Międzynarodowa Komisja Włośnicowa International Commission on Trichinellosis (ICT)

Transkrypt

1 1 Międzynarodowa Komisja Włośnicowa International Commission on Trichinellosis (ICT) Zalecane metody diagnozowania włośnicy u zwierząt domowych i wolno żyjących, których mięso przeznaczone jest do konsumpcji dla człowieka Przedstawiony dokument jest jednolitym zbiorem procedur zalecanych do wykrywania nicieni z rodzaju Trichinella na wszystkich poziomach (ferma, ubojnia i przetwórnia mięsa). Przy ich tworzeniu wykorzystano wyniki najnowszych osiągnięć naukowych i reprezentują one oficjalne stanowisko Międzynarodowej Komisji Włośnicowej (ICT) dotyczące kontroli mięsa przeznaczonego do konsumpcji dla ludzi. Zalecenia te były publikowane pierwszy raz w 2000 roku przez Prezydium ICT w składzie: A. S. Bessonov (Rosja), K. Kuperlovic (Serbia), A. A. Gajadhar (Kanada), H. R. Gamble (USA), F. van Knapen (Holandia), K. Noeckler (Niemcy), H. Schenone (Chile) i X. Zhu (Chiny). Obecna wersja zalecanych procedur została przygotowana w 2006 roku i bazuje na najnowszych osiągnięciach z tej dziedziny. Przygotowali ją: P. Boireau (Francja), F. Bruschi (Włochy), H. R. Gamble (USA), A. A. Gajadhar (Kanada) i K. Noeckler (Niemcy), a następnie została zatwierdzona przez Prezydium ICT. Część 1 - Kontrola uboju (kontrola zwierząt) Badanie mięsa w rzeźniach ma na celu wyeliminowanie wystąpienia objawów klinicznych włośnicy u ludzi, co nie oznacza, że całkowicie eliminuje możliwość zarażenia tym pasożytem. Obecnie stosowane metody wytrawiania próby zbiorczej, co najmniej 1 g próbek (wieprzowina), są uważane za wystarczające do wykrycia mięsa zawierającego larwy włośni, mogącego wywołać tę groźną chorobę u ludzi. Dla produktów spożywanych bez gotowania lub innych procedur inaktywujących włośnie, są zalecane bardziej restrykcyjne badania. Badanie mięsa przy użyciu trychinoskopu nie daje gwarancji wykrycia larw tych gatunków włośni, które nie otorbiają się i dlatego też nie jest zalecane jako rutynowa procedura przy badaniu mięsa, pochodzącego zarówno od zwierząt hodowlanych, jak i wolno żyjących, a przeznaczonego do konsumpcji dla człowieka Rutynowe badanie mięsa świń w ubojniach Do rutynowego badania tusz świńskich poprzez wytrawianie prób zbiorczych w celu wyeliminowania możliwości zachorowań ludzi są zalecane co najmniej 1 g a nawet 5 g próby. Metodyka wytrawiania prób zbiorczych jest opisana w Załączniku I, oraz innych oficjalnych dokumentach:. OIE Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines (Article 2.2.9) oraz European Union Commission Regulation No. 2075/2005 (Rozdział 1, Aneks 1). Opisane metody wytrawiania prób zbiorczych muszą być właściwie wykonane i spełniać wymogi jakościowe opisane w części 1.5 i 1.6 prezentowanego dokumentu. Wiadomym jest, że pewne modyfikacje w zalecanej metodyce wytrawiania są czasem stosowane.

2 2 Jednakże nie mogą one wpływać na wynik końcowy wytrawiania. Jest kilka zasad, które muszą być bezwarunkowo spełnione w celu uwiarygodnienia metody. Są to: 1. Sprawdzalny system zbierania i identyfikacji prób. System ten musi gwarantować bezwarunkowo, że 1 gramowe lub większe indywidualne próbki tworzące zbiorową próbę zapewnią identyfikację poszczególnych indywidualnych osobników tworzących tą próbę. 2. Płyn trawiący musi być zawsze dobry jakościowo i przygotowany w sposób zapobiegający spadkowi aktywności pepsyny. Należy pamiętać, że przygotowując płyn trawiący należy zawsze dodać kwas solny do wody a dopiero potem pepsynę. Taka kolejność chroni enzym przed jego degradacją spowodowaną użyciem stężonego kwasu. Inne czynniki, takie jak pochodzenie i jakość enzymu, warunki przechowywania pepsyny, ilości używanego enzymu i kwasu, stosunek wagowy płynu trawiącego do masy wytrawianej próby, powinny odpowiadać publikowanym zaleceniom. 3. Temperatura utrzymywana w procesie wytrawiania nie powinna przekroczyć 45±2 o C. Wyższe temperatury inaktywują enzym i przez to wpływają negatywnie na skuteczność procesu wytrawiania, powodują destrukcję larw, a przez to niższą ich wykrywalność. 4. Po etapie trawienia, niewytrawiona tkanka mięśniowa powinna pozostać na sitku (jako dowód). Wytrawianie powinno być całkowite, aby mieć pewność skuteczności (wiarygodności) metody. W celu spełnienia warunku całkowitego wytrawienia można przedłużyć czas trawienia, a jeżeli to nie pomaga należy zweryfikować jakość pepsyny. 5. Proces sedymentacyjny i czas opadania larw powinny spełniać wymóg odzyskiwania jak największej liczby larw. W procedurach, zakładających 30 minutowy okres sedymentacji, jest to wystarczający parametr. Skracanie tego czasu może skutkować odzyskiwaniem mniejszej liczby larw, a w konsekwencji tego wynikami fałszywie negatywnymi. Pozyskiwanie warstwy sedymentacyjnej z lejków musi odbywać się przy całkowitym otwarciu części spustowej, zapobiegając w ten sposób recyrkulacji larw. 6. Warstwa sedymentacyjna musi być na tyle przejrzysta, aby można dostrzec larwy włośni. Standardowym testem przejrzystości jest możliwość odczytu druku gazetowego podłożonego pod dnem szalki testowej zawierającej sedyment. Przy braku przejrzystości, dostrzeżenie larw jest bardzo utrudnione, lub wręcz niemożliwe. 7. Przyrządy optyczne muszą być odpowiednie aby zapewniać powiększenie krotne. Ponadto, wymagana jest stała konserwacja sprzętu optycznego, co pozwoli mieć pewność jakości urządzenia optycznego. 8. Wytrawianie powinno być zakończone przed usunięciem lub dystrybucją tusz. Ten wymóg jest konieczny i zapobiega wprowadzenia zarażonego mięsa do obrotu handlowego. 9. Dokumentacja winna być należycie prowadzona i przechowywana w celu zapewnienia pełnej identyfikacji prób i tusz zwierzęcych.

