Regulacja kanałów potasowych przez kwasy tłuszczowe

Transkrypt

1 Regulacja kanałów potasowych przez kwasy tłuszczowe Streszczenie Kanały potasowe, występujące w błonie plazmatycznej jak i błonach wewnątrzkomórkowych są elementem szlaków sygnalizacyjnych, które mogą prowadzić do ochrony jak i uszkodzenia komórki. W warunkach fizjologicznych podlegają one regulacji poprzez specyficzne ligandy (np. ATP) zmiany ph, ciśnienia, temperatury, reaktywne formy tlenu, fosforylację, hormony i wiele innych. Coraz więcej prac wskazuje, iż w regulacji tej uczestniczy również środowisko lipidowe błon, w które kanały te są wbudowywane. Niniejsza praca jest podsumowaniem aktualnej wiedzy w zakresie regulacji aktywności kanałów potasowych przez kwasy tłuszczowe i ich pochodne. Wprowadzenie W latach pięćdziesiątych, Hodgkin i Huxley, zaobserwowali, że transport jonów sodu i potasu w komórkach pobudliwych zachodzi w miejscach charakteryzujących się wysoką selektywnością, a przewodnictwo tych miejsc zależne jest od napięcia elektrycznego na błonie [1]. Obserwacje tego typu w kolejnych latach doprowadziły do sformułowania wniosku, że w błonach pobudliwych jony przenikają przez białka błonowe będące kanałami jonowymi. Najbardziej pomocną w tego typu doświadczeniach okazała się opisana w latach siedemdziesiątych technika patch-clamp [2]. Polega ona na rejestracji prądów elektrycznych przez określoną powierzchnię błony przy ustalonej wartości napięcia. Metoda ta pozwoliła w przeciągu czterdziestu lat na opisanie profilu elektrofizjologicznego całego szeregu kanałów jonowych. Spośród nich najliczniejszą oraz najlepiej poznaną grupą są kanały potasowe. Jak dotąd zidentyfikowano ponad 70 genów kodujących kanały potasowe. Kanały potasowe są bardzo zróżnicowane zarówno strukturalnie jak i czynnościowo. Wszystkie kanały potasowe ze względu na budowę tj. ilość domen transbłonowych oraz pętli P tworzących por kanału, zostały podzielone na trzy podrodziny (Ryc. 1). Kanały bramkowane napięciem/zależne od jonów wapniowych (Kv, ang. voltage-gated potassium channels; ang. BK Ca, SK Ca, IK Ca, calcium- -regulated potassium channels), posiadające jedną pętlę P (ang. channel pore) i sześć do siedmiu domen transbłonowych, dokomórkowe kanały prostownicze (Kir, ang. inwardly rectifier potassium channels) posiadające jedną pętlę P i dwie domeny transbłonowe oraz kanały dwuporowe, kanały przeciekowe (K 2P, ang. two pore domain potassium channels) posiadające dwie pętle P i cztery domeny transbłonowe. Z uwagi na problemy natury metodologicznej wiedza o wewnątrzkomórkowych kanałach jonowych nie jest tak duża jak o kanałach z błony plazmatycznej. Najlepiej scharakteryzowanymi wewnątrzkomórkowymi kanałami jonowymi jest poryna mitochondrialna (VDAC, ang. voltage-dependent anion channel) oraz kanały wapniowe siateczki endoplazmatycznej. Jeśli chodzi o mitochondria to zarówno w wewnętrznej jak i zewnętrznej błonie mitochondriów, zarejestrowano aktywności kanałowe o różnej selektywności. Najliczniejszą grupę kanałów błony wewnętrznej mitochondriów stanowią, jak w przypadku błony plazmatycznej kanały potasowe. Obecnie w wewnętrznej błonie mitochondrialnej zidentyfikowano pięć różnych kanałów potasowych: kanał regulowany przez ATP (mitok ATP, ang. ATP-regulated potassium channel) [3], kanał o dużym przewodnictwie regulowany jonami wapniowymi (mitobk Ca, ang. large-conductance calcium-regulated) [4], kanał o średnim przewodnictwie regulowany jonami wapniowymi (mitoik Ca, ang. intermediate conductance calcium-regulated) [5], kanał zależny od napięcia (mitokv1.3, ang. voltage-dependent) [6,7] oraz kanał mitotask-3 (ang. TWIK-related acid sensitive potassium channels) [8]. (Ryc. 2). Kanał mitok ATP po raz pierwszy został ziden- Anna Kajma * Pracownia Wewnątrzkomórkowych Kanałów Jonowych, Zakład Biochemii, Instytut Biologii Doświadczalnej im. Marcelego Nenckiego PAN, Warszawa * Pracownia Wewnątrzkomórkowych Kanałów Jonowych, Zakład Biochemii, Instytut Biologii Doświadczalnej im. Marcelego Nenckiego PAN, ul. Pasteura 3, Warszawa; a.kajma@nencki.gov.pl Artykuł otrzymano 22 lutego 2012 r. Artykuł zaakceptowano 15 kwietnia 2012 r. Słowa kluczowe: kanały potasowe, kwasy tłuszczowe, mitochondria, patch-clamp Wykaz skrótów: 5-HD kwas 5-hydroksydekanowy; AA kwas arachidonowy; BK ca kanał potasowy o dużym przewodnictwie regulowany jonami wapniowymi; BLM czarne błony lipidowe; BSA albumina surowicy bydlęcej; CMC krytyczne stężenie micelizacji; COX cyklooksygenaza; DHA kwas dokozaheksaenowy; EET kwas epoksyeikozatrienowy; EPA kwas eikozapentaenowy; ETYA kwas eikozatetraynowy; heag1 kanał potasowy bramkowany napięciem (ether-a-go-go); HETE kwas hydroksyeikozatetraenowy; HPETE kwas hydroperoksyeikozatetraenowy; IK ca kanał potasowy o średnim przewodnictwie regulowany jonami wapniowymi; K 2P kanał potasowy dwuporowy; KA kwas kaprylowy; K ATP kanał potasowy regulowany ATP; KD dieta ketonowa; Kir kanał potasowy prostowniczy; Kv kanał potasowy bramkowany napięciem; LA kwas linolowy; LNA kwas linolenowy; LOX lipoksygenaza; MA kwas mirystynowy; MCAO zamknięcie środkowej aorty mózgowej (model niedokrwienia mózgu); NDGA kwas nordwuhydrogwajaretowy; NMDA receptor N-metylo-D-asparaginowy; OA kwas oleinowy; PA kwas palmitynowy; PIP 2 4,5-difosforan fosfatydyloinozytolu; PLA 2 fosfolipaza A 2 ; PUFA wielonienasycone kwasy tłuszczowe; ROMK kanał potasowy zewnętrznej części rdzenia nerki; SA kwas stearynowy; SK ca kanał potasowy o małym przewodnictwie regulowany jonami wapniowymi; TASK kanał potasowy wrażliwy na niskie ph; TRAAK kanał potasowy regulowany przez kwas arachidonowy; TREK kanał potasowy spokrewniony z kanałem TWIK; TRESK kanał potasowy spokrewniony z kanałem TWIK występujący w rdzeniu przedłużonym; VDAC poryna mitochondrialna Podziękowania: Przygotowanie artykułu zostało dofinansowane ze środków budżetowych na naukę (projekt badawczy DEC-2011/01/N/ NZ1/04311). Serdeczne podziękowania dla Pana Profesora Adama Szewczyka za cenne uwagi i wskazówki podczas opracowywania tekstu. Postępy Biochemii 58 (2)

