Zakład Biofizyki Molekularnej i Bioenergetyki Katedra Fizyki Medycznej i Biofizyki, WFiIS, AGH

Transkrypt

1 dr Alekandra Orzechowska Zakład Biofizyki Molekularnej i Bioenergetyki Katedra Fizyki Medycznej i Biofizyki, WFiIS, AGH D-11, I piętro, pok. 114 Aleksandra.Orzechowska@fis.agh.edu.pl konsultacje: środa, godz informacje:

2 WAŻNE INFORMACJE 1. Regulamin zajęć laboratoryjnych - strony www - ochraniacze na obuwie + fartuchy (obowiązkowe w pracowniach U5!) 2. Instrukcje do ćwiczeń - strony www 3. Podział na podgrupy (ćw. Abs, Fl, Mod,AFM). Nie wolno zmieniać grup! Np. wtorek ćw. Abs gr.7 laboratoryjna (11 osób) przykład gr.7a (6 osób) + gr.7b (5 osób) godz godz Uwaga! MS- nie dzielimy się na podgrupy! 5. Przygotowanie do ćwiczeń- wstęp teoretyczny + instrukcja do ćw. 6.Sprawozdania-2 tygodnie na oddanie-jeśli nie każdy tydzień zwłoki to -10%

3 Pomiaru transportu elektronów na stronie akceptorowej PSII Pomiar i analiza widm fluorescencji modulowanej chlorofilu a w systemie PAM (ang. pulse-amplitude-modulation). Czynniki modyfikujące transfer energii w obrębie PSII dr Aleksandra Orzechowska Wykład dla studentów MSIB Luty 2016

4 Fotosynteza CO 2 Reakcje zachodzące w ciemności Rośliny wyższe Glony Cyjanobakterie H 2 O + CO 2 hν Faza jasna ATP NADPH Węglowodany O 2 Oddychanie O 2 CO 2, H 2 O, energia

5 Co to jest fotosynteza i gdzie zachodzi? CO 2 + 2H 2 S Fotosynteza beztlenowa CO H 2 O Fotosynteza tlenowa światło światło (CH 2 O) +2S + H 2 O (CH 2 O) +O 2 + H 2 O hν

6 Potencjał redox [V] Struktury uczestniczące w transporcie elektronów w fotosystemie II. Schemat (Z) potencjałów redox Protony z zewnątrz tylakoidów Protony wewnątrz tylakoidów

7 Fotosystem II-centrum reakcji D2 D1 Thermosynecoccus elongatus Rutherford et al Trends in Biochemical Sciences CP 43 [32 kd]/ D2 CP 47 [32 kd]/ D1 Monomer zawiera: 36 chlorofili a, 7 karotenoidów, OEC, hem b, hem c, 2 PQ, 2 Pheo, żelazo niehemowe Rozmiary dimeru PS II: 205 Å- długość, 110 Å-szerokość 105Å -głębokość (45 Å w membranie)

8 światło Jednostka fotosyntetyczna 1932, Emerson, Arnold- ilość tlenu wydzielanego w komórkach Chlorella, poddanych działaniu impulsów świetlnych przeniesienie energii [fs] centrum reakcji (RC) Chl Chl Chl Chl stan podstawowy chlorofilu Foton Centrum reakcji- Transfer elektronów Foton Transfer energii Kompleksy antenowe Dla n-krotnego wzrostu odległości pomiędzy donorem a akceptorem, szybkość transferu energii maleje ze współczynnikiem n 6

9 Absorpcja Chlorofil jako fotoreceptor Absorpcja magnezoporfiryna cztery pierścienie pirolowe polien Współczynnik absorbancji 10 5 cm -1 mol -1 chlorofil b chlorofil a fikoerytryna fikocyjanina chlorofil b chlorofil a β-karoten Długość fali [nm] Długość fali [nm] 1905, Michaił Siemionowicz Cwet-rozdział chlorofilu a i b metodą chromatografii kolumnowej

10 Absorpcja światła przez chlorofil S 2 hn Transport elektronów S 1 fotosynteza Fotochemia 20% Ciepło 75-97% Fluorescencja 5% hn c h E Chla S 0 Chl + hν = Cl *

11 Transport elektronów na stronie akceptorowej Fluorymetr FL 3000/S (Photon Systems Instruments, projekt oparty na koncepcji: Trtilek et. al., 1997, J. Lumin , ) 1 Co mierzy? 2 Sygnał fluorescencji chlorofilu z rozdzielczością czasową do 10 us -kinetykę reoksydacji Q A, -efekt Kautsky ego, - pomiary S-states, - rozmiar i heterogeniczność LH w obrębie PSII bez użycia herbicydów wiążących Q B 1.- jednostka kontrolująca 2. - głowica optyczna Materiał badawczy? -zawiesiny chloroplastów, tylakoidów, bakterii, glonów cyjanobakterii, izolowany PS II

