PL B1. UNIWERSYTET MARII CURIE-SKŁODOWSKIEJ, Lublin, PL BUP 16/16. MONIKA JANCZAREK, Lublin, PL KAMILA RACHWAŁ, Iwonicz-Zdrój, PL

Transkrypt

1 PL B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (51) Int.Cl. C12P 19/04 ( ) A61K 8/73 ( ) A61Q 5/12 ( ) (54) Heteropolisacharyd jako metabolit Rhizobium leguminosarum bv. trifolii Rt24.2 do zastosowania w pielęgnacji włosów oraz preparat na bazie tego heteropolisacharydu (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 16/16 (73) Uprawniony z patentu: UNIWERSYTET MARII CURIE-SKŁODOWSKIEJ, Lublin, PL (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 09/17 (72) Twórca(y) wynalazku: MONIKA JANCZAREK, Lublin, PL KAMILA RACHWAŁ, Iwonicz-Zdrój, PL

2 2 PL B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest nowe zastosowanie polisacharydu będącego zewnątrzkomórkowym heteropolisacharydem produkowanym przez szczep Rhizobium leguminosarum bv. trifolii Rt24.2, jako odżywki kondycjonującej, regenerującej i ochraniającej włosy oraz preparat na bazie tego heteropolisacharydu. Rhizobium to wysokowydajne bakterie, powszechnie występujące w glebach uprawnych, [Toro N., World J. Microbiol. Biotech., 1996, Nr 12, str ], [Martyniuk S. i wsp., Bot. Lithuanica, 1999, Suppl. 3, str ], znajdujące zastosowanie do produkcji biopreparatów zwiększających plonowanie roślin, dzięki swym metabolitom chitolipooligosacharydom czynnikom Nod i redukcji w brodawkach korzeni nieprzyswajalnego azotu atmosferycznego do azotu amonowego wykorzystywanego przez rośliny. Opatentowano kilka szczepów bakterii z rodzaju Rhizobium stymulujących kiełkowanie i wzrost roślin motylkowatych, przeznaczonych do produkcji biopreparatów i bionawozów, wśród których wymieniany m.in. w opisie patentowym SU Rhizobium leguminosarum 240b, Rhizobium leguminosarum bv. trifolii KO17 w opisie PL oraz Rhizobium leguminosarum bv. viciae GR09 w opisie PL Niektóre bakteryjne egzopolisacharydy (EPS) syntezowane przez bakterie Rhizobium, znajdują zastosowanie w innych dziedzinach życia, jak np. jako czynniki immunostymulujące w medycynie i farmacji, jako zagęstniki i żele w przemyśle spożywczym, czy w ekologii do usuwania zanieczyszczeń metalami ciężkimi i olejami (Freitas i wsp., Trends in Biotechnology 2011, 29: ). Użycie bakterii Rhizobium w przemyśle kosmetycznym zostało opisane jedynie w nielicznych przypadkach. Wyizolowany ze szczepu Rhizobium etli YAS34 egzopolisacharyd (EPS), został ujawniony w opisie patentowym US jako składnik kremów nawilżających, toników, żeli do kąpieli, żeli do włosów, gdzie występuje w stosunkowo wysokich stężeniach od 0,25% do 1% składu preparatu, w zależności od rodzaju kosmetyku. Zastosowanie EPS jako składnika żelu do włosów w stężeniu jak wyżej, powoduje konieczność spłukiwania takiego preparatu, co nie zapewnia włosom, zwłaszcza suchym i zniszczonym szczególnie po zabiegach rozjaśniania, farbowania czy trwałej ondulacji, dostatecznej ochrony, np. przed promieniowaniem słonecznym. Według patentu CN , EPS pochodzący z Rhizobium radiobacter S10, znajduje zastosowanie jako zagęstnik w przemyśle spożywczym oraz medycynie, natomiast polisacharyd produkowany przez Rhizobium tropici ATCC49672, według patentu US , może być wykorzystany do produkcji suchej soli, a jego dodanie w stężeniu 0,1% do gleby, jak opisano w patencie US , zapobiega jej erozji. Z kolei z opisu patentowego CN wynika możliwość zastosowania gumy rizobiowej, otrzymywanej w wyniku fermentacji, jako dodatek do kremów o właściwościach nawilżających i wygładzających. Znane kosmetyki do pielęgnacji włosów, zawierające głównie polisacharydy pochodzenia roślinnego, mają złożony skład i zawierają liczne substancje syntetyczne, zwłaszcza pochodne silikonu, hydrolizaty białek, substancje zagęszczające, stabilizujące, konserwujące czy też zapachowe, jak np. chlorek cetylotrójmetyloamoniowy, chlorek ornityny, polidimetylosiloksan, polyquaternium 11 i 16, PEG 12, benzoesan sodu, fenoksyetanol, aldehyd cynamonowy, pochodne PEG/PPG, linalol, które mogą podrażniać skórę, a nawet w większych stężeniach, wywoływać reakcje alergiczne. Pochodne silikonu, gromadząc się na włosach powodują ich niekorzystne nadmierne obciążanie, są trudne do usunięcia i wymagają użycia szamponów o wysokiej zawartości detergentów, co w konsekwencji powoduje dodatkowe niszczenie struktury włosów. Nieliczne spośród kosmetyków do włosów, zawierają polisacharydy bakteryjne, jak np. guma ksantanowa, produkowana przez bakterie Xanthomonas i stosowana, jak wynika z opisów patentowych WO i FR , w różnych stężeniach od 15% do 0,4% składu kompozycji, ze względu na swoje właściwości żelujące. Większość dostępnych na rynku produktów do pielęgnacji włosów charakteryzuje się obojętnym lub lekko zasadowym ph, co może niekorzystnie wpływać na strukturę włosów, a w szczególności powodować rozchylanie się ich łusek. Różnorodne czynniki środowiskowe, osłabiające i uszkadzające strukturę włosów, stale rosnąca liczba osób z alergiami skórnymi, a także zwiększające się wymagania co do skuteczności preparatów