2 Rycina 1. Kanały potasowe błony plazmatycznej: kanały bramkowane napięciem/zależne od jonów wapniowych (K v, ang. voltage-gated potassium channels; BK Ca, large-concuctance calcium-regulated potassium channels), posiadające jedną pętlę P i sześć domen transbłonowych, dokomórkowe kanały prostownicze (Kir, ang. inwardly rectifier potassium channels) posiadające jedną pętlę P i dwie domeny transbłonowe oraz kanały dwuporowe, przeciekowe (K 2P, ang. two pore domain potassium channels) posiadające dwie pętle P i cztery domeny transbłonowe. tyfikowany w roku 1991 w mitochondriach izolowanych z wątroby szczura. Kanał mitobk ca osiem lat później w mitochondriach izolowanych z linii komórkowej ludzkiego glejaka. Fizjologiczna rola mitochondrialnych kanałów potasowych pozostaje nie do końca poznana. Badania ostatnich lat wskazują, że kanały te odgrywają rolę w zjawisku cytoprotekcji. Już sześć lat po okryciu kanału mitok ATP Garlid i wsp. zaobserwowali, że podanie diazoksydu, aktywatora kanału chroniło serce szczura przed uszkodzeniami w wyniku niedokrwienia, a efekt ten był odwracany przez blokery kanału glibenklamid i kwas 5-hydroksydekanowy (5-HD, ang. 5-hydroxydecanoic acid). Efekt ten był widoczny również po zastosowaniu HMR1883, substancji selektywnie blokującej kanał K ATP z siateczki sarkoplazmatycznej [9]. Pierwsze dane dotyczące neuroprotekcyjnego działania aktywatorów kanału mitok ATP pochodzą z doświadczeń przeprowadzanych in vivo na noworodkach świń podawanych globalnemu niedotlenieniu. Domoki i wsp. w 1999 roku wykazali, że zastosowanie diazoksydu hamowało uszkodzenia neuronów, a efekt był odwracalny przez 5-HD [10]. W przypadku kanału mitobk Ca trzy lata po jego odkryciu inny zespół badawczy zasugerował udział tego kanału w zjawisku kardioprotekcji. Podanie aktywatora kanału NS1619, chroniło komórki serca świnki morskiej przed uszkodzeniem wywołanym niedotlenieniem z następczą reperfuzją [11]. Sześć lat później grupa Gaspara i wsp. wskazała również na udział kanału mitobk Ca w neuroprotekcji. Doświadczenia z użyciem hodowli pierwotnej neuronów kory mózgu pokazały ochronny efekt działania NS1619 w warunkach pozbawienia komórek tlenu i glukozy oraz uszkodzenia glutaminianem [12]. Poza dokładnie badanymi substancjami farmakologicznymi zmieniającymi aktywność kanałów potasowych, syntetycznymi bądź naturalnymi, zaczęto poszukiwać endogennych regulatorów kanałów potasowych, ze szczególnym naciskiem na kwasy tłuszczowe. Dlaczego zainteresowano się kwasami tłuszczowymi? Kwasy tłuszczowe są głównym składnikiem fosfolipidów błon komórek. W stanach patologicznych takich jak niedotlenienie, epilepsja, zapalenie, są one uwalniane z błon komórkowych. Po uwolnieniu oddziałują z wieloma białkami cytoplazmatycznymi i błonowymi. Część z kwasów wykazuje właściwości protekcyjne, część zaś przeciwnie np. proapoptotyczne. Ponieważ wiele prac wskazuje na udział kanałów potasowych w zjawiskach protekcji, słusznym wydało się więc sprawdzenie ich wzajemnego wpływu na siebie. Okazuje się ze kwasy tłuszczowe regulują aktywność kanałów potasowych że wszystkich trzech podrodzin. Sposoby badania wpływu kwasów tłuszczowych na kanały potasowe Rycina 2. Mitochondrialne kanały potasowe: mitobk Ca, mitok ATP, mitoik Ca, mitokv, TASK-3. Inne wyjaśnienia w tekście pracy. Uważa się, że kwasy tłuszczowe mogą wpływać na aktywność kanałów potasowych w sposób bezpośredni i pośredni (Ryc. 3). Sposób bezpośredni polega na specyficznym wiązaniu się danego kwasu z białkiem kanałowym lub białkiem regulatorowym związanym z białkiem kanałowym. Sposób pośredni, polega na zmianach właściwości fizyko-chemicznych błony pod wpływem deponowanych kwasów, co w konsekwencji prowadzi do zmiany aktywności kanału. Dodatkowo, do mechanizmów pośrednich zalicza się regulację poprzez produkty reakcji enzymatycznych lub nie enzymatycznych danych kwasów, jak również, reaktywne formy tlenu powstające podczas oksydacji kwasów. Spośród badanych kwasów tłuszczowych do badań elektrofizjologicznych najczęściej stosuje się kwasy: dokozaheksaenowy (DHA, 22:6), arachidonowy (AA, 20:4), eikozatetraynowy (ETYA, 20:4), eikozapentaenowy (EPA, 20:5), α-linolenowy (LNA, 18:3), linolowy (LA, 156

3 Rycina 3. Sposoby regulacji kanałów potasowych przez kwasy tłuszczowe. Inne wyjaśnienia w tekście pracy. 18:2), oleinowy (OA, 18:1), stearynowy (SA, 18:0), mirystynowy (MA, 14:0), palmitynowy (PA, 16:0), kaprylowy (KA, 8:0). Badanie wpływu kwasów tłuszczowych na aktywność kanałów jonowych jak dotąd możliwa jest z użyciem dwóch technik elektrofizjologicznych, techniki czarnych błon lipidowych (BLM, ang. black lipid membrane), oraz techniki patch-clamp. Pierwsza z nich pozwala na zbadanie aktywności białka kanałowego wbudowanego w sztuczną błonę lipidową, druga na pomiarach prądów jonowych w warunkach zbliżonych do fizjologicznych, w systemie whole-cell (pomiary przez cała powierzchnię błony komórki) oraz cell-attached (pomiary przez fragment błony komórkowej przyssanej do pipety pomiarowej). Dodatkowo z wykorzystaniem tej techniki możliwe są pomiary prądów jonowych przez pojedyncze białka kanałowe w strukturach wewnątrzkomórkowych, na przykład mitochondriach. Problem z badaniem kwasów tłuszczowych w systemach elektrofizjologicznych pojawia się już na samym początku, ze względu na zmiany stabilności błony podczas pomiaru, pod wpływem podawanych z zewnątrz i wbudowywanych w strukturę błony, kwasów tłuszczowych. Istotnym jest w tym przypadku podawanie ich w takich stężeniach by nie tworzyły struktur micelarnych i nie uszkadzały błony wykorzystywanej w pomiarach. Progowym stężeniem dla najczęściej stosowanych kwasów, przy którym nie tworzą się micele (CMC, ang. critical micelle concentration) jest stężenie około ~20 μm [13]. Nie zawsze jednak stosowane są stężenia mikromolowe. W niektórych doświadczeniach już pikomolowe stężenia kwasu AA, podawane od strony cytoplazmy powodują hamowanie prądów potasowych, w stosunku do mikromolowych stężeń podawanych od strony zewnątrzkomórkowej [14]. Problem doboru odpowiedniego stężenia do doświadczeń związany jest również z brakiem danych na temat lokalnych stężeń kwasów tłuszczowych w miejscach błony, w której występuje dany kanał. W przypadku kwasów wielonienasyconych (PUFA, ang. polyunsaturated fatty acids), ich zdolność do spontanicznego utleniania oraz udokumentowany wpływ produktów oksydacji kwasów tłuszczowych na kanały jonowe, sprawia, że często przeprowadza się równolegle doświadczenia z antyoksydantami. Należy również mieć na uwadze fakt, że kwasy tłuszczowe podlegają reakcjom enzymatycznym, a powstające produkty pośrednie mogą oddziaływać z białkami kanałowymi. W tym celu w doświadczeniach stosuje się między innymi inhibitory cykloksygenaz (indometacin), lipooksygenaz (NDGA, kwas nordwuhydrogwajaretowy), cytochromu P450 (clotrimazol) oraz wszystkich trzech wymienionych enzymów (ETYA, kwas eikozatetraynowy). Ponieważ wielonienasycone kwasy tłuszczowe ulegają utlenianiu i wielu innym przemianom, badania przeprowadza się z nie metabolizowanymi analogami. Takie doświadczenia mają na celu sprawdzenie czy obserwowane efekty podawanych kwasów są związane z samym kwasem, czy też produktem metabolizmu kwasów. Często stosowanym analogiem kwasu arachidonowego, jest kwas eikozatetraynowy. Kwas ETYA, podobnie jak kwas AA to związek dwudziesto węglowy, jednak zamiast czterech wiązań nienasyconych (podwójnych), posiada cztery wiązania potrójne. Związek ten jest inhibitorem lipoksygenazy, cyklooksygenazy i epoksygenazy. Ze względu na fakt, że kwasy tłuszczowe mogą swobodnie przechodzić przez błonę komórkową, podanie ich w konfiguracji inside-out czy outside-out nie odpowiada jednoznacznie na pytanie, od której strony błony komórkowej dany kwas tłuszczowy działa na kanał. W tym celu stosuje się sprzężone analogi kwasów, na przykład z koenzymem. Związki takie nie przechodzą przez błonę plazmatyczną, a ich podanie w układzie inside-out lub outside-out pozwala na