywności ATPazowej mthsp70, Ssc1. Struktura domenowa Pam18 umożliwia jego efektywne funkcjonowanie w procesie importu polipeptydów. Domena-J zlokalizowana jest w macierzy mitochondrialnej, zaś połączona z nią domena transbłonowa lokalizuje Pam18 w błonie wewnętrznej mitochondriów [35]. Główny mechanizm lokalizujący Pam18 w bezpośredniej bliskości kanału transportowego polega na oddziaływaniu z innym białkiem nazywanym Pam16 lub Tim16 [37]. Podobieństwo struktury i sekwencji białek Pam 18 i 16 wskazuje na ich wspólne pochodzenie. Jednak Pam 16 posiada zdegenerowaną domenę-j, w której brakuje sekwencji HPD tak więc białko to nie posiada zdolności stymulacji ATPazy Ssc1 [38]. Zamiast tego Pam16 pełni rolę strukturalną. N-końcowa domena Pam16 bezpośrednio oddziałuje z białkami kanału transportowego zaś domena-j tego białka wiąże domeną-j białka Pam18 lokalizując je w miejscu umożliwiającym jego funkcjonalne oddziaływanie z Ssc1 [37]. Ewolucyjne pochodzenie Pam16 nie jest znane. Jednak jego występowanie we wszystkich komórkach eukariotycznych sugeruje, że mechanizm lokalizacji Pam18 poprzez oddziaływanie z Pam16 jest ewolucyjnie stary [39]. Być może po duplikacji pierwotnego genu Pam18/16 jego kopie uległy funkcjonalnemu różnicowaniu. Pam 18 zachował zdolności stymulacji ATPazy podczas gdy Pam16 wyspecjalizował się w oddziaływaniu z białkami kanału transportowego. Tym samym w procesie ewolucji utrwalił się skomplikowany mechanizm ich współdziałania umożliwiający efektywny transport polipeptydów przez kanał wewnętrznej błony mitochondrialnej. Kolejna duplikacja genu Pam18 legła u podstaw powstania dodatkowej domeny tego białka występującej u S. cerevisiae i innych blisko spokrewnionych gatunków drożdży [35]. Oprócz opisanych powyżej domeny-j i domeny transbłonowej białko Pam18 drożdży posiada dodatkową domenę zlokalizowaną w przestrzeni międzybłonowej mitochondriów. Domena ta umożliwia bezpośrednie oddziaływanie 72

5 pomiędzy Pam18 a białkiem kanału transportowego zlokalizowanym w przestrzeni międzybłonowej tym samym dodatkowo stabilizując położenie Pam18 w bezpośrednim sąsiedztwie kanału transportowego [40]. Pochodzenie ewolucyjne dodatkowej domeny międzybłonowej jest obiektem spekulacji. Jedna z hipotez zakłada, że do powstania tej domeny doszło dzięki duplikacji genu Pam18 [35]. Druga kopia genu, nazywana Mdj2, różni się od Pam18 brakiem domeny międzybłonowej oraz tym, że jej delecja nie jest letalna a jedynie powoduje obniżone tempo wzrostu drożdży w warunkach ściśle beztlenowych [32,33,35,40]. Być może po duplikacji mutacja polegająca na przesunięciu ramki odczytu doprowadziła do powstania pierwotnej wersji domeny międzybłonowej białka Pam18. Domena ta różnicowała się stopniowo uzyskując zdolność oddziaływania z białkiem kanału transportowego doprowadzając do wiodącej roli Pam18 w procesie importu białek. Ten scenariusz ewolucyjny wymagał obecności funkcjonalnego białka Mdj2, które na wczesnych etapach różnicowania domeny międzybłonowej zabezpieczało komórkę przed ewentualnym obniżenie aktywności Pam18. Lokalizacja Pam18 w okolicach kanału transportowego może sugerować, że białko to samodzielnie rekrutuje Ssc1 do miejsca jego działania. Tymczasem za lokalizację Ssc1 odpowiada jego bezpośrednie oddziaływanie z białkiem Tim44 będącym jednym z komponentów strukturalnych kompleksu białek powiązanych z kanałem transportowym [28,29]. Jako, że oddziaływanie Ssc1-Tim44 nie wykorzystuje typowego mechanizmu wiązania substratu białkowego przez Hsp70 można przypuszczać, że jest to