Tadeusz Wolski 1, 2, Agnieszka Najda 2, Elżbieta Hołderna-Kędzia 1,2

Transkrypt

1 Postępy Fitoterapii 3/2004, s Tadeusz Wolski 1, 2, Agnieszka Najda 2, Elżbieta Hołderna-Kędzia 1,2 Zawartość i skład olejków eterycznych oraz ekstraktów otrzymanych z owoców niektórych roślin z rodziny Umbelliferae (Apiaceae)wraz ze wstępną oceną przeciwbakteryjną ekstraktów Content and composition of essential oils and extracts obtained from fruit of selected plants from Umbelliferae (Apiaceae) family with preliminary antibacterial estimation of extracts 1 Katedra i Zakład Farmakognozji z Pracownią Roślin Leczniczych Akademii Medycznej w Lublinie Kierownik Katedry: prof. dr hab. med. Kazimierz Głowniak 2 Katedra Warzywnictwa i Roślin Leczniczych Akademii Rolniczej w Lublinie Kierownik Katedry: prof. dr hab. med. Jan Dyduch 3 Instytut Roślin i Przetworów Zielarskich w Poznaniu Dyrektor Instytutu: dr hab. med. Przemysław Mrozikiewicz Summary Content and composition of essential oils and extracts obtained from fruit of following species: Archangelica officinalis Hoffm., Pastinaca sativa L., Levisticum officinale Koch. and two varieties of Apium graveolens L. var. dulce Mill./Pers. were estimated. Quality and quantity composition of essential oils and extracts were investigated by the GC/MS method. Antibacterial activity of extracts was also determinated. Key words: plants from umbelliferae family, essential oils, extracts, antibacterial activity, olejek eteryczny, ekstrakt, umbelliferae,ocena przeciwbakteryjna. Olejki eteryczne stanowią heterogenną grupę produktów roślinnych o zróżnicowanym charakterze chemicznym, które wykazują szerokie spektrum właściwości farmakologicznych. Olejki eteryczne od dawna znane są jako zapachowe substancje roślinne stosowane do celów kosmetycznych, dezynfekujących, leczniczych i przyprawowych. Pod względem chemicznym olejki eteryczne stanowią wieloskładnikowe mieszaniny związków terpenowych i pochodnych fenylopropanu, a także związków zawierających substancje siarkowe, azotowe, pochodne acetylenu i inne. Związki występujące w olejkach mają charakter węglowodorów, alkoholi, aldehydów, ketonów, estrów i eterów. Zdolność do syntezy olejków eterycznych ma nieco ponad gatunków należących do 250 rodzin roślin występujących na ziemi. Do jednej z rodzin, której cechą chemotaksonomiczną jest wytwarzanie olejków eterycznych, należy rodzina Umbelliferae( Apiaceae) (4, 13). Przedmiotem prezentowanych badań są olejki eteryczne występujące w owocach arcydzięgla lekarskiego (Archangelica officinalis Hoffm.), pasternaku siewnego ( Pastinaca sativa L.), lubczyka ogrodowego ( Levisticum officinale Koch.) oraz dwóch odmian selera naciowego ( Apium graveolens L. var. dulce Mill./Pers.), a także otrzymanych z nich ekstraktów. Celem badań było oznaczenie składu jakościowego i ilościowego olejków eterycznych i ekstraktów otrzymanych z badanych surowców. Ponadto postanowiono określić aktywność przeciwbakteryjną uzyskanych ekstraktów roślinnych. MATERIAŁ I METODY Przedmiotem badań były owoce wymienionych wyżej roślin. W badanych surowcach oznaczano zawartość wody, białka metodą Lowry, sumę węglowodanów motodą Schoorla-Luffa (12) oraz zawartość olejków eterycznych w aparacie Derynga (9). Skład jakościowy i ilościowy poszczególnych składników olejków eterycznych wyznaczano metodą GC/MS przy użyciu aparatu ITS-40 (układ GC/ITMS firmy Finnigan MAT, USA) z kolumną DB-5 (J & W, USA) o długości 30 m, średnicy 0,25 mm i grubości filmu fazy stacjonarnej 0,25 mm. Temperatura dozownika wynosiła 280 C. Stosowano gradient temperatury (35 C przez 2 min, następnie przyrost o 4 C do 280 C). Analizę