3 Badanie poubojowe koni W związku ze zwyczajem konsumowania surowego bądź nie w pełni ugotowanego (upieczonego) mięsa końskiego oraz przypadkami zachorowań po zjedzeniu tak przygotowanych potraw z koniny, dodatkowe procedury są konieczne podczas badania tusz końskich na obecność larw włośni. ICT zaleca, w przypadku mięsa końskiego, badanie minimum 5-cio gramowych prób mięśni z języka lub m. żuchwowych przy stosowaniu metody wytrawiania zbiorczych prób. Dla mięsa przeznaczonego do spożycia w stanie surowym, zalecane jest wytrawianie nawet 10- cio gramowych prób. Przepona (crus muscle lub Crura diaphragmatica) jest alternatywnym mięśniem do badania, ale tylko wówczas gdy język bądź m. żuchwy są niedostępne. Wszystkie procedury opisane dla mięsa wieprzowego (Załącznik 1) są takie same dla koniny. Jedynym wyjątkiem jest wielkość próby jednostkowej przy zbiorczym wytrawianiu. W rejonach gdzie konina jest powszechnie spożywana badanie większych wagowo prób jest zalecane, zgodnie z procedurami opisanymi w Załączniku nr 1. ICT zaleca, we wszystkich krajach eksportujących mięso końskie, wprowadzenie lub wzmocnienie skutecznych procedur kontrolnych w ubojniach (Część 1.5 i 1.6) Badanie mięsa zwierząt łownych w ubojniach Różne gatunki zwierząt łownych mogą stanowić źródło zarażenia ludzi włośniami. ICT zaleca, aby wszystkie tuszki takich zwierząt (zarówno mięsożernych jak i wszystkożernych), które stanowią pokarm dla ludzi, były badane w kierunku obecności larw Trichinella przy użyciu właściwych metod. Do badania mięsa zwierząt łownych zaleca się, co następuje: Próby do badania mięsa dzików powinny być pobierane z mięśni kończyn przednich lub przepony. Próby do badania mięsa niedźwiedzi powinny być pobierane z przepony, mięśni żuchwowych lub języka. Próby do badania mięsa morsów i innych morskich ssaków powinny być pobierane z języka. Próby do badania mięsa krokodyla powinny być pobierane z m. żuchwowych, m. skrzydłowo-podniebiennych i mięśni międzyżebrowych. Dla w/w gatunków zwierząt, powinny być wytrawiane minimum 10-cio gramowe próby. Jeżeli z jakiś powodów nie ma możliwości przeprowadzenia badania wymienionych wyżej mięśni, inne mięśnie, ale w większej ilości, powinny zostać poddane badaniu. Zalecana jest metoda wytrawiania, która jest zgodna z metodyką opisaną dla świń (patrz Załącznik I). Należy zwrócić szczególną uwagę na skuteczność etapu wytrawiania. W przypadku

4 4 jakichkolwiek problemów należy optymalizować ten proces zgodnie z wytycznymi (patrz Część 1.1) Postępowanie po wykryciu pozytywnych prób Przy pozytywnym wyniku badania w kierunku obecności larw Trichinella należy: 1. Wszcząć procedury, które pozwolą zidentyfikować tusze zawierające włośnie. Próba wytrawiania powinna zostać powtórzona na większej ilości tkanki mięśniowej. Włośnie odzyskane z tuszek świń, koni lub zwierząt łownych powinny zostać przesłane do Krajowego Laboratorium Referencyjnego lub do Międzynarodowego Centrum Referencyjnego dla nicieni z rodzaju Trichinella, Rzym, Włochy 1, w celu dokonania identyfikacji gatunkowej włośni. 2. Tusze, w których wykryto larwy włośni powinny zostać usunięte i utylizowane zgodnie z obowiązującymi przepisami. Dla świń, szczegółowy plan działania (standardowa procedura) powinien obejmować: ustalenie pochodzenia zwierząt, u których stwierdzono włośnicę; przeprowadzenie badań epidemiologicznych i serologicznych na większą skalę; kontrolę i zmianę zabiegów hodowlanych mających na celu wyeliminowanie możliwości zarażenia w przyszłości oraz monitorowanie miejsca przez dłuższy okres czasu w celu upewnienia się, że włośnica nie występuje. W przypadku stwierdzenia włośnicy u koni, wskazane jest prześledzenie pochodzenia konia oraz przeprowadzenia badań epidemiologicznych w miejscu bytowania zwierzęcia. 3. Kraje eksportujące świnie i konie do celów konsumpcyjnych powinny mieć sprawny system identyfikacji pochodzenia zwierząt oraz środki finansowe pozwalające na przeprowadzenie badań epidemiologicznych w rejonach, w których stwierdzono występowanie włośnicy u tych zwierząt. 4. Wszystkie przypadki wykrycia larw włośni u zwierząt powinny być odnotowywane i raporty przesłane do World Organization for Animals Health/Office Internationale des Epizooties (OIE) Gwarancja wysokiej jakości metody wytrawiania ICT zaleca, aby wszystkie laboratoria przeprowadzające badania mięsa świń, innego żywca i zwierzyny łownej spełniały odpowiednie standardy jakościowe. Standardy te są niezbędne by zapewnić wysoką jakość procedur, a przez to wysoką wiarygodność otrzymywanych wyników. Audytowanie spełnia funkcje kontrolne wobec procedur oraz zapewnia prowadzenie właściwej dokumentacji. Zaleca się, aby weryfikację przeprowadzać regularnie (np. 4 razy w roku). 1 International Trichinellosis Reference Centre, Laboratory of Parasitology, Istituto Superiore di Sanita, viale Regina Elena 2999, Rome, Italy; tel: ; Fax: )