12 System optyczny- głowica 1 Źródła światła: Podjednostki diodowe zawierające 3 rodzaje diod elektroluminescencyjnych Actinic flash (F1/F2) (saturating flash) generowane przez 48 diod (λ max =653nm) długość µs 7 centralnie położ. diod (λ max =620 nm) 2-5 µs 1. komora na próbkę detektor (fotodioda- 1cm 2 ) źródła światła Measuring flash (f) 12 peryferyjnie położ. diod (λ max =480 nm) kuweta- 10mm/10 mm, poj. 4cm 3 Actinic light (Aux1/Aux2) Continuous actinic light. Maksymalna intensywność 2,500 µmol (fotonów) m -2.s -1. Kolor standardowy: czerwony, λ max =630 nm.

13 fluorescencja -czas trwania 2-5µs -intensywność 10 3 µe m -2 s -1 -aktywuje wszystkie RC -czas trwania ~25µs -intensywność µe m -2 s -1 -ciągłe wzbudzanie RC -czas trwania ~ sec -intensywność 10 2 µe m -2 s -1 Czas i intensywność- dobierane

14 Plan działania: 1. Przygotowanie tylakoidów z liści rośliny wyższej 2. Odwirowanie. 3. Inkubacja w ciemności. 4. Pomiar efektu Kautsky ego. 5. Badanie wpływu DCMU na efekt Kautsky ego.

15 intensywność fluorescencji Efekt Kautsky ego- krzywa indukcji fluorescencji (Kautsky i Hirsch 1931r) Eksperyment prowadzi się pod wpływem działania ciągłego światła. 0,14 0,12 Krzywa Kautskiego - kontrola WT tylakoidy I (od 20 ms) P (od 200 ms) 0,10 0,08 0,06 0,04 J (~2 ms) F v =F M - F 0 -aktywność PSII -rozpraszanie energii wzbudzenia w postaci ciepła -wydajność transportu elektronów w PSII 0,02 0,00 O (od 50 us) -0,02 1E-4 1E-3 0,01 0, czas [s] zmiany zachowania fluorescencji fotosystemu II rośliny wystawionej na działanie światła. F 0 -efektywność przekazu energii do anten (wskaźnik strat energii wzbudzenia gdy jest ona przekazywana z anten do RC) -RC sa otwarte, Q A całkowicie utlenione Setki [μs] [ms] Dziesiątki [ms] kilka [s] Maksymalna fotochemiczna wydajność PSII F F V M FM F F M Gaszenie FL (PQ and NPQ) F v - wydajność transportu elektronów w PSII F 0 zdolność PSII do przechwytywania energii z LH2

16 intensywnosc fluorescencji znormalizowana do wartosci maksymalnej 1,0 0,8 F v =F M - F 0 0,6 0,4 F M 0,2 0,0 punkty pomiarowe krzywa teoretyczna F 0 1E-4 1E-3 0,01 0, czas [s] Należy odciąć trzy pierwsze punkty pomiarowe i wszystkie punkty poza plateau, których wartość zaczyna się zmniejszać. Najlepiej odciąć tło i znormalizować os y do F M, wtedy y 0 =0. F 0 = A 1 +A 2 F v = ΣA i (i=3,4,5) F t t n 0 KautskyEffect ( t) A 1 exp i y0 i 1 t i

17 Amplitude normalized to Fm Amplitude normalized to Fm Amplitude normalized to Fm Amplitude normalized to Fm Tylakoidy Tylakoidy wzbogacone w PSII 1,0 1,0 0,8 0,8 0,6 0,6 0,4 0,2 0,0 Mutant thylakoids exp. data theoret. data 0,4 0,2 0,0 Mutant BBY exp. data theoret. data 1E-3 0,01 0, time [s] 1E-3 0,01 0, time [s] 1,0 0,8 0,6 1,0 0,8 0,6 WT BBY exp. data theroret. data 0,4 0,2 0,0 1E-4 1E-3 0,01 0, time [s] WT thylakoids exp. data theoret. data Fig. 1. efekt Kautsky ego zmierzony dla tylakoidów izolowanych z: (A) mutant tobacco (B) WT tobacco 0,4 0,2 0,0 1E-4 1E-3 0,01 0, time [s] Fig. 2. efekt Kautsky ego zmierzony dla tylak. wzbogaconych w PSII : (A) mutant tobacco (B) WT tobacco