2 jakościową przeprowadzano na podstawie widm MS, porównując je z widmami biblioteki NIST oraz z biblioteką terpenów LIBR (TR) (Finnigan MAT, USA). Tożsamość związków potwierdzano indeksami retencji z danych piśmiennictwa i własnych (13). Skład ilościowy olejków eterycznych określano przyjmując, że suma poszczególnych związków olejkowych wynosi 100%. Ekstrakty otrzymywano na drodze ekstrakcji 20 g badanych surowców (owoców) za pomocą n-heksanu, chlorku metylenu i 96% etanolu w stosunku 1:10 w aparacie Soxhleta w czasie 12 godzin. Otrzymane ekstrakty zagęszczano, a następnie rozpuszczano w 10 ml rozpuszczalnika użytego do ekstrakcji. Wstępną ocenę aktywności przeciwbakteryjnej określano według wcześniej opisanych metod (11). Do badań mikrobiologicznych użyto 5 szczepów bakterii referencyjnych: Staphylococcus aureus FDA 209P, Staphylococcus aureus kg+ AM, Enterococcus faecalis ATCC 8040 (l). Escherichia coli PZH O 26B 6 i Pseudomonas aeruginosa Sept. 85/2. WYNIKI I ICH OMÓWIENIE Zawartość wilgoci, sumy węglowodanów, białka ogólnego i olejku eterycznego w poszczególnych surowcach zamieszczono w tabeli 1. Tabela 1. Zawartość wilgoci, sumy węglowodanów, białka ogólnego i olejku eterycznego w owocach badanych surowców. Badany surowiec (owoce) Wilgotność (%) Węglowodany ogółem (%) Białko właściwego (%) Olejek eteryczny (%) Archangelica officinalis 8,1 4,7 5,6 2,7 Pastinaca sativa 8,4 5,4 4,9-2,3 Levisticum officinale 5,6 4,8 2,1 Seler - odmiana Zefir - odmiana Helios 9,2 8,6 4,6 5,2 6,8 7,0 2,8 3,0 Owoc arcydzięgla lekarskiego Z piśmiennictwa wynika, że w owocach arcydzięgla zawartość olejku eterycznego mieści się w przedziale 0,3-1,0%, a głównymi składnikami są - i -felandren oraz -pinen (8). Charakterystycznymi składnikami tego olejku są tri- i pentadekanolidy występujące w ilości ok. 1,0%, nadające cechy sensoryczne olejkowi. Gawdzik i wsp. (3) prowadzili ekstrakcję nadkrytyczą ciekłym C0 2 (SFE) olejku eterycznego występującego w owocach arcydzięgla lekarskiego, który analizowali metodą GC/MS. W wyniku tych badań stwierdzono obecność 75 związków, a wśród nich - i -felandren, -pinen, -humulen, -kopaen, - i -muurolen. Badania dotyczące zawartości poszczególnych składników olejku eterycznego oraz w ekstraktach (heksanowym i etanolowym) otrzymanych z owoców arcydzięgla lekarskiego podaje tabela 2. Tabela 2. Skład jakościowy i ilościowy olejku eterycznego oraz ekstraktów otrzymanych z owoców arcydzięgla lekarskiego ( Archangelica officinalis Hoffm.) oznaczony metodą GC/MS. Zawartość (%) Lp. Związek Ekstrakty OE Heksan Chlorek metylenu Alkohol etylowy 1. -Tujen i.ś

3 2. -Pinen 2,9 2,1 1,7-3. Camphen 0,1 - i.ś Sabinen 0,2 0,1 0,2-5. -Pinen 0,5 0,3 0,5-6. Myrcene 1,4 1,2 0,5-7. -Felandren 2,3 2,6 0, Caren i.ś. - i.ś Terpin 0,3 i.ś. i.ś. i.ś Cymen 1,5 1,0 0, Felandren 59,4 64,3 38,0 5,9 12. Cis-Ocimen i.ś Trans-Ocimen i.ś Terpinen i.ś Terpinolen i.ś Isopentyl isovalerat i.ś Krypton 2,6-0,1-18. Thymol methyl ether i.ś. - i.ś Aldehyd kuminylu i.ś. - i.ś Tlenek borynylu i.ś Kopaen 3,3 1,9 1,2 0, Bourbonen 0,4 i.ś. i.ś Octyl butanoate 2,2 - i.ś Elemen 1,0 0,1 i.ś. -