3 PL B1 3 regenerujących i pielęgnujących włosy, a także zapewniających bezpieczeństwo ich stosowania, powodują, iż rośnie zapotrzebowanie na nowe tego rodzaju produkty. Celem wynalazku było więc opracowanie preparatu bezpiecznego w użytkowaniu, o dużej skuteczności w działaniu, z wyeliminowaniem syntetycznych jego składników chemicznych. Z uwagi na fakt, iż w żadnym ze znanych opracowań nie opublikowano zastosowania szczepu Rhizobium trifolii 24 jako preparatu do poprawiania kondycji ludzkich włosów, podjęto badania nad nowym zastosowaniem tego szczepu bakterii. Nieoczekiwanie okazało się, że obiecujące wyniki w zakresie rewitalizacji struktury włosów wykazuje heteropolisacharyd, będący metabolitem szczepu bakterii Rhizobium leguminosarum bv. trifolii Rt24.2, stanowiącego pochodną Rhizobium trifolii 24. Szczep Rhizobium leguminosarum bv. trifolii Rt24.2, scharakteryzowany został pod względem genetycznym, mikrobiologicznym i chemicznym w publikacjach M. Janczarek i A. Skorupska, Mol. Plant Microbe Interact. 2007, 20: , M. Janczarek i A. Skorupska, FEMS Microbiol. Lett. 2009, 291: , M. Janczarek i A. Skorupska, Int. J. Mol. Sci. 2011, 12: , M. Janczarek i wsp., BMC Microbiol. 2010, 10: 284, M. Janczarek i wsp., Antonie van Leeuwenhoek 2009, 96: , M. Janczarek i K. Rachwał, Int. J. Mol. Sci. 2013, 14: oraz Robertson i wsp., Plant Physiol. 1981, 67: , O Neill i wsp., J. Biol. Chem. 1991, 266: ; Breedveld i wsp., J. Bacteriol. 1993, 175: Związek ten, jest rozgałęzionym heteropolisacharydem, w którego składzie występują ośmiocukrowe podjednostki zawierające D-glukozę, kwas D-glukuronowy, D-galaktozę, grupę acetylową CH 3 CO, pirogronianową CH 3 COCOO i 3-hydroksybutyrylową CH 3 COHCH 2 COO w molowej proporcji: 4,8;1,8;1;2,1;1,52;0,83. Istotą wynalazku jest opisany wyżej, heteropolisacharyd produkowany przez szczep Rhizobium leguminosarum bv. trifolii Rt24.2, do zastosowania w pielęgnacji włosów jako odżywka kondycjonująca, regenerująca i ochraniająca ich strukturę. Istotą wynalazku jest również preparat do pielęgnacji włosów w postaci wodnego roztworu charakteryzujący się tym, że jego aktywną substancją jest wyżej opisany heteropolisacharyd, będący metabolitem Rhizobium leguminosarum bv. trifolii Rt24.2, występujący w efektywnym stężeniu od 0,01 do 0,05% wag. i sterylnej postaci dla wyeliminowania mikrobiologicznych zakażeń. Jako naturalny, o niewielkim stężeniu jednoskładnikowy roztwór, preparat nie nadbudowuje się na powierzchni włosów i nie obciąża ich, dzięki czemu może być stosowany bez spłukiwania, spełniając ochronną funkcję przed działaniem czynników zewnętrznych. Z kolei sterylne warunki konfekcjonowania preparatu, np. w ampułkach lub saszetkach, eliminują możliwość mikrobiologicznych zakażeń, np. pleśnią i bakteriami obniżającymi jego jakość i skuteczność działania, co jest istotne przy kompozycji wodnej aktywnego składnika EPS, występującego w tak niewielkich ilościach. EPS sprawia, że na całej powierzchni włosa tworzy się cienka warstwa błyszczącego biofilmu, który działa nawilżająco, regenerująco i ochronnie na jego zewnętrzną strukturę. Łuski włosa ściślej do siebie przylegają, przez co zwiększa ich gładkość, połysk, jedwabistość, sprężystość, eliminuje się elektryzowanie i skręcanie włosów oraz ułatwia ich rozczesywanie. Działanie preparatu z zastosowaniem heteropolisacharydu według wynalazku przedstawiono w poniższych przykładach. P r z y k ł a d 1 Szczep bakterii Rhizobium leguminosarum bv. trifolii Rt24.2 hodowano w pożywce 79CA zawierającej 1% glicerol jako źródło węgla, przez 72 h w temp. 28 C, z wytrząsaniem 160 obr/min. W celu wyizolowania EPS, hodowlę poddawano dwukrotnemu wirowaniu przez 45 min. w 4 C, przy obr./min. EPS wytrącano z klarownego supernatantu przy użyciu 96% etanolu schłodzonego do temp. 4 C w proporcji: 1:4 v/v, intensywne mieszając i poddając 24 godz. inkubacji w temp. 4 C. Wytrącony EPS osadzano poprzez wirowanie w ciągu 30 min. w temp. 4 C przy obr./min, a po odparowaniu etanolu, zawieszano w dejonizowanej wodzie i określono jego stężenie metodą kolorymetryczną do oznaczania stężenia cukrów z użyciem antronu. Z EPS o tak oznaczonym stężeniu, sporządzono kilka preparatów o stężeniach biopolimeru: 0,01%, 0,02%, 0,05%, 0,1% i 0,2% wag., w których zanurzano ludzkie włosy i inkubowano przez 15 min w temp. pokojowej, po czym suszono suszarką ok. 5 min.