5 5 Testy powinny być przeprowadzane regularnie (2-4 razy/rok) i pod nadzorem zewnętrznej jednostki, np. Krajowego Laboratorium Referencyjnego. Próby przekazywane do testów powinny być właściwe dla stosowanej metody wytrawiania (np. 1 gramowe próbki do zbiorczej metody wytrawiania mięsa wieprzowego). W Załączniku II przedstawiono najważniejsze zasady jakościowe metody wytrawiania Testowanie (autoryzacja) metody wytrawiania ICT zaleca, aby wszystkie metody badania mięsa na obecność larw włośni, włączając wszelkie modyfikacje powszechnie stosowanych i zaakceptowanych metod, powinny być sprawdzone wobec ustalonych standardów. Wyniki takich porównań powinny być dostępne i stanowić o skuteczności metody i bezpieczeństwa dla konsumenta. Nowe metody powinny być sprawdzone przynajmniej przez trzy (3) laboratoria z dużą praktyką. Przedmiotem badań powinny być próby negatywne i pozytywne. Próby do testów powinny być przygotowane zgodnie z zasadami opisanymi przez Forbes a i wsp. (1998) 2 lub Vallee i wsp. (2007) 3. Każdy z testów, mających zapewnić konsumentowi bezpieczeństwo przed zarażeniem włośnicą, powinien wykrywać włośnie w liczbie 1 larwa na gram tkanki mięśniowej, z 95% prawdopodobieństwem Alternatywne metody badania Pośrednie (serologiczne) metody badania zwierząt w kierunku włośnicy nie są zalecane jako zastępcze metody badania zwierząt w ubojniach (wobec wytrawiania prób zbiorczych). Udoskonalenie metod pośrednich powinno być przeprowadzane w oparciu o dotychczasowe metody wytrawiania, tak, aby mieć na uwadze czułość i specyficzność metody. Metoda wytrawiania na mieszadle magnetycznym jest metodą standardową (tzw. gold standard ). Metody molekularne (PCR) są również nie do przyjęcia jako alternatywne metody badania mięsa ze względu na małą wielkość próby badanej; małe próbki od zarażonych świń mogą nie zawierać larw i otrzymany wynik może być fałszywie negatywny. ICT przedstawia wytyczne (swoje stanowisko) co do celowości stosowania serologicznych metod w badaniach epidemiologicznych, kontroli, czy też przy weryfikowaniu programów. Są one publikowane przez Gamble i wsp., i udostępnione na stronie internetowej ICT ( OIE Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals również przedstawia zalecenia dotyczące przygotowania odczynników i wykonania testu ELISA mającego wykrywać włośnicę u świń. 2 Forbes, L.B., Rajic, A. and Gajadhar, A.A Proficiency samples for quality assurance in Trichinella digestion tests. Journal of Food Protection, 61: Vallee, I., Mace, P., Forbes, L., Scandrett, B., Durand, B., Gajadhar, A. & Boireau, P Use of proficiency samples to assess diagnostic laboratories in France performing a Trichinella digestion assay. Journal of Food Protection, 70:

6 6 Część 2. Inaktywacja mięsa z włośniami Mięso, które może zawierać larwy włośni, lecz nie zostało przebadane w tym kierunku żadną z zalecanych metod, powinno zostać poddane procedurom, które prowadzą do inaktywacji larw, przed jego wprowadzeniem do konsumpcji. Dotyczy to zarówno mięsa komercyjnego, jak i pochodzącego z domowego uboju i na własne potrzeby. ICT uznaje trzy (3) sposoby przetwarzania mięsa, które pozwalają uznać je za bezpieczne dla konsumenta. Są to: gotowanie, mrożenie (dla większości gatunków włośni) oraz traktowane promieniami jonizującymi Gotowanie jako metoda inaktywacji larw włośni Dysponując odpowiednim wyposażeniem i stosując monitorowanie czasu i temperatury przedstawione w dokumencie The United States Departament of Agriculture s Code of Federal Regulations (Załącznik III), procesy gotowania są akceptowane oraz mogą być używane w celu uchronienia ludzi przed włośnicą. Przy braku właściwego sprzętu, zarówno wytwórcy jak i konsumenci mięsa powinni zwracać uwagę na kolor i strukturę mięsa podczas gotowania. Zmiana koloru z różowego na szary oraz zmiana struktury tkanki mięśniowej objawiająca się łatwością rozdzielania się włókien mięśniowych są zewnętrznymi oznakami, że mięso jest właściwie ugotowane i obecne w nim ewentualnie larwy zostały uśmiercone. (Należy jednak pamiętać, że gotowanie nie daje 100% gwarancji i zawsze jest obarczone pewnym błędem. Zmiana koloru gotowanego mięsa jest tylko bardzo ogólnym wskaźnikiem bezpieczeństwa.) 2.2. Mrożenie jako metoda inaktywacji włośni Mając do dyspozycji odpowiednie wyposażenie, stosując odpowiednie kombinacje czasotemperaturowe przedstawione w dokumentach The United States Departament of Agriculture s Code of Federal Regulations (49CF318.10), EU Commission Regulation No. 2075/2005 oraz w Załączniku IV prezentowanego opracowania, można uznać mrożenie za właściwą procedurę dla gatunków włośni wrażliwych na niskie temperatury. Nie dysponując takimi warunkami, mrożenie nie eliminuje ryzyka zarażenia się włośniami mogącymi znajdować w mięsie wieprzowym, szczególnie na tych obszarach gdzie świnie mogą mieć kontakt ze środowiskiem naturalnym, w którym występuje T. britovi. Gatunki włośni występujące w tuszach zwierzyny łownej (np. niedźwiedź, dzik) oraz u koni mogą być oporne na mrożenie w warunkach opisanych w Załączniku IV. Stąd też, mrożenie mięsa pochodzącego od tych zwierząt nie jest akceptowalną metodą. Gamble H.R., Pozio E., Bruschi F., Nöckler K., Kapel C.M.O. & Gajadhar A.A International Commission on Trichinellosis: Recommendations on the use of serological tests for the detection of Trichinella infection in Animals and Man. Parasite, 11: 3-13.

7 Promieniowanie jonizujące jako metoda inaktywacji larw włośni ICT uznaje promieniowanie jonizujące, na poziomie (0,3 kgy) 5 za wystarczające do inaktywacji larw włośni w mięsie przeznaczonym do celów konsumpcyjnych w tych krajach, gdzie ta forma inaktywacji jest prawnie dozwolona. Napromieniowanie jest dozwolone tylko dla żywności foliowanej Konserwowanie jako metoda inaktywacji larw włośni Konserwowanie i wędzenie mięsa wieprzowego, koniny oraz zwierząt łownych nie są metodami zalecanymi przez ICT. W pewnych kombinacjach procesów solenia, temperaturowego oddziaływania oraz suszenia mogą one inaktywować larwy włośni, lecz ich skuteczność jest trudna do oceny. ICT zaleca, aby procesy te stosować na mięsie przebadanym przez odpowiednie służby i poświadczonym, że jest wolne od włośni Edukacja konsumenta We wszystkich rejonach, gdzie badanie mięsa na obecność włośni nie jest stosowane i prawnie regulowane, konsumenci powinni być poinformowani przez odpowiednie służby opieki zdrowotnej o niebezpieczeństwie spożywania i sposobach bezpiecznego przygotowania potraw z takiego mięsa. Te sposoby to: gotowanie do temperatury wewnątrz mięsa, co najmniej 71 0 C (160 0 F) głębokie mrożenie (-15 0 C lub mniej) przez 20 dni (kawałki mięsa do 15 cm grubości) i 30 dni (kawałki mięsa o grubości do 69 cm) 6. Sposoby przygotowania potraw mięsnych poprzez: gotowanie przy pomocy kuchenki mikrofalowej konserwowanie, suszenie i wędzenie, nie są uważane za w pełni bezpieczne. Wszystkie wymienione wyżej zalecenia dotyczą nie tylko zwykłych konsumentów, lecz i ludzi parających się myślistwem. Szczególną uwagę należy zwrócić na obecność w danym rejonie gatunków włośni opornych na inaktywujące działanie niskich temperatur. ITC przestrzega przed konsumowaniem potraw przyrządzonych z surowego mięsa wieprzowego, koniny czy też zwierząt łownych. 5 U.S. Code of Federal Regulations (1997). Irradiation in the Production, Processing and Handling of Food, 21 CFR Part W rejonach gdzie występują gatunki włośni oporne na niskie temperatury, konsumenci powinni być informowani o nieskuteczności procesu mrożenia mięsa i grożącym niebezpieczeństwie.