4 25. Longifolen i.ś. - i.ś Kariofilen 0,4 i.ś. i.ś Z-trans- - Bergamoten 0,8 0,3-0, Humulen 3,3 1,8 0, Muurolen i.ś Germakren D 3,1 1,8 i.ś. 0, Zingiberen 1,5 1,1 - i.ś. 32. Germakren B tr - - i.ś Muurolen 1,2 0,3 0,2 i.ś Bisabolen 0,6 1,0 0,3 0, Kadinen i.ś trans- - Farnezen 1,7 0,9 0,3 i.ś. 37. Elemol 0, Elemen 1,3 0,2 - i.ś. 39. Spatulenol 0, Tlenek karyofylenu i.ś Germakren D- 4-ol i.ś Tridekanolid 0, Pentadekanolid 0,6-0,2-44. Etyl plamitate - - 0,4 6,2 45. Xanthoxin - 2,0 3,5 46. Bergapten - i.ś. 7,7 2,4 47. Ethyl linolate - - 0,6 40,8 48. Ethyl oleate - - 0,4 24,3

5 49. Etyl oleate - isomer ,3 50. Etyl stearate ,5 51. Isopimpinellin - - 3,4 1,1 52. Xantotoxol - 3,5 22,4 9,5 i. ś. - ilości śladowe Zawartość (%) Lp. Związek Ekstrakty OE Heksan Chlorek metylenu Alkohol etylowy 1. Ester butylowy kwasu masłowego i.ś Ester heksylowy kwasu masłowego 3,5 1,3 2,1 0,2 3. Octan oktylu 9,5 4,6 5,8 1,4 4. Ester 1- etylenoheksylowy kwasu masłowego (niezidentyfikowany) 2,4 1,3 1,5 0,3 5. Ester heksylowy kwasu kapronowego 0, Ester oktylowy kwasu masłowego 83,2 74,7 70,1 30,0 7. Myristycyna 0,2 0,2 0,2 0,2 8. X (niezidentyfikowany) 1,2 4,2 6,0 1,1 9. Ester etylowy kwasu palmitynowego ,3 10. Ksantotoksyna - 0,5 7,2 5,6 11. Bergapten - 0,5 3,4 2,6 12. X (niezidentyfikowany) - 0,7 0,9 0,8

6 13. Ostol - 0,7 0,3 0,3 14. Ester etylowy kwasu linolowego - - śl 9,3 15. Ester etylowy kwasu olejowego ,1 16. Ester etylowy kwasu stearynowego ,7 17. Izopimpinelina - - 0,3 1,0 18. Ksantotoksol - 0,7 1,0 0,7 19. Kwas olejowy - 8,2-0,1 20. C29-0,7 0,4-21. C31-0,5 0,1 - i. ś. - ilości śladowe Porównując składy jakościowe olejku eterycznego i ekstraktów należy stwierdzić, że różnią się one znacznie składem chemicznym. Jak wynika z danych zawartych w tabeli 2 w olejku eterycznym otrzymanym z owoców arcydzięgla lekarskiego występowały 43 związki chemiczne, w ekstrakcie heksanowym 20, zaś w ekstrakcie chlorku metylenu 25. Tak znaczne różnice w ilości wykrywanych związków w badanym olejku i ekstraktach wynikają prawdopodobnie z możliwych strat powstałych w wyniku 6-godzinnego ogrzewania surowca z rozpuszczalnikami w aparacie Soxhleta oraz z różnicy rozpuszczalności ekstrahowanych związków w poszczególnych rozpuszczalnikach (14). Oceniając zawartość ilościową poszczególnych składników olejku eterycznego należy stwierdzić, że głównym jego składnikiem jest -felandren występujący w ilości około 60%. Wysoka zawartość -felandrenu uważana jest za cechę chemotaksonomiczną dla rodziny Umbelliferae ( Apiaceae) (5). Uzyskane wyniki są zgodne z danymi piśmiennictwa, a owoce arcydzięgla mogą służyć do otrzymywania olejku arcydzięglowego, który może być stosowany w zapobieganiu powstawania nowotworów (l, 2, 10, 15). Na uwagę zasługuje wysoka zawartość furanokumaryn (ksantotoksyny i bergaptenu oraz izopimpineliny i ksantotoksolu) w ekstraktach otrzymanych przy użyciu chlorku metylenu i etanolu. Ten fakt wpływać może na aktywność przeciwdrobnoustrojową badanych ekstraktów. Owoc pasternaku siewnego Skład ilościowy poszczególnych składników występujących w olejku eterycznym i ekstraktach (heksanowym, metylenowym i etanolowym) otrzymanych z owoców pasternaku siewnego przedstawiono w tabeli 3. Tabela 3. Skład jakościowy i ilościowy olejku eterycznego oraz ekstraktów otrzymanych z owoców pasternaku siewnego ( Pastinaca sativa L.) oznaczony metodą GC/MS. Jak wynika z danych zaprezentowanych w tabeli głównymi składnikami olejku eterycznego są estry niższych kwasów tłuszczowych, to jest masłowego (oktylowy 83,2% i heksylowy 3,5%) oraz octowego (oktylowy 9,5%). W skład ekstraktów otrzymanych przy użyciu heksanu, chlorku metylenu i alkoholu etylowego wchodzą nielotne z parą wodną składniki, a mianowicie kumaryny i furanokumaryny oraz estry wyższych kwasów tłuszczowych. Wśród furanokumaryn występuje bergapten i ksantotoksyna oraz izopimpinelina i ksantotoksol, zaś kumaryny reprezentuje ostol. W skład estrów wyższych kwasów tłuszczowych wchodzą: palmitynian i stearynian etylu oraz estry etylowe kwasu olejowego i linolowego, a także wolny kwas olejowy. Najlepszym ekstrahentem związków kumarynowych okazał się chlorek metylenu oraz 96% etanol, które ekstrahują również znaczne ilości