wtórna właściwość mitochondrialnego Hsp70, która ewoluowała pod wpływem presji selekcyjnej na efektywny import białek mitochondrialnych i nie była obecna u bakteryjnych przodków. Podsumowując, dwie zmiany umożliwiły przekształcenie mitochondrialnego Hsp70 w kluczowy element systemu odpowiedzialnego za import białek mitochondrialnych: (1) wykorzystanie w tym procesie nowego wyspecjalizowanego białka typu-j oraz powstanie nowego oddziaływania pomiędzy mitochondrialnym Hsp70 a białkiem Tim44. Białko Tim44 jest cząsteczką o strukturze pierwszorzędowej zachowanej w ewolucji, składnikiem kompleksu białek związanych z kanałem transportowym wewnętrznej błony mitochondriów. SYSTEM HSP70 ZAANGAŻOWANY W MITOCHONDRIALNĄ BIOGENEZĘ CENTRÓW ŻELAZO-SIARKOWYCH Biorąc pod uwagę, że mitochondria odziedziczyły od bakteryjnych przodków wiele szlaków biochemicznych nie jest zaskakujące, że stanowią one metaboliczne centrum komórki eukariotycznej. Jedną z kluczowych funkcji mitochondriów jest synteza centrów żelazo-siarkowych (FeS) będących grupami prostetycznymi licznych białek komórkowych [41]. Centra FeS występują między innymi w białkach mitochondrialnych zaangażowanych w proces fosforylacji oksydacyjnej oraz w wielu innych białkach zlokalizowanych we wszystkich przedziałach komórki eukariotycznej. U człowieka zaburzenie procesu mitochondrialnej biogenezy FeS prowadzi do wielu schorzeń [42]. Pośród trzech alternatywnych szlaków biogenezy FeS obecnych u bakterii, tylko jeden nazywany ISC (ang. iron- -sulfur-cluster) został odziedziczony przez mitochondria. W tym szlaku centrum FeS jest najpierw syntetyzowane w obrębie białka rusztowania IscU a następnie przenoszone z IscU na białka docelowe. U bakterii w reakcji transferu FeS uczestniczy wyspecjalizowany system białek Hsp70 składający się z białka Hsp70 HscA oraz białka typu-j HscB [43]. Pochodzenie ewolucyjne tego systemu nie jest znane ale jest on obecny we wszystkich gatunkach bakterii u których funkcjonuje szlak ISC [44]. Cechą odróżniającą go od podstawowego systemu bakteryjnych białek Hsp70 DnaK/ DnaJ/GrpE jest wysoka specyficzność zarówno względem substratu białkowego, którym jest wyłącznie IscU, jak również względem białka pomocniczego typu-j, którym jest wyłącznie HscB. W przypadku HscA/HscB funkcjonowanie cyklu wiązania substratu białkowego nie wymaga udziału czynnika wymiany nukleotydu [43]. Wynika to z faktu, że HscA wiąże ATP mniej stabilnie niż DnaK i wymiana nukleotydu po zakończeniu cyklu oddziaływania z IscU zachodzi spontanicznie. Chociaż wiele bakterii oraz wszystkie eukarionty wykorzystują system Hsp70 do przeniesienia centrów FeS z białka rusztowania na białka docelowe to zmiany w obrębie tego systemu, które obserwujemy w procesie ewolucji mitochondriów, dobrze ilustrują zarówno plastyczność jak też specjalizację jego komponentów. Mitochondria odziedziczyły od bakteryjnych przodków większość ale nie wszystkie komponenty białkowe szlaku ISC. Zarówno białko rusztowanie (Isu u S. cerevisiae) oraz białko typu-j (Jac1 u S. cerevisiae) obecne są u wszystkich eukariontów. Tymczasem gen kodujący wyspecjalizowane Hsp70 HscA został utracony w procesie ewolucji mitochondriów. Jego odpowiednika (ortologa) nie zidentyfikowano w żadnym z badanych dotychczas genomów eukariotycznych [45]. Większość eukariontów, w tym również człowiek, koduje tylko jeden mitochondrialny Hsp70 blisko spokrewniony z bakteryjnym białkiem DnaK [11]. Zebrane dotychczas dane sugerują, że ten wielofunkcyjny mitochondrialny Hsp70 zastąpił w procesie biogenezy