określenie strony od której kwas działa na kanał. Należy jednak brać pod uwagę, że takie analogi ze względu na większy rozmiar dołączonej dodatkowej grupy, mogą nie efektywnie wiązać się z miejscami docelowymi w białku kanałowym. Inną stosowaną metodą jest więc podanie albuminy surowicy bydlęcej (BSA, ang. bovine serum albumin) w układach inside-out i outside-out oraz whole-cell od strony pipety pomiarowej, bądź z zewnątrz. Albuminy uczestniczą w wiązaniu i transporcie kwasów tłuszczowych i barwników żółciowych. Podawane w doświadczeniach elektrofizjologicznych związują kwasy tłuszczowe z wybranej strony błony, przez którą dokonuje się pomiaru. Cechy kwasów tłuszczowych pozwalające na oddziaływania z kanałami potasowymi Nie wszystkie kwasy tłuszczowe wpływają na aktywność kanałów potasowych. Okazało się, że istnieje wiele cech wspólnych pomiędzy kwasami tłuszczowymi należącymi do listy tych, które regulują aktywność kanałów potasowych. Doświadczenia przeprowadzone przez Clarke a i wsp. wskazały, że im dłuższy łańcuch węglowy tym efekt działania jest silniejszy (powyżej ośmiu atomów węgla). Kwasy tłuszczowe o długich łańcuchach węglowych łatwiej się wbudowują w błonę komórkową. Spośród trzech badanych kwasów, najsilniejszy efekt na kanał BK Ca naczyń płucnych królika, miał kwas arachidonowy (kwas 20-węglowy) następnie mirystynowy (kwas 14-węglowy) i kaprylowy Postępy Biochemii 58 (2)

4 (kwas 8-węglowy) [15]. Do takich samych wniosków doprowadziły doświadczenia przy użyciu analogów kwasów z grupą sulfonową. Im dłuższy łańcuch węglowy tym silniejszy efekt aktywacji kanału [15]. Odwrotnie w przypadku analogów z grupą aminową, tu związek z najdłuższym łańcuchem węglowym najsilniej hamował aktywność kanału BK Ca [15]. Co ciekawe, podobny efekt zaobserwowano w przypadku estrowych pochodnych kwasów. Eksprymowane w oocytach Xenopus leavis kanały BK Ca, były hamowane tym silniej im dłuższy był łańcuch węglowy użytego w doświadczeniu estru [16]. Nie tylko długość łańcucha węglowego, ale również to czy dany kwas jest nasycony bądź nienasycony, determinuje jego zdolność do oddziaływania z kanałami potasowymi. Kanał dwuporowy TRESK (ang. TWIK-related spinal cord potassium channel) eksprymowany w rdzeniu przedłużonym, hamowany był przez nienasycone kwasy tłuszczowe tj. AA, DHA OA. Nie działały na niego natomiast kwasy nasycone tj. PA i SA [17]. Odwrotnie, nienasycone kwasy tłuszczowe AA, DHA, OA zwiększały aktywność kanału BK Ca eksprymowanego w oocytach Xenopus leavis, a kwasy nasycone SA, PA nie wpływały na aktywność kanału [16]. Okazało się, że to w jaki silnym stopniu kanał jest hamowany, zależne jest od ilości wiązań nienasyconych podawanego kwasu. W przypadku kanału TRESK najsilniejszy efekt przypisano kwasowi DHA następnie LA i OA [17]. Wyniki doświadczeń przeprowadzonych na kanałach BK Ca z linii komórkowej guza laktosamatotropowego GH 3, z użyciem kwasów tłuszczowych o różnej liczbie wiązań podwójnych przedstawiono w postaci szeregu tj. EPA>AA>E- TYA>LNA>LA. Najsilniejszy efekt posiadał kwas o pięciu wiązaniach nienasyconych, najsłabszy natomiast o dwóch [18]. Doświadczenia tego typu przeprowadzono również na kanałach BK Ca eksprymowanych w miocytach żołądka świnki morskiej. Tu również potwierdziła się obserwacja, najsilniejszy efekt zaobserwowano po podaniu kwasu AA, następnie LA i OA [19]. Odwrotną zależność zaobserwowano w przypadku kanałów typu Kv4.2. Zdolność do hamowania aktywności kanału przez kwasy tłuszczowe wzrastała wraz z ilością wiązań podwójnych (AA>LNA>LA>OA), najsilniejszy efekt hamujący zaobserwowano dla kwasu ETYA z czterema potrójnymi wiązaniami [20]. Jeśli chodzi o kanały heag1 (ang. human ether à go-go) szereg ten przedstawiał się w postaci EPA>AA>LNA>OA, przy czym najsilniejszym nie był efekt kwasu ETYA [21]. Sugeruje się, że im dłuższy łańcuch węglowy tym łatwiej kwas wbudowuje się w błonę komórkową i tym łatwiejszy ma dostęp i możliwość wiązania się z białkiem kanałowym. Dodatkowo, zaobserwowano różnice w odpowiedziach kanału BK Ca, w zależności od orientacji przestrzennej wiązań nienasyconych kwasów tłuszczowych. W komórkach linii GH 3 najsilniejsze efekty aktywujące na kanał BK Ca wykazywały kwasy posiadające wiązania w orientacji cis. Kwasy z wiązaniami nienasyconymi w orientacji trans nie wpływały w sposób istotny statystycznie na aktywność tego kanału [18]. W przypadku kanału z mięśni gładkich naczyń płuc, Rycina 4. Mechanizmy regulacji kanałów potasowych przez kwasy tłuszczowe. (A) Panel lewy: strona, od której działają kwasy tłuszczowe na kanał potasowy o dużym przewodnictwie regulowany jonami wapniowymi. Panel prawy: wpływ kwasu arachidonowego na prawdopodobieństwo otwarć mitochondrialnego kanału o dużym przewodnictwie regulowanego jonami wapniowymi w symetrycznym układzie stężeń 150/150 mm KCl, przy potencjale 40 mv. (B) Wpływ kwasów tłuszczowych na czujnik napięcia kanałów potasowych bramkowanych napięciem. Model działania proponowany przez Börjessona i wsp. zakłada, że grupa karboksylowa długołańcuchowych kwasów tłuszczowych po wbudowaniu w błonę komórkową, oddziałuje z czujnikiem napięcia kanału, co w konsekwencji prowadzi do otwarcia kanału [34]

5 orientacja przestrzenna wiązań nienasyconych kwasów nie była istotna [22]. Kolejna niezbędna cecha to obecność ujemnie naładowanej reszty hydrofilowej. Kwasy tłuszczowe z ładunkiem dodatnim hamowały aktywność kanału BK Ca, z mięśni gładkich tętnicy płucnej, z ładunkiem ujemnym aktywowały. Nie posiadające ładunku, nie wpływały na aktywność kanału. Grupa karboksylowa nie była konieczna do działania kwasów tłuszczowych na kanał BK ca a jedynie ładunek ujemny. Sulfonian tetradekanu, palmitynian kwasu lizofosfatydowego oraz kwas oktanosulfonowy, wszystkie z ujemną grupą sulfonową zwiększały prawdopodobieństwo otwarć kanału zarówno podawane w konfiguracji inside out, outside-out patch-clamp [15]. Strona, od której działają kwasy tłuszczowe na kanały potasowe nie jest jednoznacznie określona. Rozbieżne wyniki, tj. czy działają one od strony cytoplazmy, czy od strony zewnątrzkomórkowej, uzyskiwano w zależności od rodzaju badanego kanału. Na kanały typu TRESK z rdzenia przedłużonego, BK Ca z naczyń płucnych, kwasy tłuszczowe działają zarówno od jednej, jak i drugiej strony błony. Od strony zewnątrzkomórkowej działają np. na kanały K ATP z tętnicy krezkowej [23]. Od strony cytoplazmy na kanały: K ATP z miocytów serca, SK Ca z miocytów żołądka [24], BK Ca z linii GH 3 [18], BK Ca z mięśni gładkich naczyń krwionośnych [15] (Ryc. 4A). Interesującym wydaje się również fakt, że kwasy wykazują przeciwstawne efekty w zależności od tego na jaki wariant obróbki potranslacyjnej kanałów działają [25]. W błonie plazmatycznej komórek linii GH 3 występuje wariant kanału BK Ca, który na C-końcu białka posiada wstawkę z 27 reszt aminokwasowych (wariant rslo(27)) i jest aktywowany przez 1 μm kwas AA. Subklon linii GH 3, linia GH 4 posiada taki kanał bez wstawki i jest on hamowany przez 1 μm kwas AA. Zaobserwowano, że różnica