4 4 PL B1 Obraz włosów z każdej próbki otrzymany ze skaningowego mikroskopu elektronowego przy powiększeniu 2000 razy, porównywano z obrazem próbki kontrolnej, jaką stanowiły włosy nietraktowane EPS. Mając na względzie skuteczność działania preparatu w określonych minimalnych ilościach, przejawiającą się w gładkości włosów widocznej na obrazach mikroskopowych oraz ich połysk, jedwabistość czy sprężystość, a także zdrowy wygląd i zwiększoną objętość, stwierdzone organoleptycznie, określono przedział stężeń tego preparatu od 0,01 do 0,05% wag., dający już widoczne, zadowalające efekty regeneracji kondycjonowania włosów. Obrazy mikroskopowe włosa poddanego działaniu preparatu EPS (z prawej) w zestawieniu z porównywalnym włosem bez odżywki (z lewej) zamieszczono na rysunku i oznaczono kolejno jako fig. 1, 2 i 3 włos pod działaniem preparatu odpowiednio o stęż. 0,01%, 0,02% i 0,05% wag. P r z y k ł a d 2 Dodatkowo, sprawdzono ochronną funkcję odżywki przed działaniem czynników zewnętrznych po kondycjonowaniu włosów zniszczonych wcześniej w wyniku farbowania. Badaną próbkę włosów farbowanych, potraktowano jak w przykładzie 1, preparatem zawierającym 0,05% roztwór wodny EPS, po czym ich wygląd zobrazowano w skaningowym mikroskopie elektronowym przy powiększeniu 2000x (prawy obraz fig. 4). Następnie, próbkę spłukano wodą, wysuszono i wystawiono na działanie promieni słonecznych. Po 1 tygodniu, ponownie zobrazowano włos jak wyżej (lewy obraz fig. 4). Nie zmieniona struktura włosa w obydwu obrazach świadczy o długotrwałym działaniu ochronnym preparatu według wynalazku. Zastrzeżenia patentowe 1. Heteropolisacharyd jako metabolit Rhizobium leguminosarum bv. trifolii Rt24.2, w którego składzie występują ośmiocukrowe podjednostki zawierające D-glukozę, kwas D-glukuronowy, D-galaktozę, grupę acetylową CH 3 CO, pirogronianową CH 3 COCOO i 3-hydroksybutyrylową CH 3 COHCH 2 COO w molowej proporcji: 4,8;1,8;1;2,1;1,52;0,83 do zastosowania w pielęgnacji włosów. 2. Preparat do pielęgnacji włosów w postaci wodnego roztworu, znamienny tym, że jego aktywną substancją jest heteropolisacharyd, będący metabolitem Rhizobium leguminosarum bv. trifolii Rt24.2, opisany w zastrz. 1, występujący w efektywnym stężeniu od 0,01 do 0,05% wag. i sterylnej postaci dla wyeliminowania mikrobiologicznych zakażeń.

5 PL B1 5 Rysunki

6 6 PL B1 Departament Wydawnictw UPRP Cena 2,46 zł (w tym 23% VAT)