centrów FeS wyspecjalizowane białko bakteryjne [46]. Podobnie jak jego bakteryjny odpowiednik mitochondrialny Hsp70 współpracuje z wyspecjalizowanym białkiem typu-j Jac1 co umożliwia wiązanie białka rusztowania Isu a w konsekwencji transfer centrów FeS na białka docelowe. Ta historia ewolucyjna ma dalszy ciąg. Grupa gatunków drożdży blisko spokrewnionych z S. cerevisiae posiada mitochondrialne białko Hsp70 Ssq1, które funkcjonuje wyłącznie w procesie biogenezy centrów FeS! Jak to jest możliwe? Analiza ewolucyjna wykazała, że Ssq1 powstał ok. 400 mln lat temu u wspólnego przodka Candida albicans i S. cerevisiae w wyniku duplikacji genu kodującego wielofunkcyjne mitochondrialne Hsp70 [45]. Po duplikacji jedna kopia zachowała właściwości typowe dla mitochondrialnego Hsp70 funkcjonując w procesach fałdowanie łańcucha polipeptydowego białek, ochrony białek przed skutkami stresu, imporcie białek mitochondrialnych i utrzymaniu mtdna. Druga kopia, uległa specjalizacji i funkcjonuje wyłącznie w procesie biogenezy centrów FeS [11]. Wyspecjalizowane Postępy Biochemii 62 (2)

6 białko Ssq1 charakteryzuje wysokie powinowactwo zarówno do białka typu-j Jac1 jak też do substratu białkowego Isu [47-50]. Jednocześnie Ssq1 nie współpracuje z innymi białkami typu-j (Mdj1 i Pam18) oraz nie wiąże różnorodnych substratów białkowych oddziałujących z wielofunkcyjnym mitochondrialnym Hsp70 [45,47]. Tym samym białko Ssq1 upodobniło się biochemicznie do bakteryjnego HscA wyspecjalizowanego w biogenezie centrów FeS. Jednak w przeciwieństwie do HscA a podobnie do DnaK oraz do mitochondrialnego Hsp70 cykl wiązania substratu przez Ssq1 uzależniony jest od funkcji czynnika wymiany nukleotydu Mge1 [47]. Specjalizacja Ssq1 to przykład ewolucyjnej konwergentnej na poziomie biochemicznym. Duplikacja genu kodującego mitochondrialne Hsp70 umożliwiła odtworzenie wyspecjalizowanego systemu białek Hsp70, który funkcjonował u bakteryjnych przodków mitochondriów. Pojawieniu się Ssq1 towarzyszyły zmiany strukturalne współpracującego z nim białka typu-j Jac1 [51]. U gatunków, w których Jac1 współwystępuje z Ssq1 obserwuje się zmiany struktury domeny-j. W szczególności skróceniu uległy zarówno pętla łącząca α-helisy II i III jak też α-helisa III (Ryc. 1). Badania biochemiczne pokazały, że te zmiany strukturalne oraz liczne podstawienia aminokwasowe w obrębie α-helisy II odpowiedzialne są za wysokie powinowactwo oddziaływania białek Jac1 i Ssq1[46]. Jest to unikatowy przykład ko-ewolucji białek systemu Hsp70 prowadzący do ich specjalizacji. Zmienione białko Jac1 niezbyt efektywnie współpracuje z wielofunkcyjnym mitochondrialnym Hsp70. Zarówno wyspecjalizowane jak też wielofunkcyjne białka Hsp70 wykorzystują do transferu centrów FeS typowy mechanizm cyklicznego oddziaływania z substratem białkowym. W mitochondriach drożdży S. cerevisiae proces ten inicjuje białko Jac1, które oprócz N-końcowej domeny-j posiada unikatową domenę C-końcową wyspecjalizowaną w wiązaniu białka rusztowania Isu [52,53]. Molekularny mechanizm tego oddziaływania jest taki sam u bakteryjnych i mitochondrialnych odpowiedników Jac1. Kompleks Jac1- -Isu oddziałuje z Ssq1-ATP co prowadzi do stymulacji aktywności ATPazowej i stabilizacji wiązania Isu przez Ssq1 [47]. Chociaż molekularny mechanizm transferu centrum nie został jeszcze poznany przypuszcza się, że zmiany konformacyjne w obrębie białka rusztowania Isu wywołane jego oddziaływaniem z Ssq1 prowadzą do destabilizacji wiązania centrum FeS i umożliwiają jego przekazanie na białka docelowe[54]. W