7 estrów wyższych kwasów tłuszczowych (olejowego i linolowego). Ten fakt może świadczyć, że w procesie ekstrakcji powstające wolne kwasy tłuszczowe ulegają estryfikacji alkoholem etylowym. Zastosowanie heksanu jako ekstrahenta, w którym związki kumarynowe wykazują ograniczoną rozpuszczalność, potwierdza niska w porównaniu do chlorku metylenu i etanolu zawartość procentowa tych związków. Warte podkreślenia jest to, że w ekstrakcie heksanowym występuje wolny kwas olejowy (8,2%). Owoc lubczyka ogrodowego Skład jakościowy i ilościowy olejków eterycznych występujących w owocach lubczyka ogrodowego, otrzymywanych trzema metodami i oznaczonych metodą GC/MS, przedstawiono w tabeli 4. Tabela 4. Skład jakościowy i ilościowy olejku eterycznego z owoców lubczyka ogrodowego ( Levisticum officinalekoch.) oznaczony metodą GC/MS. Olejek oznaczono trzema metodami: I, II, III. Nazwa związku Metoda destylacji OE I II III 1. -Pinen 1,0 1,5 1,4 2. Kamfen - 0,2 0,3 3. Sabinen 0,8 0,3 0,5 4. -Pinen 0,7 0,5 0,4 5. Mircen 1,1 1,2 2,9 6. -Felandren 1,1 3,3 8,7 7. -Terpinen 0,3 0,2 3,9 8. -Cymene 0,3-0, Felandren 55,2 66,0 48,5 10. cis-ocimen 1,2 i.ś. 3,7 11. Limonen 2,9 3,0 2, Terpinen 1,3 0,2 0,9 13. Terpinolen - 0,1 0, Terpineol - - 0, Terpineol 4,1 3,5 2, terpinenyl acetat 4,2 3,2 3,8 17. Germakren D 0,7 - i.ś Elemen - - 0,5