8 8 Część 3. Kontrola na fermach Zarażanie się włośniami zwierząt hodowlanych jest związane głównie ze skarmianiem tych zwierząt surowymi odpadami poubojowymi lub nawet całymi tuszami oraz przez kontakt z zarażonymi gryzoniami lub zwierzętami wolno żyjącymi. Nowoczesne metody hodowli trzody chlewnej redukują znacząco lub wręcz całkowicie eliminują ryzyko zarażenia włośniami zwierząt hodowlanych, co praktycznie eliminuje konieczność badania mięsa takich zwierząt. To są wręcz podstawowe wymagania, aby skutecznie wyeliminować ryzyko zarażenia i być pewnym, że tak chowane zwierzęta są wolne od włośni. Wymagania te przedstawione są poniżej: Świnie wymogi hodowlane do produkcji wieprzowiny wolnej od włośni Architektoniczne i środowiskowe bariery * Świnie powinny być hodowane w budowlach, których konstrukcja uniemożliwia ich penetrację przez gryzonie, inne ssaki i duże ptaki mięsożerne. Otwory w budowlach hodowlanych, takie jak otwory wentylacyjne czy wodociągowe, powinny być zabezpieczone siatkami o średnicy oczek nie większej niż 1 cm. Przestrzeń do 100 m od budowli hodowlanych powinna być wolna od składowania odpadów, gruzowisk i innych kryjówek gryzoni. Dwumetrowa przestrzeń wokół budynków hodowlanych winna być wyłożona żwirem lub obsiana roślinnością nieprzekraczającą 10 cm wysokości. Pasza i magazyny paszowe Pasza powinna być składowana w zamkniętych silosach aby uniemożliwić dostęp gryzoniom. Pasza powinna pochodzić od wytwórców gwarantujących odpowiedni standard (patrz Regulation [EC] No. 183/2005 EU). Odpady pokarmowe, zawierające mięsne składniki powinny być gotowane zgodnie z przepisami prawa, tak, aby larwy włośni były inaktywowane. Zwalczanie gryzoni Udokumentowany program zwalczania gryzoni, przy użyciu skutecznych środków chemicznych, powinien być wprowadzony i stosowany (Załącznik III). Ślady obecności gryzoni (nory, tropy, odchody) nie powinny być stwierdzane na terenie fermy (opinia specjalisty).

9 9 Higiena na fermie hodowlanej Tusze padłych zwierząt powinny być usunięte z fermy w ciągu 24 godzin zgodnie z obowiązującymi przepisami sanitarnymi. W odległości nie mniejszej niż 2 km od fermy hodowlanej nie powinno być składowisk odpadów zwierzęcych. Nowe zwierzęta Sprowadzane nowe zwierzęta powinny pochodzić z farm wolnych od włośnicy lub bardzo młode do 6 tygodnia życia (karmione mlekiem matki). Nowe zwierzęta, pochodzące z ferm bez certyfikatu wolne od włośnicy, powinny przejść kwarantannę i zostać przebadane serologicznie na obecność przeciwciał przeciw Trichinella po czterech tygodniach od ich wprowadzenia. Badanie serologiczne powinno zostać przeprowadzone zgodnie wytycznymi zawartymi w części 1.7. Identyfikacja zwierząt Wszystkie zwierzęta powinny być tak oznaczone aby można było prześledzić drogę ich pochodzenia Zaświadczenie o hodowli świń wolnych od włośni Programy, umożliwiające produkcję trzody chlewnej wolnej od włośni, bazujące na bardzo dobrym systemie hodowli zwierząt pozwalającym wyeliminować ryzyko zarażenia, powinny być administracyjnie wprowadzane łącznie z wydawaniem stosownego certyfikatu. Zarządzanie powinno spełniać następujące cele: Doskonalenie systemu wewnętrznego obiegu dokumentacji praktyk prowadzących do produkcji trzody wolnej od włośni (wymienionych w części 3.1.1). Wydawanie certyfikatów i prowadzenie wykazu tychże farm. Okresowe przeprowadzanie audytu dla producentów z certyfikatami w celu ujednolicenia systemu. Okresowe przeprowadzanie testów serologicznych dla świń pochodzących z farm wolnych od włośni w celu potwierdzenia nieobecności włośnicy, bądź kontroli zagrożenia wynikającego z występowania włośnicy u wolno żyjących zwierząt. Przykłady takich programów, można znaleźć w dokumentach: Commission Regulation (EC) No 2075/2005 of the EU oraz the National Trichinae Certification program Standards of the U.S. Department of Agriculture (

10 10 Wszystkie świnie hodowane na fermach bez certyfikatu wolne od włośni powinny być badane w kierunku obecności włośni zgodnie z metodyką opisaną w Części Wymagania przy hodowli koni (mięsa wolnego od włośni) Przy braku udokumentowanej wiedzy nt. dróg transmisji włośni do koni oraz w związku ze specyfiką hodowli koni, w stadninach nie ma możliwości zabezpieczenia tych zwierząt przed zarażeniem. ICT zaleca, aby badania epidemiologiczne były prowadzone w krajach skąd pochodzą konie do celów konsumpcyjnych, szczególnie na obszarach wysoce endemicznych dla włośni. Wszystkie konie, których mięso przeznaczone jest do konsumpcji, powinny zostać badane na obecność włośni zgodnie z metodyką opisaną w Części 1.2. Część 4 - Regionalne strefy wolne od włośni u świń ICT nie popiera żadnych programów (np. OIE Terrestrial Animal Health Code, Article ) gwarantujących, że świnie są wolne od włośni tylko na podstawie systemu chowu na określonym obszarze, regionie bądź kraju. ICT uwzględnia istnienie ferm wolnych od włośni i uchylenie dla nich obowiązku badania mięsa w kierunku obecności włośnicy. Część 5 - Zalecenia legislacyjne ICT uważa, że wszystkie kraje powinny stosować przepisy legislacyjne bezwzględnie zabraniające na nielegalne rozprowadzanie mięsa (od świń, koni i zwierzyny łownej), które zawiera larwy włośni. Myśliwi powinni wiedzieć i być odpowiedzialni za bezpieczeństwo ludzi rozprowadzając mięso z upolowanych przez siebie zwierząt. Mięso takie, przekraczając granice państwowe powinno być poddane badaniom aby mieć pewność, że jest wolne od włośni. ICT zaleca, aby inwazje włośnicowe u zwierząt hodowlanych i wolno żyjących, które mogą być produktami konsumpcyjnymi dla człowieka, były ewidencjonowane w kraju przez odpowiednie do tego celu instytucje, a raporty roczne kierowane do OIE. ICT zaleca również aby wszelki przypadki włośnicy u ludzi były obowiązkowo zgłaszane w kraju w stosownych instytucjach zdrowia publicznego. ICT zaleca, aby system identyfikacyjny zwierząt lub rejestr świń i koni był prowadzony w każdym kraju. Ten system identyfikacji i rejestracji powinien pozwolić na niezawodną identyfikację miejsca bytowania zwierząt oraz ułatwiać badania epidemiologiczne i wprowadzanie przedsięwzięć zapobiegawczych. Szczególną uwagę należy zwrócić na zwierzęta w obrocie zagranicznym.