systemie mitochondrialnym czynnik wymiany nukleotydów Mge1 promuje uwolnienie Isu i rozpoczęcie nowego cyklu wiązania [47]. Badania z wykorzystaniem drożdży S. cerevisiae pokazały również, że Jac1 nie tylko wiąże Isu ale również konkuruje o to wiązanie z kompleksem białek odpowiedzialnych za syntezę FeS w obrębie Isu [55,56]. Ponad to Isu w kompleksie z Jac1 chronione jest przed proteolizą katalizowaną przez mitochondrialną proteazę Pim1 [57]. Z kolei Ssq1 ma zdolność bezpośredniego oddziaływania z jednym z białek docelowych Grx5 [58]. Sugeruje to, że białka systemu Hsp70 zaangażowane w proces biogenezy centrów FeS posiadają aktywności biochemiczne wykraczające poza typowy mechanizm cyklicznego wiązania substratu białkowego. Dotychczas trudno odpowiedzieć na pytanie czy specjalizacja białka Hsp70 zaangażowanego w biogenezę centrów FeS drożdży ma znaczenie adaptacyjne. Z jednej strony żaden z gatunków, które różnicowały się po duplikacji mitochondrialnego Hsp70 nie utracił genu kodującego Ssq1 [11] z drugiej zaś strony większość eukariontów funkcjonuje bez tego białka. Dalsze badania tego systemu powinny rzucić nowe światło na funkcjonalne znaczenie różnicowania systemów Hsp70. PODSUMOWANIE WSZECHSTRONNOŚĆ SYSTEMÓW HSP70 UMOŻLIWIA ICH WYKORZYSTANIE W LICZNYCH PROCESACH BIOLOGICZNYCH Ewolucyjna wszechstronność systemów Hsp70 opiera się na dwóch podstawowych mechanizmach adaptacyjnych (1) wysoce specyficznym oddziaływaniu z substratem białkowym uwarunkowanym albo bezpośrednią specjalizacją oddziaływania białka Hsp70 z substratem (oddziaływanie Ssq1-Isu) i/lub poprzez specyficzne oddziaływanie białek typu-j z określonymi substratami kierowanymi następnie do partnerskiego Hsp70 (oddziaływanie Jac1-Isu), (2) rekrutacji białka Hsp70 do miejsca jego działania albo poprzez bezpośrednie oddziaływanie Hsp70 z białkami nie będącymi substratami białkowymi (oddziaływanie mitochondrialnego Hsp70 z Tim44) lub przez lokalizację odpowiedniego białka typu-j w miejscu działania Hsp70 (Mdj1 w kompleksie z mtdna). Wymienione powyżej strategie ewolucyjne nie ograniczają się do mitochondrialnych Hsp70, jednak system ten dobrze ilustruje mechanizmy różnicowania Hsp70 wykorzystywane we wszystkich przedziałach komórki eukariotycznej. PIŚMIENNICTWO 1. Kampinga HH, Craig EA (2010) The HSP70 chaperone machinery: J proteins as drivers of functional specificity. Nat Rev Mol Cell Biol 11: Mayer MP, Bukau B (2005) Hsp70 chaperones: cellular functions and molecular mechanism. Cell Mol Life Sci 62: Kim YE, Hipp MS, Bracher A, Hayer-Hartl M, Hartl FU (2013) Molecular chaperone functions in protein folding and proteostasis. Annu Rev Biochem 82: Zhuravleva A, Clerico EM, Gierasch LM (2012) An interdomain energetic tug-of-war creates the allosterically active state in Hsp70 molecular chaperones. Cell 151: Qi R, Sarbeng EB, Liu Q, Le KQ, Xu X, Xu H, Yang J, Wong JL, Vorvis C, Hendrickson WA, Zhou L, Liu Q (2013) Allosteric opening of the polypeptide-binding site when an Hsp70 binds ATP. Nat Struct Mol Biol 20: Mapa K, Sikor M, Kudryavtsev V, Waegemann K, Kalinin S, Seidel CA, Neupert W, Lamb DC, Mokranjac D (2010) The conformational dynamics of the mitochondrial Hsp70 chaperone. Mol Cell 38: Craig EA, Huang P, Aron R, Andrew A (2006) The diverse roles of J- proteins, the obligate Hsp70 co-chaperone. Rev Physiol Biochem Pharmacol 156: Cyr DM (2008) Swapping nucleotides, tuning Hsp70. Cell 133: Hennessy F, Nicoll WS, Zimmermann R, Cheetham ME, Blatch GL (2005) Not all J domains are created equal: implications for the specificity of Hsp40-Hsp70 interactions. Prot Sci 14: Hageman J, Kampinga HH (2009) Computational analysis of the human HSPH/HSPA/DNAJ family and cloning of a human HSPH/ HSPA/DNAJ expression library. Cell Stress Chaperones 14:

7 11. Kominek J, Marszalek J, Neuveglise C, Craig EA, Williams BL (2013) The complex evolutionary dynamics of Hsp70s: a genomic and functional perspective. Genome Biol Evol 5: Mayer MP (2005) Recruitment of Hsp70 chaperones: a crucial part of viral survival strategies. Rev Physiol Biochem Pharmacol 153: Gray MW (2012) Mitochondrial evolution. Cold Spring Harb Perspect Biol 4: a Genevaux P, Georgopoulos C, Kelley WL (2007) The Hsp70 chaperone machines of Escherichia coli: a paradigm for the repartition of chaperone functions. Mol Microbiol 66: Deloche O, Liberek K, Zylicz M, Georgopoulos C (1997) Purification and biochemical properties of Saccharomyces cerevisiae Mdj1p, the mitochondrial DnaJ homologue. J Biol Chem 272: Lisse T, Schwarz E (2000) Functional specificity of the mitochondrial DnaJ protein, Mdj1p, in Saccharomyces cerevisiae. Mol Gen Genet 263: Westermann B, Gaume B, Herrmann JM, Neupert W, Schwarz E (1996) Role of the mitochondrial DnaJ homolog Mdj1p as a chaperone for mitochondrially synthesized and imported proteins. Mol Cell Biol 16: Prip-Buus C, Westerman B, Schmitt M, Langer T, Neupert W, Schwarz E (1996) Role of the mitochondrial DnaJ homologue, Mdj1p, in the prevention of heat-induced protein aggregation. FEBS Lett 380: Germaniuk A, Liberek K, Marszalek J (2002) A bichaperone (Hsp70- Hsp78) system restores mitochondrial DNA synthesis following thermal inactivation of Mip1p polymerase. J Biol Chem 277: Duchniewicz M, Germaniuk A, Westermann B, Neupert W, Schwarz E, Marszalek J (1999) Dual role of the mitochondrial chaperone Mdj1p in inheritance of mitochondrial DNA in yeast. Mol Cell Biol 19: Ciesielski GL, Plotka M, Manicki M, Schilke BA, Dutkiewicz R, Sahi C, Marszalek J, Craig EA (2013) Nucleoid localization of Hsp40 Mdj1 is important for its function in maintenance of mitochondrial DNA. Biochim Biophys Acta 1833: Chen XJ, Butow RA (2005) The organization and inheritance of the mitochondrial genome. Nat Rev Genet 6: Holt IJ (2010) Zen and the art of mitochondrial DNA maintenance. Trends Genet 26: Spelbrink JN (2010) Functional organization of mammalian mitochondrial DNA in nucleoids: history, recent developments, and future challenges. IUBMB Life 62: Macierzanka M, Plotka M, Pryputniewicz-Drobinska D, Lewandowska A, Lightowlers R, Marszalek J (2008) Maintenance and stabilization of mtdna can be facilitated by the DNA-binding activity of Ilv5p. Biochim Biophys Acta 1783: Liberek K, Georgopoulos C, Zylicz M (1988) Role of the Escherichia coli DnaK and DnaJ heat shock proteins in the initiation of bacteriophage lambda DNA replication. Proc Nat Acad Sci USA 85: Konieczny I, Marszalek J (1995) The requirement for molecular chaperones in lambda DNA replication is reduced by the mutation pi in lambda P gene, which weakens the interaction between lambda P protein and DnaB helicase. J Biol Chem 270: Chacinska A, Koehler CM, Milenkovic D, Lithgow T, Pfanner N (2009) Importing mitochondrial proteins: machineries and mechanisms. Cell 138: Neupert W, Herrmann JM (2007) Translocation of proteins into mitochondria. Annu Rev Biochem 76: Dolezal P, Likic V, Tachezy J, Lithgow T (2006) Evolution of the molecular machines for protein import into mitochondria. Science 313: Tong J, Dolezal P, Selkrig J, Crawford S, Simpson AG, Noinaj N, Buchanan