8 19. trans-3-n-butyloftalid 1,1 0,8 0,6 20. cis-ligustilid 21,0 14,4 11,3 21. trans-ligustilid 1,0 1,0 0,5 metody destylacji: I - z parą wodną, II - z m-ksylenem, III - z m- ksylenem i kwasem siarkowym i.ś. - ilości śladowe Analiza GC/MS olejku eterycznego otrzymanego z owoców lubczyka ogrodowego wykazywała w zależności od metody destylacji od 17 (metoda I i II) do 21 związków (metoda III). W skład olejku eterycznego otrzymanego z owoców lubczyka wchodzą głównie monoterpeny, których dominującymi składnikami są - i -felandren, limonen, -terpineol oraz octan -terpineolu. Wśród seskwiterpenów stwierdzono tylko niewielką zawartość germakrenu D. Kolejną frakcją występującą w olejku eterycznym z owoców lubczyka jest frakcja ftalidowa, której najważniejszymi składnikami są cis- i trans-3-n-butyloftalid oraz cis- i trans-ligustilid. Owoc selera naciowego Zawartość składników olejków eterycznych występujących w owocach dwóch odmian selera naciowego podaje tabela 5/6. Analiza GC/MS wykazała, że olejek eteryczny otrzymany z owoców odmiany Helios zawiera 25, zaś odmiany Zefir 23 składniki. Głównymi składnikami olejku eterycznego pochodzącego z owoców selera są izoprenoidy, a wśród nich monoterpeny i seskwiterpeny. W skład frakcji monoterpenowej wchodzą - i -pinen, myrcen oraz limonen, który jest najważniejszym składnikiem tej frakcji. Zawartość limonenu zależy od odmiany i mieści się w przedziale od 74,8% do 76,6%. Kolejnym składnikiem tej frakcji są - i -pinen, które występują w ilości od 3,6% do 7,0% oraz myrcen, którego zawartość mieści się w przedziale od 0,6% do 0,9% (6, 7, 13). Tabela 5/6. Zawartość procentowa głównych składników frakcji terpenowych oraz seskwiterpenowych i ftalidowych występujących w olejkach eterycznych (OE) oraz ekstraktach otrzymanych przy użyciu rozpuszczalników organicznych z owoców dwu odmian selera naciowego. Helios Zefir Lp. Compound Ekstrakt Ekstrakt OE Heksan Chlorek metylenu C 2H 5OH OE Heksan Chlorek metylenu C 2H 5OH 1. 2-heksanol 1, , pinene 0,3 i.ś ,3 i.ś pinene 3,4 2,2 1,6 1,1 3,3 1,8 1,3 1,0 4. myrcene 0,6 0,1 0,2 0,3 0,6 0,5 0,2 0,3 5. limonene 74,8 41,3 34,6 28,2 76,6 37,9 27,7 27,7 6. cis-ocimene i.ś. i.ś. i.ś. i.ś. i.ś. i.ś. i.ś. i.ś. 7. -terpinene i.ś. i.ś. i.ś. i.ś. i.ś. i.ś. i.ś. i.ś.

9 8. terpinene i.ś. i.ś. i.ś. i.ś. i.ś. i.ś. i.ś. i.ś. 9. linalool i.ś. i.ś. i.ś. i.ś. i.ś. i.ś. i.ś. i.ś. 10. i.ś. i.ś. i.ś. i.ś. i.ś. i.ś. i.ś. i.ś. 11. i.ś. i.ś. i.ś. i.ś. i.ś. i.ś. i.ś. i.ś. 12. cis-limoneneoxide trans-limoneneoxide transdihydrocarvone i.ś. i.ś. i.ś. i.ś. i.ś. i.ś. i.ś. i.ś. 13. trans-carveol i.ś. i.ś. i.ś. i.ś. i.ś. i.ś. i.ś. i.ś. 14. trans-sabinyl acetate 0,2 0,1 0,2 0,2 0,3 0,2 0,1 0,2 15. trans-carvyl acetate i.ś. i.ś. i.ś. i.ś. i.ś. i.ś. i.ś. i.ś elemene i.ś. i.ś. i.ś. i.ś. i.ś. i.ś. i.ś. i.ś caryophyllene 0,1 i.ś. i.ś. i.ś. 0,1 0,2 i.ś. i.ś humulene i.ś. i.ś. i.ś. i.ś. i.ś. i.ś. i.ś. i.ś selinene 16,8 16,9 14,9 16,3 15,3 18,3 17,1 20, selinene 2,0 2,5 2,1 2,0 1,8 2,4 2,8 2,2 21. kessane 0,2 0,7 0,3 0,4 i.ś. 0,6 1,7 0,7 22. caryophyllene oxide 0, ,3 0,4 i.ś. 0,5 0,4 0, n-butyloftalide i.ś. 8,1 9,1 12,0 i.ś. 7,9 9,4 11,7 24. dehydrosedanolid e i.ś. 26,8 29,8 35,4 i.ś. 26,5 29,5 34,5 25. sedanolide i.ś. 0,8 3,7 5,1 i.ś. 3,3 2,5 3,9 i.ś. - ilości śladowe Charakterystyczny zapach korzeni, ziela oraz owoców, a także produktów z nich otrzymywanych, przypisuje się ftalidom, które ze względu na małą lotność z parą wodną występują w niewielkich ilościach w olejku eterycznym otrzymanym z owoców selera naciowego (6, 12). Wstępna ocena aktywności przeciwbakteryjnej W prezentowanej pracy podjęto próbę wstępnej oceny aktywności przeciwbakteryjnej ekstraktów otrzymanych z badanych roślin wobec szczepów bakterii referencyjnych. Jak wynika z tabeli 7 największą aktywność w stosunku do szczepów referencyjnych wykazywały ekstrakty etanolowe i chlorku metylenu z arcydzięgla i pasternaku, co