11 11 Załączniki Załącznik I Metoda wytrawiania próby zbiorczej na obecność larw nicieni z rodzaju Trichinella Załącznik II Składowe programu gwarantującego wysoką jakość metod diagnostycznych Załącznik III - Metody inaktywacji larw nicieni z rodzaju Trichinella w mięsie wieprzowym przez czynnik cieplny Załącznik IV - Inaktywacja larw nicieni z rodzaju Trichinella przez komercyjne mrożenie mięsa wieprzowego

12 12 Załącznik I. Metoda wytrawiania próby zbiorczej na obecność larw nicieni z rodzaju Trichinella 1. Wprowadzenie W procesie wytrawiania tkanki mięśniowej w sztucznym płynie trawiącym uwalniane są żywe larwy włośni z torebek mięśniowych. W literaturze zostały opisane różne metody wytrawiania (patrz wykaz literatury na końcu tego załącznika). Każda metoda pozwalająca wykryć larwy w badanym mięsie powinna być sprawdzona na próbach pozytywnych i negatywnych, a potem kontrolowana okresowo zgodnie z zaleceniami przedstawionymi w Załączniku II. 2. Pobieranie prób do badania Próby do badania powinny być pobierane z miejsc predylekcyjnych dla danego gatunku zwierzęcia (Tabela 1). Jeżeli miejsca predylekcyjne dla jakiegoś gatunku są nieznane zalecane jest pobieranie prób z języka i przepony. Tabela 1. Miejsca predylekcyjne w zależności od gatunku zwierzęcia Gatunek Miejsca Ciężar próby badanej Referencyjne źródło predylekcyjne Świnia Przepona, język, m. 1-2 g Olsen i WSP., 1964 żuchwy (żwacz) Koń Przepona, język, m. >5 g Soule i WSP., 1989 żuchwy Dzik Przepona, m. żuchwy, 5 g Kapel, 2001 język, m. międzyżebrowe Dzikie mięsożerne Mięśnie kończyn 10 g Kapel, 1993 Niedźwiedź Przepona, m. żuchwy, 10 g język Morskie ssaki (foka, Przepona, m. żuchwy, 10 g Kapel i wsp., 2003 mors język Krokodyl M. żuchwy, m. skrzydłowopodniebienne 10 g Pozio i wsp., 2004 Do badania powinny być pobierane próby, których wielkość zapewni wysoki poziom wykrywalności; pojedyncze próby do 100 g od jednego osobnika lub zbiorcze od wielu osobników, łącznie też do 100 g tkanki mięsnej. Czułość metody powinna zapewnić wykrycie w jedno gramowych próbach od 3 larw w 1 gramie tuszy; w trzygramowych próbach od 1,5 larwy w 1 gramie tuszy; w pięciogramowych próbach od 1 larwy w 1 gramie tuszy. Dla zdrowia ludzi, badanie jednogramowych prób z tusz świńskich (przepona lub język) jest skuteczną metodą

13 13 pozwalającą na zredukowanie występowania tej groźnej zoonozy u ludzi w wielu krajach. Wszędzie tam, gdzie mięso nie jest poddawane obróbce cieplnej a jest spożywane w stanie surowym zalecane jest zwiększenie wielkości próby do 5 gramów. 3. Przygotowanie próby do badania Skrawki tkanki mięśniowej nie powinny zawierać tłuszczu i powięzi, ponieważ nie są one wytrawialne i nie zawierają larw włośni. Tak przygotowane skrawki winny być poddane procesowi miksowania, mielenia lub maceracji, który wspomaga proces trawienia (metoda samego rozdrabniania pozostaje sprawą indywidualnego wyboru). W celu przygotowania próby przez miksowanie należy zmieszać do 100 g tkanki z równą objętością wody z kranu i zmiksować (5-10 sekund) w mikserze typu Waring lub podobnym (np. Retsch Grindomix GM 200). Zbyt krótkie miksowanie może skutkować brakiem efektu pełnego wytrawienia, z kolei zbyt długie może zniszczyć larwy włośni. Zalecane jest rozdrabnianie prób zbiorczych i indywidualnych w malakserze, aż do uzyskania jednolitej masy. Stosowanie maszynek do mielenia mięsa jest dopuszczalne, trzeba jednakże pamiętać, aby oczka sitka nie przekraczały 3 mm średnicy. 4. Wytrawianie prób Każda ze 100 g prób powinna być wytrawiana w objętości 2-3 litrów kwaśnego płynu trawiącego, przy użyciu wystandaryzowanej metody. Stosunek 1:30 tkanki mięśniowej do objętości płynu trawiącego jest właściwym do osiągnięcia szybkiego i całkowitego wytrawienia próby. Wszystkie części malaksera lub maszynki do mielenia mięsa powinny zostać starannie przepłukane po mieleniu podgrzaną (45 ± 2 0 C) i zakwaszoną (0,5-1,0% HCl lub 0.06N) wodą wodociągową, które po uzupełnieniu do 2-3 litrów, będą stanowić objętość wytrawianej próby. Pepsyna (stężenie 1:10,000 wg NSF) powinna zostać dodana do przygotowanej zakwaszonej wody tak aby stosunek wagowo/objętościowy stanowił 0,5-1,0 %. W przypadku rozdrabniania przy użyciu malaksera, odpowiednia ilość pepsyny powinna zostać dodana na etapie maceracji tkanki mięsnej a następnie całość przepłukana i przeniesiona do 3-4 litrowej zlewki z zakwaszoną wodą (o objętości jak wyżej). Do wytrawiania prób (zawieszonych w 2-3 litrach objętości) używamy 3-4 litrowych zlewek zakrytych folią aluminiową, która zabezpiecza przed rozpryskaniem płynu podczas intensywnego mieszania na mieszadle magnetycznym (magnesy o długości 8-10 cm) lub na innym urządzeniu mieszającym, przez minimum 30 minut (czasami dłuższy czas jest wymagany by trawienie było całkowite). Temperatura płynu trawiącego powinna wynosić 45 ± 2 0 C i być kontrolowana przez cały czas tego etapu. Wytrawianie w łaźni wodnej, inkubatorze czy pomieszczeniach, w których istnieje