w odpowiedzi kanałów na AA zależna jest od zdolności tego kanału do wiązania się z fosfolipazą A 2 (PLA 2, ang. phospholipase A2). Badania metodą wyodrębnienia konkretnego białka z mieszaniny białek przy pomocy specyficznych dla niego przeciwciał oraz badania z użyciem drożdżowego systemu dwuhybrydowego wskazały, że pomimo obecności w obu liniach komórkowych PLA 2 w tym samym stężeniu oraz na tym samym poziomie aktywności, wariant rslo(27) wiąże się z PLA 2 12-razy silniej niż wariant rslo(0) [26] Wcześniejsze badania immunofluorescencyjne i immunohistochemiczne potwierdziły, że podjednostka α kanału BK Ca i PLA 2 podlegają kolokalizacji [18], niezależnie od aktywności enzymatycznej fosfolipazy. Pierwsze prace wskazujące na fizyczny kontakt pomiędzy dwoma białkami ukazały się już w latach 90-tych. Pomiary przeprowadzone na komórkach linii GH 3 z wykorzystaniem sirna oraz kwasu arystolochowego (inhibitora PLA 2 ) wskazały że enzym ten jest niezbędny do prawidłowej odpowiedzi kanału na jony wapniowe. Wyciszenie genu dla PLA 2 lub podanie inhibitora PLA 2, wpływało na obniżenie prawdopodobieństwa otwarć kanału BK Ca przy takich samych potencjałach oraz przy takim samym stężeniu jonów wapniowych, w stosunku do kontroli. Tysiąckrotny wzrost stężenia jonów wapniowych nie wpływał w sposób znaczący na prawdopodobieństwo otwarć kanału w warunkach nieaktywnej PLA 2. W tych samych warunkach podanie egzogennego kwasu AA powodowało wzrost aktywności kanału. Autorzy na tej podstawie zaproponowali model, według którego kanał BK Ca, aktywowany jest przez kwas AA, podawany z zewnątrz bądź uwalniany pod wpływem fosfolipazy [25]. Wpływ kwasów tłuszczowych na podjednostki tworzące por kanałów potasowych Nieznane jest dokładnie miejsce wiązania kwasów tłuszczowych w strukturze kanałów potasowych. Sugeruje się, że kwasy tłuszczowe mogą działać bezpośrednio na białko kanałowe, deponując się w błonie i wpływając na czujnik napięcia kanału, bądź inne białko związane z białkiem kanałowym na przykład PLA 2. W zależności od rodzaju kanału potasowego zidentyfikowano kilka różnych miejsc wiązania kwasu AA. Dla kanałów typu IK1 [27] i Kir3.X [28] miejscem wiązania okazał się por kanału. Dla kanału TREK (ang. TWIK-related potassium channels) domena C-końcowa białka kanałowego [29,30], a dla kanału typu ROMK-1 (ang. renal outer medulla K-channel) domena N-końcowa [31]. Na podstawie doświadczeń przeprowadzonych z chimerami kanału TREK posiadającymi cytoplazmatyczny C-koniec białka z kanałów typu TASK wykazano, że rejonem odpowiedzialnym za wrażliwość kanału na 10 µm i 20 µm AA jest sekwencja złożona z 30 reszt aminokwasowych tuż przy 4 domenie transbłonowej. Ostatnia reszta glutaminy w sekwencji (KKTKEE) wchodzącej w skład tego fragmentu, działa jak czujnik protonów [32]. Analogiczne doświadczenia przeprowadzono z chimerą kanału TRAAK (ang. TWIK- -related arachidonic acid stimulated potassium channel) posiadającą tą samą sekwencję na C-końcu (C-koniec kanału TASK). W tym przypadku okazało się, że pomimo podobieństw pomiędzy kanałami TREK i TRAAK ich miejsca wiązania kwasu arachidonowego są różne. Jak dotąd nie znaleziono miejsca wiązania kwasów w sekwencji kanału TRAAK. W przypadku kanałów o średnim przewodnictwie regulowanych jonami wapniowymi (IK1), miejscami odpowiedzialnymi za wrażliwość kanału na 3 µm kwas AA (hamowanie aktywności kanału) są domeny transbłonowe S5, S6 wraz z pętlą P. Mutanty kanału IK1, T250S i V275A znosiły efekt hamujący AA, co wskazywało by na rolę reszt aminokwasów treoniny i waliny w wiązaniu kwasu AA [27]. Ponieważ kwasy tłuszczowe działają na wiele kanałów potasowych o znacznie różniącej się pomiędzy sobą strukturze, jedna z hipotez nazwana w literaturze anglojęzycznej lipoelectric mechanizm zakłada, że bardziej prawdopodobnym mechanizmem działania kwasów nie jest specyficzne ich wiązanie z daną sekwencją aminokwasową białka kanałowego, a oddziaływania elektrostatyczne [33]. Lipofilowe łańcuchy acylowe kwasów tłuszczowych lokują się w błonie komórkowej, a ujemnie naładowane grupy karboksylowe wpływają na przesuniecie się czujnika napięcia kanału, co w konsekwencji pozwala na otwarcie poru kanału (Ryc. 4B). Tego typu hipoteza odnosi się jedynie do kanałów zależnych od potencjału błonowego i posiadających w swojej strukturze czujnika napięcia. Do- Postępy Biochemii 58 (2)

6 świadczenia potwierdzające tę hipotezę przeprowadzono z użyciem estrowych pochodnych kwasów tłuszczowych. Takie pochodne nie posiadają ładunku ujemnego oraz nie przechodzą swobodnie przez błonę komórkową. Börjesson i wsp. wykazali, że kanały bramkowane napięciem są aktywowane jedynie przez kwasy tłuszczowe, posiadające minimum dwa nienasycone wiązania w konfiguracji cis, a efekt ten zależny jest od ph. Najsilniejszy efekt działania kwasu DHA zaobserwowano przy ph 9. W takim ph krzywa zależności przewodnictwa kanału od przykładanych potencjałów, przesunięta była w stronę potencjałów hiperpolaryzujących. Natężenie mierzonego prądu w stosunku do kontroli wzrosło dwudziestokrotnie, a efekt ten nie był obserwowany przy ph 6,5. Na tej podstawie zaproponowano model, według którego kanał występuje w czterech stanach. Stan pierwszy to stan zamknięty kanału. Stan drugi, pod wpływem wyższego ph zmienia się konformacja białka kanałowego i może on przyłączać kwasy tłuszczowe w formie zdysocjowanej lub niezdysocjowanej. W stanie trzecim, kanał związany jest z uprotonowanymi, niezdysocjowanymi kwasami tłuszczowymi. Ostatni ze stanów, czwarty, to stan otwarty kanału i związany z formą zdysocjowaną kwasu [34]. Zamiana pierwszej reszty argininy w sekwencji czujnika napięcia na resztę cysteinową (R362C) oraz jej modyfikacja, z wykorzystaniem MTSES - (ang. sodium (2-sulfonatoethyl) methanethiosulfonate), znosiły efekt działania DHA. Proces ten był odwracalny w przypadku zastąpienia tej samej reszty aminokwasowej resztą cysteinową z ładunkiem dodatnim MTSET + (ang. 2-(trimethylammonium)ethyl methanethiosulfonate bromie). Autorzy sugerują, że PUFA oddziałują jedynie z resztami aminokwasowymi czujnika napięcia, które eksponowane są od strony zewnątrzkomórkowej, gdy kanał jest w stanie otwartym. Wynik taki może wyjaśniać różnice jakie zaobserwowano do tej pory w efektach PUFA pomiędzy kanałami bramkowanymi napięciem. Kanał typu Kv2.1 posiada dodatkowe reszty argininowe i jest bardziej wrażliwy na PUFA niż kanały Kv4.1, Kv4.2 i Kv11.1, które nie posiadają reszty argininy w pozycji 362. Jak dotąd nie zidentyfikowano miejsca wiązania kwasu tłuszczowego z kanałem BK ca. Wydaje się, że miejscem działania kwasu arachidonowego jest pętla P [35]. Wyniki doświadczeń wskazały, że w kanałach typu Kv1.1 miejscem wiązania wielonienasyconych kwasów tłuszczowych AA, ETYA i DHA jest domena S6 tworząca por kanału, a szczególnie istotna jest w tym przypadku reszta izoleucyny w pozycji 400. Podawany w konfiguracji inside-out 2 μm AA inaktywował kanał Kv1.1, a efekt ten nie był widoczny w przypadku mutanta posiadającego w pozycji 400 zamiast reszty