10 może wynikać ze znacznej zawartości furanokumaryn. Porównując aktywność przeciwbakteryjną ekstraktów z dwóch odmian selera naciowego należy stwierdzić, że jest ona nieco niższa w porównaniu do aktywności ekstraktów z arcydzięgla i pasternaku. Aktywność przeciwbakteryjna ekstraktów z obu badanych odmian selera naciowego była zbliżona. Tabela. 7. Aktywność przeciwdrobnoustrojowej ekstraktów rozpuszczalnikowych dla badanych surowców. Badany surowiec Drobnoustroje (MIC - mg/ml) Owoce Arcydzięgiela lekarskiego wyciąg etaanolowy wyciąg dichlorometanowy wyciąg n-heksanowy 1,0 1,0 Owoce Pasternaku siewnego wyciąg etaanolowy wyciąg dichlorometanowy wyciąg n-heksanowy 1,0 1,0 2,5 Owoce Selera odmiana - Zefir wyciąg etaanolowy wyciąg dichlorometanowy wyciąg n-heksanowy 2,5 2,5 2,5 Owoce Selera odmiana - Helios wyciąg etaanolowy wyciąg dichlorometanowy wyciąg n-heksanowy 2,5 1 Staphylococcus aureus FDA 209P 2 Staphylococcus aureus kg+ AM 3 Enterococcus faecalis ATCC 8040 (1) 4 Escherichia coli PZH 026B6 5 Pseudomonas aeruginosa Sep tpiśmiennictwo l. Crowell P.L.: Monoterpenes in breast cancer chemoprevention. Breast Canc. Res. Treatm. 1997, 46, Elson C.E., Yu S.G.: The chemoprevention of cancer baby mevalonate derived constituents of fruits and vegetables. J. Nutr. 1994, 124, Gawdzik J., et al.: Supercritical fluid extraction of essential oil from the fruits of Archangelica off. Hoffm. and their characterization by GC/MS. J. High Resol. Chromatogr. 1996, Kohlmünzer S.: Farmakognozja. Wyd. Lek. PZWL, Warszawa 1998, s Lis A., Góra J.: Zmienność składu chemicznego olejków eterycznych. Aromaterapia 2000, Nr l, Ludwiczuk A., et al.: Chromatographic determination of the content and the composition of extracts and essential oils from the fruits of three varieties of celery ( Apium graveolens L. var. dulce Mill. Pers.). J. Planar Chromatogr. 2001, 14, Najda A.: Plonowanie i ocena fitochemiczna roślin selera naciowego w różnych fazach wzrostu dwu odmian selera naciowego ( Apium graveolens L. var. dulce Mill./Pers.). Rozprawa doktorska. Akademia Rolnicza, Lublin Newall C.A., et al.: Herbal medicines. The Pharm. Press, London 1996, s Farmakopea Polska V, Tom 5. Wyd. PTFarm., Warszawa 1999, s Wagner H., Wiesenauer M.: Phytoterapia. G.Fischer Verlag, Stuttgart-Jena- New York 1996 s Wolski T., et al.: Preparatywna ekstrakcja gazami w stanie nadkrytycznym (SFE) zespołów furanokumarynowych oraz ocena ich aktywności przeciwgrzybiczej. Herba Pol. 46(4): Wolski T., et al.: The content and composition of etheric oils obtained from three stalk celery varieties ( Apium graveolens L. var. dulce Mill. Pers.).Umbelliferae improvement. Newsletter 2000, 10, Wolski T., et al.: GC/MS analysis of eteric oil in fruits of three varieties of Apium graveolens L. var. dulce Mill. Pers. Ann. Univ. MCS. Sect. EEE, Suppl. 9, Wolski T., i wsp.: Surowce olejkowe, ich właściwości i zastosowanie. Mat. 3 Krajowego Sympozjum nt. Naturalne i syntetyczne produkty zapachowe. Łódź, czerwiec, Zheng G.Q., et al.: Chemoprevention of benzo- -pyrene induced forestomach cancer in mice by natural phthalides from celery seed oil. Nutr. Cancer 1993,