SK, Gabriel K, Lithgow T (2011) Ancestral and derived protein import pathways in the mitochondrion of Reclinomonas americana. Mol Biol Evol 28: Mokranjac D, Sichting M, Neupert W, Hell K (2003) Tim14, a novel key component of the import motor of the TIM23 protein translocase of mitochondria. EMBO J 22: D silva PD, Schilke B, Walter W, Andrew A, Craig EA (2003) J protein c ochaperone of the mitochondrial inner membrane required for protein import into the mitochondrial matrix. Proc Nat Acad Sci USA 100: Liu Q, D silva P, Walter W, Marszalek J, Craig EA (2003) Regulated cycling of mitochondrial Hsp70 at the protein import channel. Science 300: Hayashi M, Schilke B, Marszalek J, Williams B, Craig EA (2011) Ancient gene duplication provided a key molecular step for anaerobic growth of baker s yeast. Mol Biol Evol 28: Chen X, Ghazanfar B, Khan AR, Hayat S, Cheng Z (2013) Comparative analysis of putative orthologues of mitochondrial import motor subunit: Pam18 and Pam16 in plants. PLoS One 8: e Mokranjac D, Bourenkov G, Hell K, Neupert W, Groll M (2006) Structure and function of Tim14 and Tim16, the J and J-like components of the mitochondrial protein import motor. EMBO J 25: Li Y, Dudek J, Guiard B, Pfanner N, Rehling P, Voos W (2004) The presequence translocase-associated protein import motor of mitochondria. Pam16 functions in an antagonistic manner to Pam18. J Biol Chem 279: Sinha D, Joshi N, Chittoor B, Samji P, D silva P (2010) Role of Magmas in protein transport and human mitochondria biogenesis. Hum Mol Genet 19: Chacinska A, Lind M, Frazier AE, Dudek J, Meisinger C, Geissler A, Sickmann A, Meyer HE, Truscott KN, Guiard B, Pfanner N, Rehling P (2005) Mitochondrial presequence translocase: switching between TOM tethering and motor recruitment involves Tim21 and Tim17. Cell 120: Lill R, Hoffmann B, Molik S, Pierik AJ, Rietzschel N, Stehling O, Uzarska MA, Webert H, Wilbrecht C, Muhlenhoff U (2012) The role of mitochondria in cellular iron-sulfur protein biogenesis and iron metabolism. Biochim Biophys Acta 1823: Beilschmidt LK, Puccio HM (2014) Mammalian Fe-S cluster biogenesis and its implication in disease. Biochimie 100: Vickery LE, Cupp-Vickery JR (2007) Molecular chaperones HscA/ Ssq1 and HscB/Jac1 and their roles in iron-sulfur protein maturation. Crit Rev Biochem Mol Biol 42: Huynen MA, Snel B, Bork P, Gibson TJ (2001) The phylogenetic distribution of frataxin indicates a role in iron-sulfur cluster protein assembly. Hum Mol Genet 10: Schilke B, Williams B, Knieszner H, Pukszta S, D silva P, Craig EA, Marszalek J (2006) Evolution of mitochondrial chaperones utilized in Fe-S cluster biogenesis. Curr Biol 16: Delewski W, Paterkiewicz B, Manicki M, Schilke B, Tomiczek B, Ciesielski SJ, Nierzwicki L, Czub J, Dutkiewicz R, Craig EA, Marszalek J (2016) Iron-sulfur cluster biogenesis chaperones: evidence for emergence of mutational robustness of a highly specific protein-protein interaction. Mol Biol Evol 33: Dutkiewicz R, Schilke B, Knieszner H, Walter W, Craig EA, Marszalek J (2003) Ssq1, a mitochondrial Hsp70 involved in iron-sulfur (Fe/S) center biogenesis. Similarities to and differences from its bacterial counterpart. J Biol Chem 278: Dutkiewicz R, Schilke B, Cheng S, Knieszner H, Craig EA, Marszalek J (2004) Sequence-specific interaction between mitochondrial Fe-S scaffold protein Isu and Hsp70 Ssq1 is essential for their in vivo function. J Biol Chem 279: Knieszner H, Schilke B, Dutkiewicz R, D silva P, Cheng S, Ohlson M, Craig EA, Marszalek J (2005) Compensation