izoleucyny, resztę waliny. Spośród kanałów prostowniczych Kir2.0 jedynie kanał Kir2.3 był wrażliwy na kwas AA [36]. Aktywacja kanału przez AA zależna była od oddziaływania tego kanału z fosfatydyloinozytolo-4,5-bis-fosforanem (PIP 2 ). Pierwsze prace wskazujące, że ujemnie naładowane lipidy oddziałują z kanałami Kir ukazały się już w latach Dwie prace w roku 1996, jedna wskazująca, że PIP 2 aktywuje kanały K ATP z komórek mięśnia sercowego [37], druga, wpływ pochodnych acylowych koenzymu A na ten kanał [38]. W roku 1997 Fan i Makielski wykazali wpływ PIP 2 na kanały Kir1.1, Kir2.1, K ATP [39]. Wpływ kwasów tłuszczowych na podjednostki regulatorowe kanałów potasowych Niejasne jest, czy miejscem wiązania kwasów są podjednostki tworzące por kanału, czy też podjednostki regulatorowe. Według Sun i wsp. kwas AA oddziałuje z podjednostką regulatorową β kanału BK Ca. Potwierdziły to doświadczenia przeprowadzone zarówno z podjednostkami α kanału koeksprymowanymi z różnymi podjednostkami regulatorowymi β (β1-4) oraz bez podjednostki. Wykazano, że jedynie w obecności podjednostek β2 i β3 obserwowany był efekt 30 μm kwasu AA. Ponieważ pozbawienie N- -końcowego fragmentu podjednostki β2 z zastosowaniem trypsyny znosiło efekt działania kwasu, zasugerowano, że miejscem wiązania kwasu jest N-końcowy fragment podjednostki β2 [16]. Inne doświadczenia przeprowadzone na estrowej pochodnej kwasu arachidonowego wykazały, że jego efekt widoczny był tylko w przypadku koekspresji kanału BK Ca z podjednostką β2 w układzie inside-out. Podjednostka β2 hamuje aktywność kanału, zgodnie z mechanizmem N-końcowej inaktywacji [16]. Autorzy sugerują, że estrowe pochodne z ładunkiem ujemnym oddziałują na zasadzie elektrostatycznej z aminokwasami o ładunku dodatnim podjednostki β. Wpływ kwasów tłuszczowych na aktywność kanałów potasowych poprzez zmiany właściwości błony komórkowej Szczególnie cennymi w badaniach elektrofizjologicznych kanałów okazały się obserwacje określające sposób w jaki dane kwasy tłuszczowe po wbudowaniu w błonę zmieniają jej właściwości fizyko-chemiczne. Lipidy wbudowując się w strukturę błony mogą działać jak detergenty, zmieniać płynność błony oraz jej organizację przestrzenną. Jedną z metod opisu stanu fizycznego błony jest ocena jej płynności. Najczęściej stosowanymi technikami pomiaru płynności błon są deuterowy magnetyczny rezonans jądrowy oraz pomiary fluorescencyjne przy użyciu sond fluorescencyjnych. Sondy (na przykład difenyloheksatrien) po wbudowaniu się w dwuwarstwę lipidową są wzbudzane światłem spolaryzowanym, a zmiany ich położenia określane są na podstawie pomiarów polaryzacji światła wyemitowanego. Ponieważ zmiany anizotropii błon metodą fluorescencyjną nie są wykrywane przy tak niskich stężeniach kwasów jak stosowane w pomiarach elektrofizjologicznych, do ocen płynności stosuje się stężenia kwasów 25 μm 100 μm. Doświadczenia przeprowadzone przez Densona i wsp. na kanałach BK Ca komórek linii laktosomatotropowej wskazały brak zależności pomiędzy zdolnością kwasów tłuszczowych do zmian płynności błony komórkowej a ich zdolnością do aktywacji kanału BK Ca [18]. Najsilniejszą anizotropię zaobserwowano z użyciem kwasu arachidonowego, następnie linolowego, oleinowego, stearynowego, a najsłabszą w przypadku kwasu ETYA. W przypadku kanałów BK Ca z komórek mięśni gładkich aorty człowieka i królika zaobserwowano odwrotne efekty. Podanie mewinoliny (inhibitora biosyntezy cholesterolu z grupy statyn) wpływało na dwukrotny wzrost płynności 160

7 Rycina 5. Wpływ kwasów tłuszczowych na właściwości błony komórkowej i aktywność kanałów potasowych. Inne wyjaśnienia w tekście pracy. błon komórek i ponad czterokrotny wzrost prawdopodobieństwa otwarć kanału BK Ca. Dwukrotny spadek płynności błony w obecności podwyższonego stężenia cholesterolu w błonie, korelował z dwukrotnym obniżeniem prawdopodobieństwa otwarć kanału BK Ca [40]. W latach 90. po raz pierwszy zaproponowano teorię, według której wbudowywane w błonę komórkową kwasy tłuszczowe wpływają nie tylko na płynność, ale również zmiany kształtu błony, co w konsekwencji prowadzi do zmiany aktywności kanałów (Ryc. 5). Jedną z cech błon biologicznych jest jej asymetria. Spowodowana jest ona różnym składem lipidowym monowarstwy zewnętrznej i wewnętrznej, a co za tym idzie, różnicami w ładunku obu monowarstw. Doświadczenia przeprowadzone w latach 70-tych na błonach erytrocytów człowieka, wykazały, że anionowe związki amfipatyczne wbudowują się w zewnętrzną monowarstwę, a kationowe, w monowarstwę wewnętrzną. Trinitrofenol powodował zmianę kształtu erytrocytów (uwypuklenie błony, ang. convex curvature), a chlorpromazyna odwrotnie (wpuklenie błony, ang. concave curvature) [41]. Ponieważ, kanały dwu-porowe typu TREK i TRAAK są wrażliwe na zmiany mechaniczne błony, ulegają aktywacji w warunkach negatywnego ciśnienia (-60 mmhg), powinny więc otwierać się pod wpływem anionowych związków amfipatycznych, a zamykać pod wpływem kationowych. Zgodnie z tym założeniem, okazało się, że trinitrofenol aktywuje kanały TREK, a chloropromazyna i tetrakaina odwracają ten efekt [42,43]. Interesującym wydaję się również, zaobserwowana po raz pierwszy w roku 2000 przez Martensa i wsp. zależność, że pewne kanały potasowe wykazują specyficzną i nieprzypadkową lokalizację w błonach komórkowych [44]. Kanały typu Kv2.1 występują w tzw. tratwach lipidowych bogatych w cholesterol i sfingolipidy, zaś kanały Kv4.2 poza tymi regionami. Traktowanie błon cyklodekstryną, w celu pozbycia się cholesterolu wpływało na obniżenie aktywności kanału Kv2.1, a efektu tego nie zaobserwowano w przypadku kanałów Kv4.2 [45]. W odróżnieniu od kanałów Kv1.5 [46] kanały Kv2.1 występowały w tratwach pozbawionych białka kaweoliny. Inne z kanałów występujące w tratwach to m.in. kanał Kv1.3 w błonach komórek Jurkat [47], BK Ca w nerkach [48] i komórkach gliomy [49], Kir3.1 w mózgu i komórkach CHO [50]. Kolejnym z czynników wpływających na aktywność kanałów, a związanych bezpośrednio z kwasami tłuszczowymi jest ich kształt przestrzenny. Lipidy, w zależności od objętości (zajmowanego pola powierzchni) części hydrofilowej oraz długości łańcuchów kwasów tłuszczowych, mogą przyjmować różne struktury przestrzenne (stożka, odwróconego stożka, cylindr). Lizofosfolipidy, o kształcie odwróconego stożka, po wbudowaniu w strukturę błony zmieniają jej krzywiznę. Lizofosfolipidy aktywowały kanały dwu-porowe TREK i TRAAK, a efekt zależny był od długości łańcuchów acylowych (powyżej 10 atomów węgla) oraz wielkości hydrofilowej głowy [43]. Nie zależał natomiast od liczby wiązań nienasyconych w łańcuchach acylowych i obecności ładunku na reszcie hydrofilowej. Zaobserwowano, że kanał TREK-1 był aktywowany przez lizofosfatydylocholinę jedynie w systemie pomiarowym whole-cell, co wskazuje na konieczność występowania całej, nieuszkodzonej błony w odpowiedzi kanału na podany związek (odpowiedź kanału widoczna była jedynie przy podaniu związku od strony zewnątrzkomórkowej). Odwrotną odpowiedź zaobserwowano w