14 14 możliwość kontroli tego parametru, jest dopuszczalne i wskazane. Wytrawianie jest zakończone, gdy w płynie trawiącym nie widać nawet najmniejszych kawałków tkanki mięśniowej. 5. Odzyskiwanie larw Po wytrawianiu, płyn jest przelewany ze zlewki przez sito (średnica oczek µm) do rozdzielacza sedymentacyjnego o objętości 2-4 L z plastikowym lejkiem i pozostawiamy na 30 minut. Zlewka i sito powinny zostać przepłukane podgrzaną dodatkową objętością wody (min. 100 ml). Stałe fragmenty tkanki mięśniowej nie powinny być widoczne na sicie. Jeżeli są, powinny zostać wytrawione ponownie. Po 30 minutach sedymentacji w rozdzielaczu, szybko spuszczamy około 40 ml płynu wraz z osadem do 50 ml probówki (kalibrowanego cylindra), i pozostawiamy na kolejne 10 minut. Po tym czasie ok. 40 ml (supernatant) należy odciągnąć i do pozostałej reszty (ok. 10 ml) należy dolać ciepłej wody do objętości ok. 40 ml. Czynność powtarzamy aż do otrzymania klarownej próby. Inne sposoby oczyszczania płynu są wskazane, jednakże trzeba mieć na uwadze, aby samo spuszczanie było przy pełnym otwarciu końcowego otworu i w miarę szybkie. Częściowe otwarcie prowadzi do cyrkulacji larw włośni w lejku. Końcowe 10 ml klarownego przesączu należy poddać oglądowi pod mikroskopem. 6. Liczenie larw W celu policzenia larw, klarowny przesącz wylany na szalkę Petriego, powinien być przeglądany pod mikroskopem (15-40X powiększenie). Płyn powinien być na tyle przeźroczysty by podłożony druk gazetowy był łatwo odczytywalny. Przy braku tego wymogu proces oczyszczania i sedymentacji powinien być powtórzony. Gdy larwy są znajdowane w metodzie wytrawiania próby zbiorczej, procedury należy powtórzyć na mniejszych liczbowo próbach zbiorczych aż do stwierdzenia zarażonej tuszy. 7. Literatura Commission Regulation (EC) no 2075/2005. Official Journal of the European Union, Vol. 338: Gajdahar, A.A., Forbes, L.B., Rajic, A. (1996). The double separatory funnel procedure for the detection of Trichinella larvae in pork. Official Protocol, Agriculture and Agri-Food Canada, Version 1.0, November 14, 1996, 18 pp. Gamble, H.R. (1998) Trichinellosis. In, OIE Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines, Chapter 3.5.3, pp Kapel, C.M.O Predilection sites of Trichinella spiralis muscle larvae in experimentally infected foxes (Alopex lagopus, Vulpes vulpes). Biologija (No.1).

15 15 Kapel, C.M.O Sylvatic and domestic Trichinella spp. In wild boars: infectivity, muscle larvae distribution, and antibody response. Journal of Parasitology 87: Kapel, C.M.O., Measures, L., Moller, L.N., Forbes, L., Gajadhar, A Experimental Trichinella infection in seals. International Journal of Parasitology 33: Pozio, E., Owen, I,L., Marucci, G., La Rosa, G Trichinella papuae in saltwater crocodiles (Crocodylus porosus) of Papua New Guinea. Emerging Infectious Diseases 10: Soule, C., Dupouy-Camet, J., Georges, P., Ancelle, T., Gillet, J.P., Vaissaire, J., Delvigne, A., Plateau, E Experimental trichinellosis in horses: Biological and parasitological evaluation. Veterinary Parasitology 31: Veterinary Code of the USSR: Provisions, Guidelines, Instructions, Directions and Rules on Veterinary Matters, Tret Yakov, A.D., ed., Vol. II, Kolos (Publisher), Moscow, 1972.