for a defective interaction of the hsp70 ssq1 with the mitochondrial Fe-S cluster scaffold isu. J Biol Chem 280: Dutkiewicz R, Marszalek J, Schilke B, Craig EA, Lill R, Muhlenhoff U (2006) The Hsp70 chaperone Ssq1p is dispensable for iron-sulfur cluster formation on the scaffold protein Isu1p. J Biol Chem 281: Pukszta S, Schilke B, Dutkiewicz R, Kominek J, Moczulska K, Stepien B, Reitenga KG, Bujnicki JM, Williams B, Craig EA, Marszalek J (2010) Co-evolution-driven switch of J-protein specificity towards an Hsp70 partner. EMBO Reports 11: Postępy Biochemii 62 (2)

8 52. Andrew AJ, Dutkiewicz R, Knieszner H, Craig EA, Marszalek J (2006) Characterization of the interaction between the J-protein Jac1p and the scaffold for Fe-S cluster biogenesis, Isu1p. J Biol Chem 281: Ciesielski SJ, Schilke BA, Osipiuk J, Bigelow L, Mulligan R, Majewska J, Joachimiak A, Marszalek J, Craig EA, Dutkiewicz R (2012) Interaction of J-protein co-chaperone Jac1 with Fe-S scaffold Isu is indispensable in vivo and conserved in evolution. J Mol Biol 417: Chandramouli K, Johnson MK (2006) HscA and HscB stimulate [2Fe- 2S] cluster transfer from IscU to apoferredoxin in an ATP-dependent reaction. Biochemistry 45: Majewska J, Ciesielski SJ, Schilke B, Kominek J, Blenska A, Delewski W, Song JY, Marszalek J, Craig EA, Dutkiewicz R (2013) Binding of the chaperone Jac1 protein and cysteine desulfurase Nfs1 to the ironsulfur cluster scaffold Isu protein is mutually exclusive. J Biol Chem 288: Manicki M, Majewska J, Ciesielski S, Schilke B, Blenska A, Kominek J, Marszalek J, Craig EA, Dutkiewicz R (2014) Overlapping binding sites of the frataxin homologue assembly factor and the heat shock protein 70 transfer factor on the Isu iron-sulfur cluster scaffold protein. J Biol Chem 289: Ciesielski SJ, Schilke B, Marszalek J, Craig EA (2016) Protection of scaffold protein Isu from degradation by the Lon protease Pim1 as a component of Fe-S cluster biogenesis regulation. Molecular Biol Cell (in press) 58. Uzarska MA, Dutkiewicz R, Freibert SA, Lill R, Muhlenhoff U (2013) The mitochondrial Hsp70 chaperone Ssq1 facilitates Fe/S cluster transfer from Isu1 to Grx5 by complex formation. Mol Biol Cell 24: Mitochondrial Hsp70 function and evolution Jaroslaw Marszalek Laboratory of Evolutionary Biochemistry, Intercollegiate Faculty of Biotechnology, University of Gdansk and Medical University of Gdansk, 8 Antoniego Abrahama St., Gdansk, Poland jaroslaw.marszalek@biotech.ug.edu.pl Key words: J-protein co-chaperones, mitochondrial DNA, mitochondrial protein import, iron-sulfur clusters, protein evolution ABSTRACT Hsp70 molecular chaperones function in variety of critical cellular processes, including protein folding, translocation of proteins across membranes and assembly/disassembly of protein complexes. Hsp70 systems consist of a core Hsp70 protein and its co-chaperones: J-protein and nucleotide release factor NRF. These co-chaperones regulate the cycle of interaction with protein substrate via stimulating the ATPase activity of Hsp70 (J-protein) and promoting nucleotide exchange (NRF). Compartments within the eukaryotic cell often contain multiple Hsp70s, J-proteins and NRFs. The capabilities of these systems to carry out diverse cellular functions results from either specialization of an Hsp70 or by interaction of multifunctional Hsp70 with an array of specialized J-proteins. The well-studied Hsp70 systems of yeast mitochondria provide an excellent example of functional divergence and evolution of Hsp70 machineries. 76