przypadku kwasu arachidonowego. Kwas AA o kształcie przestrzennym stożka, aktywował kanał TREK-1 nie tylko w systemie whole-cell, ale również inside-out i outside-out. Autorzy zasugerowali, że działanie lizofosfatydylocholiny nie jest bezpośrednie, jak w przypadku kwasu AA i wymaga dodatkowych czynników cytosolowych [43]. Wpływ metabolitów kwasów tłuszczowych na aktywność kanałów potasowych Inną z form regulacji pośredniej kanałów jonowych poprzez kwasy tłuszczowe jest regulacja za pośrednictwem metabolitów kwasów. Wolny kwas arachidonowy i niektóre dwudziesto węglowe kwasy nienasycone mogą być metabolizowane na drodze trzech różnych przemian, za pośrednictwem cyklooksygenazy, lipooksygenazy lub epoksygenazy. Szlak cyklooksygenazy (COX) jest odpowiedzialny za biosyntezę prostanoidów, prostaglandyn, prostacyklin i tromboksanów. Na szlaku lipoksygenazy (LOX) wytwarzane są leukotrieny i lipoksyny. Lipooxygenaza katalizuje syntezę kwasu hydroksyeikozanotetraenowego (HETE), poprzez produkt pośredni, kwas hydroksyperoksyeikozanotetraenowy (HPETE). Istnieją trzy formy enzymu LOX. Różnica w ich działaniu dotyczy miejsca włączania cząsteczki tlenu do kwasu. Zostały one oznaczone odpowiednio, 5-LOX, 12-LOX i 15-LOX. W ostatnim ze szlaków, pod wpływem epoksygenaz powstają kwasy epoksyeikozatrienowe takie jak 5,6-EETs, 8,9-EETs, 11,12-EETs i 14,15-EETs. Poziom produktów przemiany kwasów tłuszczowych zmienia się w komórce w stanach patologicznych, na Postępy Biochemii 58 (2)

8 przykład podczas niedotlenienia mózgu. Doświadczenia przeprowadzone na komórkach nabłonka i mięśni gładkich tętnicy szyjnej szczura wykazały, że synteza kanałów potasowych Kv2.1, Kv1.5 jest obniżona w warunkach podwyższonego stężenia 15-HETE. Dodatkowo pomiary prądów jonowych mięśni gładkich tętnicy szyjnej w konfiguracji whole-cell wskazały, że po podaniu 1 μm 15-HETE kanały bramkowane napięciem były całkowicie zablokowane [51]. W warunkach hipoksji poziom enzymu 15-LOX wzrasta, a nadprodukowany 15-HETE blokuje kanały Kv. W wyniku zablokowania kanałów dochodzi do depolaryzacji błony komórkowej, otwarcia bramkowanym napięciem kanałów wapniowych, wzrostu wewnątrzkomórkowego stężenia jonów wapniowych i tym samym skurczu naczynia [52]. Podobne doświadczenia przeprowadzono na komórkach mięśni gładkich tętnic płucnych hodowanych in vitro i poddawanych hipoksji. Zablokowanie produkcji 15-HETE przez NDGA, skutkowało we wzroście syntezy kanałów Kv1.5, Kv2.1 [53]. Spośród trzech badanych lizoform HETE (5-HETE, 12-HETE, 15-HETE) najsilniejsze efekty obserwowano w przypadku 15-HETE. Pomiary w konfiguracji inside-out komórek tętnic wieńcowych świni, wskazały, że miejscem działania produktu lipoksygenazy 12-HETE są również kanały BK Ca. Po podaniu 3 nm 12-HETE obserwowano dwukrotny wzrost prawdopodobieństwa otwarć kanału, a efekt ten był odwracalny i blokowany przez iberiotoksynę (specyficzny bloker kanałów BK Ca ) [54]. Inny z produktów lipoksygenazy 5-LOX eikozanoid 5-oxo-ETE aktywuje kanały BK Ca z mięśni gładkich dróg oddechowych [55]. 5-oxo-ETE uczestniczy w regulacji migracji neutrofili, stymuluje infiltrację eozynofili oraz napięcie mięśniowe miocytów dróg oddechowych. Doświadczenia z zastosowaniem czarnych błon lipidowych wykazały, że miejscem działania 5-oxo-ETE na białko kanałowe jest strona zewnątrzkomórkowa kanału. 5-oxo- -ETE depolaryzuje komórki mięśniowe za pośrednictwem kanałów BK Ca. Pomiary napięcia mięśniowego dróg oddechowych osób chorych na nowotwór płuc wykazały ze podanie 5-oxo-ETE wpływa na relaksację mięśni, a efekt jest odwracalny przez iberiotoksynę [55]. Kolejny z przykładów wskazujący na ścisły związek pomiędzy kwasami tłuszczowymi a kanałami potasowymi to wpływ produktów epoksygenazy na wydzielanie potasu przez komórki kory kanalików zbiorczych nerek. Nerki utrzymują jony potasu w organizmie na wyrównanym poziomie i w zależności od wysokiej lub niskiej podaży, usuwają je lub pobierają. Od strony apikalnej komórek kanalików kory nerek występują kanały potasowe ROMK i BK Ca odpowiadające za ten proces. W warunkach wysokiej podaży potasu dochodziło do podwyższonej syntezy epoksygenazy oraz wzrostu poziomu 11,12-EET w komórkach kanalików kory. Co ciekawe, 10 µm AA aktywował kanały BK Ca tylko w przypadku szczurów poddawanych diecie wysoko-potasowej. Dodatkowo efekt 10 µm AA był odwracany przez inhibitor epoksygenazy. Wszystkie te obserwacje potwierdziły, że związkiem działającym na kanały BK Ca był w rzeczywistości 11,12- EET [56]. Kwasy epoksyeikozatrienowe powstają w wyniku przemiany kwasu arachidonowego pod wpływem epoksygenaz cytochromu P-450 stymulowanych wzrostem stężenia wewnątrzkomórkowego jonów wapniowych. Kwasy epoksyeikozatrienowe, zarówno endo-, jak i egzogenne rozkurczały mięśnie gładkie naczyń poprzez wpływ na śródbłonkowe kanały potasowe IK Ca i SK Ca oraz mięśniowe BK Ca. Pomiary miocytów serca i tętnicy krezkowej wskazały, że mechanizm aktywacji kanałów K ATP poprzez 11,12-EET przebiega odmiennie. Kanał K ATP miocytów serca aktywowany był od strony cytoplazmatycznej. Kanał K ATP tętnicy krezkowej od strony zewnątrzkomórkowej i dodatkowo jego aktywacja zależna była od kinazy PKA i ADP-rybozylotransferazy [57]. Serca myszy transgenicznych z nadprodukcją cytochromu P-450, a co za tym idzie, podwyższonym poziomem kwasów 8,9- DHET (11,12-DHET; 14,15-DHET) były bardziej odporne na wywoływaną 20 minutową ischemię wraz z następczą 40 minutową reperfuzją [58]. Okazało się, że 20 minutowa perfuzja inhibitora kanału K ATP (glibenklamid, 5-HD) tuż przed wywoływaną ischemią, znosiła ten efekt [57]. Rola wpływu kwasów tłuszczowych na kanały potasowe Kwasy tłuszczowe oraz ich produkty przemian są nie tylko cząsteczkami budulcowymi komórki, ale również biorą udział w regulacji metabolizmu komórki na różnych płaszczyznach. Pełnią funkcję cząsteczek sygnałowych i regulatorowych. Oddziałują z wieloma białkami, w tym błonowymi. Kwasy tłuszczowe stały się obiektem badań elektrofizjologów, ze względu na ich zdolność do regulowania potencjału błonowego, długotrwałej potencjalizacji, plastyczności synaptycznej. Dokładniejsze badania wskazały że regulacja ta związana jest z oddziaływaniem kwasów tłuszczowych z kanałami jonowymi. Ponieważ poziom wielu kwasów tłuszczowych zmienia się w stanach patologicznych, na przykład podczas niedotlenienia mózgu, epilepsji, cukrzycy, chorób neurodegeneracyjnych, interesującym wydało się sprawdzenie na jakie docelowo białka mogą działać. Mówiąc o roli kwasów wielonienasyconych w zapobieganiu niektórym chorobom, należy przytoczyć wyniki badań dotyczące takich kwasów tłuszczowych jak DHA, EPA i LA w zjawiskach kardio- [59] i neuroprotekcji [60]. Kwas DHA podawany szczurom z okluzją naczynia tętnicy szyjnej (model ogniskowego niedokrwienia), powodował zmniejszenie obszaru uszkodzenia o 40% w trzy godziny i 66% w cztery godziny po wywołanym niedokrwieniu. Dodatkowo po podaniu DHA dochodziło do wzrostu syntezy neuroprotektyny D1 [61]. Doświadczenia na skrawkach organotypowych hipokampa wykazały, że 24 godzinna inkubacja z 10 µm DHA powodowała zmniejszenie uszkodzenia o 70% w zakręcie zębatym i 40 50% w regionach CA1 i CA3 formacji hipokampa [62]. Stwierdzono również, że pod wpływem DHA dochodziło do hamowania syntezy prostaglandyn oraz ekspresji genu kodującego COX [63,64]. W przypadku EPA, Okabe i wsp. zaobserwowali, że kwas ten wykazuje właściwości przeciwzapalne i obniża poziom uszkodzeń DNA [65]

9 Wiele prac wskazuje na wzajemne zależności pomiędzy kanałami potasowymi, kwasami tłuszczowymi a protekcją komórek. Myszy z nokautem genu TREK-1 (TREK-1 -/- ) i poddawane uszkodzeniu niedokrwiennemu mózgu, wywołanemu zaciśnięciem tętnicy środkowej mózgu (MCAO, ang. middle cerebral artery occlusion), były bardziej wrażliwe na niedotlenienie, w stosunku do myszy kontrolnych. Dodatkowo, u zwierząt takich nie obserwowano efektu protekcyjnego po podaniu kwasu α-linolowego czy lizofosfatydylocholiny [66]. Pierwsza z hipotez zakładała, że aktywowane kanały TREK-1, występujące na powierzchni neuronów, w warunkach obniżonego zewnątrzkomórkowego ph oraz podwyższonego poziomu PUFA podczas niedotlenienia, wpływają na hiperpolaryzację błony i obniżenie aktywności neuronów. W warunkach hiperpolaryzacji dochodzi do zmniejszonego napływu jonów wapniowych do cytoplazmy neuronów presynaptycznych, co w konsekwencji powoduje ograniczone wydzielanie glutaminianu do przestrzeni synaptycznej. W neuronach postsynaptycznych ich hiperpolaryzacja pod wpływem otwartych kanałów TREK ogranicza liczbę aktywnych receptorów NMDA (ang. N- -methyl-d-aspartate). Drugi z mechanizmów zakłada, że kanał TREK-1, występujący również w błonie plazmatycznej komórek śródbłonka oraz mięśni gładkich naczyń krwionośnych, wpływa na relaksację ścian naczynia i zwiększony przepływ krwi. Naczynia myszy TREK-1 -/- były niewrażliwe na acetylocholinę czy kwas α-linolowy. Badanie przepływu krwi w naczyniach techniką laserową Dopplera u myszy TREK-1 -/- wykazało, że u zwierząt tych podawanie kwasu α-linolowego lub DHA nie wpływało na przepływ krwi w tętnicy środkowej mózgu, jak w przypadku myszy TREK-1 +/+ [67]. Mutacje genów kanałów potasowych KCNQ1, KCNQ2 oraz KCNQ3 odpowiadają za wystąpienie kilku zespołów padaczkowych. Jedną z alternatywnych metod leczenia padaczki, jest dieta ketogenna (KD, ang. ketogenic diet). Polega ona na wprowadzeniu organizm w stan ketozy, a głównym paliwem nie jest glukoza a kwasy tłuszczowe. Okazało się, że wielonienasycone kwasy tłuszczowe (wzrastające 1,5 4 krotnie w surowicy osób chorych na padaczkę i poddawanych diecie KD) aktywują bramkowane napięciem kanały potasowe [68]. 21 μm DHA powodował przesunięcie krzywej zależności napięcia od przewodnictwa kanału w stronę potencjałów hiperpolaryzujących. Symulacja komputerowa wykazała, że aktywowane pod wpływem wielonienasyconych kwasów tłuszczowych kanały Kv powodowały zmniejszenie powtarzających się z dużą częstością wyładowań neuronów osób chorujących na epilepsję. Inny z przykładów to wpływ kwasu arachidonowego na dojrzewanie limfocytów B, poprzez specyficzne wiązanie z białkiem kanałowym występującym na błonie plazmatycznej tych komórek. To czy dany kanał potasowy wrażliwy na AA występuje w limfocytach B, determinuje na jaką ścieżkę wejdzie dojrzewający limfocyt. Niedojrzałe limfocyty B eksprymują kanały potasowe o dużym przewodnictwie, aktywowane AA. Dojrzałe limfocyty B, kanały bramkowane napięciem Kv oraz o średnim przewodnictwie regulowane jonami wapniowymi IK ca, oba hamowane przez AA [69]. Podsumowanie Ze względu na udokumentowany różnorodny wpływ kwasów tłuszczowych na kanały potasowe, nie można jednoznacznie określić jednego wspólnego mechanizmu, w oparciu o który modulują one aktywność kanałów. Część z kwasów tłuszczowych aktywuje, część hamuje, a część nie wpływa w sposób istotny na kanały potasowe. Droga na jakiej działają może być zarówno jednoczynnikowa, to znaczy kwasy tłuszczowe mogą oddziaływać bezpośrednio z białkiem kanałowym, lub wieloczynnikowa. W przypadku tej ostatniej wiele prac wskazuje na udział białek regulatorowych towarzyszących kanałom, kinaz i reaktywnych form tlenu. Ze względu na udział wielu kwasów tłuszczowych w zjawiskach protekcji komórek, coraz częściej formułowany jest pogląd, że jednym z celów ich działania są kanały potasowe. Poznanie dokładnych miejsc wiązania kwasów tłuszczowych w strukturze kanałów wymaga dalszych badań i bardziej doskonałych technik pomiarowych. Ustalenie biochemicznych konsekwencji zmian w profilu elektrofizjologicznym kanałów pod wpływem kwasów tłuszczowych umożliwi poznanie nowych szlaków sygnałowych odpowiedzi komórki na lokalne, bądź globalne zmiany stężeń kwasów tłuszczowych. Piśmiennictwo 1. Hodgkin AL, Huxley AF (1952) Propagation of electrical signals along giant nerve fibers. Proc R Soc Lond B Biol Sci 140: Neher E, Sakmann B (1975) Voltage-dependence of drug-induced conductance in frog neuromuscular junction. Proc Natl Acad Sci USA 72: Inoue I, Nagase H, Kishi K, Higuti T (1991) ATP-sensitive K + channel in the mitochondrial inner membranę. Nature 352: Siemen D, Loupatatzis C, Borecky J, Gulbins E, Lang F (1999) Ca 2+ - activated K channel of the BK-type in the inner mitochondrial membrane of a human glioma cell line. Biochem Biophys Res Commun 257: De Marchi U, Sassi N, Fioretti B, Catacuzzeno L, Cereghetti GM, Szabò I, Zoratti M (2009) Intermediate conductance Ca 2+ -activated potassium channel (KCa3.1) in the inner mitochondrial membrane of human colon cancer cells. Cell Calcium 45: Szabo I, Bock J, Jekle A, Soddemann M, Adams C, Lang F, Zoratti M, Gulbins E (2005) A novel potassium channel in lymphocyte mitochondria. J Biol Chem 280: Bednarczyk P, Kowalczyk JE, Beresewicz M, Dołowy K, Szewczyk A, Zabłocka B (2010) Identification of a voltage-gated potassium channel in gerbil hippocampal mitochondria. Biochem Biophys Res Commun 397: Rusznák Z, Bakondi G, Kosztka L, Pocsai K, Dienes B, Fodor J, Telek A, Gönczi M, Szucs G, Csernoch L (2008) Mitochondrial expression of the two-pore domain TASK-3 channels in malignantly transformed and non-malignant human cells. Virchows Arch 452: Garlid KD, Paucek P, Yarov-Yarovoy V, Murray HN, Darbenzio RB, D Alonzo AJ, Lodge NJ, Smith MA, Grover GJ (1997) Cardioprotective effect of diazoxide and its interaction with mitochondrial ATP-sensitive K+ channels. Possible mechanism of cardioprotection. Circ Res 81: Domoki F, Perciaccante JV, Veltkamp R, Bari F, Busija DW (1999) Mitochondrial potassium channel opener diazoxide preserves neuronalvascular function after cerebral ischemia in newborn pigs. Stroke 30: Postępy Biochemii 58 (2)

10 11. Xu W, Liu Y, Wang S, McDonald T, Van Eyk J, Sidor A, O Rourke B (2002) Cytoprotective role of Ca 2+ -activated K + channels in the cardiac inner mitochondrial membrane. Science 298: Gaspar T, Snipes JA, Busija AR, Kis B, Domoki F, Bari F, Busija DW (2008) ROS-independent preconditioning in neurons via activation of mitok ATP channels by BMS J Cereb Blood Flow Metab 28: Richieri GV, Ogata RT, Kleinfeld AM (1992) A fluorescently labeled intestinal fatty acid binding protein. Interactions with fatty acids and its use in monitoring free fatty acids. J Biol Chem 267: Angelova P, Müller W (2006) Oxidative modulation of the transient potassium current IA by intracellular arachidonic acid in rat CA1 pyramidal neurons. Eur J Neurosci 23: Clarke AL, Petrou S, Walsh JV Jr, Singer JJ (2002) Modulation of BK(Ca) channel activity by fatty acids: structural requirements and mechanism of action. Am J Physiol Cell Physiol 283: C Sun X, Zhou D, Zhang P, Moczydlowski EG, Haddad GG (2007) Beta-subunit-dependent modulation of hslo BK current by arachidonic acid. J Neurophysiol 97: Sano Y, Inamura K, Miyake A, Mochizuki S, Kitada C, Yokoi H, Nozawa K, Okada H, Matsushime H, Furuichi K (2003) A novel two-pore domain K + channel, TRESK, is localized in the spinal cord. J Biol Chem 278: Denson DD, Wang X, Worrell RT, Eaton DC (2000) Effects of fatty acids on BK channels in GH(3) cells. Am J Physiol Cell Physiol 279: C Zheng HF, Li XL, Jin ZY, Sun JB, Li ZL, Xu WX (2005) Effects of unsaturated fatty acids on calcium-activated potassium current in gastric myocytes of guinea pigs. World J Gastroenterol 11: Villarroel A, Schwarz TL (1999) Inhibition of the Kv4 (Shal) family of transient K + currents by arachidonic acid. J Neurosci 16: Gavrilova-Ruch O, Schönherr R, Heinemann SH (2007) Activation of heag1 potassium channels by arachidonic acid. Pflugers Arch 453: Ahn DS, Kim YB, Lee YH, Kang BS, Kang DH (1994) Fatty acids directly increase the activity of Ca 2+ -activated K + channels in rabbit coronary smooth muscle cells. Yonsei Med J 35: Guizy M, David M, Arias C, Zhang L, Cofán M, Ruiz-Gutiérrez V, Ros E, Lillo MP, Martens JR, Valenzuela C (2008) Modulation of the atrial specific Kv1.5 channel by the n-3 polyunsaturated fatty acid, alpha- -linolenic acid. J Mol Cell Cardiol 44: Petrou S, Ordway RW, Hamilton JA, Walsh JV Jr, Singer JJ (1994) Structural requirements for charged lipid molecules to directly increase or suppress K + channel activity in smooth muscle cells. Effects of fatty acids, lysophosphatidate, acyl coenzyme A and sphingosine. J Gen Physiol 103: Denson DD, Li J, Eaton DC (2006) Co-localization of the alpha-subunit of BK-channels and c-pla2 in GH3 cells. Biochem Biophys Res Commun 350: Li J, Al-Khalili O, Ramosevac S, Eaton DC, Denson DD (2010) Protein- -protein interaction between cpla2 and splice variants of alpha-subunit of BK channels. Am J Physiol Cell Physiol 298: C Hamilton KL, Syme CA, Devor DC (2003) Molecular localization of the inhibitory arachidonic acid binding site to the pore of hik1. J Biol Chem 278: Rogalski SL, Chavkin C (2001) Eicosanoids inhibit the G-protein-gated inwardly rectifying potassium channel (Kir3) at the Na+/PIP2 gating site. J Biol Chem 276: Kim Y, Bang H, Gnatenco C, Kim D (2001) Synergistic interaction and the role of C-terminus in the activation of TRAAK K + channels by pressure, free fatty acids and alkali. Pflugers Arch 442: Kim Y, Gnatenco C, Bang H, Kim D (2001) Localization of TREK-2 K + channel domains that regulate channel kinetics and sensitivity to pressure, fatty acids and phi. Pflugers Arch 442: Macica CM, Yang Y, Lerea K, Hebert SC, Wang W (1998) Role of the NH 2 terminus of the cloned renal K + channel, ROMK1, in arachidonic acid-mediated inhibition. Am J Physiol 274: F Honoré E, Maingret F, Lazdunski M, Patel AJ (2002) An intracellular proton sensor commands lipid- and mechano-gating of the K + channel TREK-1. EMBO J 21: Börjesson SI, Elinder F (2008) Structure, function, and modification of the voltage sensor in voltage-gated ion channels. Cell Biochem Biophys 52: Börjesson SI, Hammarström S, Elinder F (2008) Lipoelectric modification of ion channel voltage gating by polyunsaturated fatty acids. Biophys J 95: Börjesson SI, Elinder F (2011) An electrostatic potassium channel opener targeting the final voltage sensor transition. J Gen Physiol 137: Liu Y, Liu D, Heath L, Meyers DM, Krafte DS, Wagoner PK, Silvia CP, Yu W, Curran ME (2001) Direct activation of an inwardly rectifying potassium channel by arachidonic acid. Mol Pharmacol 59: Hilgemann DW, Ball R (1996) Regulation of cardiac Na +,Ca 2+ exchange and K ATP potassium channels by PIP 2. Science 273: Larsson O, Deeney JT, Bränström R, Berggren PO, Corkey BE (1996) Activation of the ATP-sensitive K + channel by long chain acyl-coa. A role in modulation of pancreatic beta-cell glucose sensitivity. J Biol Chem 271: Fan Z, Makielski JC (1997) Anionic phospholipids activate ATP-sensitive potassium channels. J Biol Chem 272: Bregestovski PD, Bolotina VN (1989) Membrane fluidity and kinetics of Ca 2+ -dependent potassium channels. Biomed Biochim Acta 48: S Sheetz MP, Singer SJ (1974) Biological membranes as bilayer couples. A molecular mechanism of drug-erythrocyte interactions. Proc Natl Acad Sci USA 71: Patel AJ, Honoré E, Maingret F, Lesage F, Fink M, Duprat F, Lazdunski M (1998) A mammalian two pore domain mechano-gated S-like K + channel. EMBO J 17: Maingret F, Patel AJ, Lesage F, Lazdunski M, Honoré E (2000) Lysophospholipids open the two-pore domain mechano-gated K + channels TREK-1 and TRAAK. J Biol Chem 275: Martens JR, O Connell K, Tamkun M (2004) Targeting of ion channels to membrane microdomains: localization of KV channels to lipid rafts. Trends Pharmacol Sci 25: Martens JR, Navarro-Polanco R, Coppock EA, Nishiyama A, Parshley L, Grobaski TD, Tamkun MM (2000) Differential targeting of Shaker- -like potassium channels to lipid rafts. J Biol Chem 275: Martens JR, Sakamoto N, Sullivan SA, Grobaski TD, Tamkun MM (2001) Isoform-specific localization of voltage-gated K + channels to distinct lipid raft populations. Targeting of Kv1.5 to caveolae. J Biol Chem 276: Bock J, Szabó I, Gamper N, Adams C, Gulbins E (2003) Ceramide inhibits the potassium channel Kv1.3 by the formation of membrane platforms. Biochem Biophys Res Commun 305: Bravo-Zehnder M, Orio P, Norambuena A, Wallner M, Meera P, Toro L, Latorre R, González A (2000) Apical sorting of a voltage- and Ca 2+- -activated K + channel alpha -subunit in Madin-Darby canine kidney cells is independent of N-glycosylation. Proc Natl Acad Sci USA 97: Weaver AK, Olsen ML, McFerrin MB, Sontheimer H (2007) BK channels are linked to inositol 1,4,5-triphosphate receptors via lipid rafts: a novel mechanism for coupling Ca 2+ ] i to ion channel activation. J Biol Chem 282: Song P, Yang Y, Barnes-Davies M, Bhattacharjee A, Hamann M, Forsythe ID, Oliver DL, Kaczmarek LK (2005) Acoustic environment determines phosphorylation state of the Kv3.1 potassium channel in auditory neurons. Nat Neurosci 8: Zhu Y, Chen L, Liu W, Wang W, Zhu D, Zhu Y (2010) Hypoxia-induced 15-HETE enhances the constriction of internal carotid arteries by down-regulating potassium channels. J Neurol Sci 295: Burg ED, Remillard CV, Yuan JX (2008) Potassium channels in the regulation of pulmonary artery smooth muscle cell proliferation and 164