16 16 Załącznik II. Składowe programu gwarantującego wysoką jakość metod diagnostycznych 1. Wprowadzenie Duża dokładność mikrobiologicznych testów wynika z ich wysokiej czułości i specyficzności, stąd też ich wiarygodność. Tylko takie metody i procedury diagnostyczne, tj. zdefiniowane i zapewniające wysoką powtarzalność oraz wykonywane przez kompetentny personel, powinny być stosowane. ISO/IEC określa te standardy, które powinny być wykorzystane podczas tworzenia programu badania w kierunku larw Trichinella (patrz Gajadhar and Forbes, 2002). ISO/IEC został wykorzystany przy opracowaniu jakościowych standardów dla pracowni/laboratoriów kontrolujących mięso na obecność larw włośni z rodzaju Trichinella: 2. Wademekum programu jakości System jakościowy bazujący na ISO lub podobnym dokumencie o międzynarodowym uznaniu jest wymagany aby zapewnić wykonanie badania wg wysokiego standardu jakościowego przez wykwalifikowany personel w celu osiągnięcia wiarygodnych i powtarzalnych wyników. Taki program/instrukcja powinien opisywać z detalami samą metodę, organizacyjną strukturę pracowni/laboratorium, stopień przeszkolenia pracowników, rodzaje testów kontrolnych, określony sposób ewidencji odstępstw od instrukcji, jasne kryteria sprawdzające dla wykwalifikowanego personelu, prowadzenie bazy wyników, prowadzenie wykazu błędów i zastosowanych akcji zaradczych, pełną dokumentację i system kontroli rewizyjnej. Inne ważne parametry takiego programu to określenie sposobu pobierania prób do badania w rzeźni, identyfikacja prób i badanych zwierząt, bezbłędny sposób identyfikacji wstecznej osobnika, u którego w tuszy stwierdzono larwy włośni, sposób usuwania i likwidacji zarażonej tuszy. 3. Właściwe wyposażenie laboratorium Pracownia/laboratorium (BSL-2), w którym prowadzone są badania powinno być wyposażone w niezbędny sprzęt zapewniający pełne bezpieczeństwo zatrudnionym tam pracownikom. Powinno być to wydzielone klimatyzowane pomieszczenie ze specjalistyczną aparaturą i oprzyrządowaniem, właściwym oświetleniem, dopływem wody ciepłej i zimnej, armaturą do mycia używanych naczyń szklanych i sprzętu. Pracownicy powinni posiadać niezbędny sprzęt BHP (rękawiczki, okulary, fartuchy ochronne itp.), dostęp do natrysków, apteczki pierwszej pomocy itp. 4. Procedury kontrolne Wyniki uzyskiwane w testach beta (druga próba równo cenna pierwszej) świadczą o dokładności metody. Czułość i specyficzność każdej metody powinna być znana i oszacowana na podstawie stosownego badania (w tym statystycznego) na materiale pozyskanym od zwierząt zarażonych i niezarażonych. Tylko tak sprawdzone i opracowane metody powinny być 7 Gajadhar, A,A., Forbes, L.B An internationally recognized quality assurance system for diagnostic parasitology in animal health and food safety, with example data on trichinellosis. Veterinary Parasitology 103:

17 17 stosowane, a każda nowa metoda powinna być jeszcze raz opracowana w oparciu o sprawdzoną i akceptowaną metodę. Czułość i powtarzalność metody muszą być jasno określone i precyzyjnie zdefiniowane. 5. Wzorcowy protokół Właściwe szkolenie i jasno opisana metoda postępowania (instrukcja) są niezbędne i zapewniają właściwe i powtarzalne wyniki w każdym laboratorium stosującym daną metodę. Protokół/instrukcja powinien być napisany jasno i przedstawiać z detalami każdy etap procedury z pełnym zabezpieczeniem aparaturowo-odczynnikowym. Realizacja procedury powinna pozostawać w pełnej zgodności z instrukcją i zawierać punkty krytyczne (CCPs), tj. takie sytuacje, które mogą wywierać wpływ na uzyskiwane wyniki. Wszelkie zmiany wprowadzane do instrukcji, powinny być właściwie udokumentowane, poddane testom sprawdzającym (z testami statycznymi włącznie). 6. Szkolenie i ocena personelu Szkolenie personelu oraz jasno opisane zasady postępowania są niezbędne aby zapewnić uzyskanie właściwych oraz powtarzalnych wyników w każdym laboratorium stosującym daną metodę. Udokumentowany program szkolenia powinien być dostępny w miejscu pracy. Powinien on obejmować wszystkie możliwe aspekty dotyczące stosowanej metodyki badania. Szkolenie powinno być wszechstronne i prowadzone przez wykwalifikowaną osobę (np. z Krajowego Referencyjnego Laboratorium) a osoby szkolone powinny wykazać swoją kompetencję zdając pisemny egzamin i wykazać swoje praktyczne umiejętności w wykonaniu samego badania nieznanej próby w miejscu szkolenia oraz w miejscu pracy. 7. Programy kontrolne dla personelu/laboratorium W celu wykazania swoich umiejętności, pracownicy z certyfikatami, dwa razy do roku, powinni zostać poddani testom kontrolnym na odpowiednio przygotowanym materiale przez Krajowe Referencyjne Laboratorium lub materiale przesłanym od innych jednostek biorących udział w szkoleniach (wymiana prób). Jedna instrukcja powinna być stosowana we wszystkich jednostkach. Osoby/laboratoria, które zaliczą testy utrzymują nadal swoje certyfikaty. Nie zaliczenie testów wymaga ponownego zdawania egzaminu, a w przypadku oceny negatywnej takiej osobie/laboratorium odbierany jest certyfikat.

18 18 Załącznik III. Metody inaktywacji larw włośni w mięsie wieprzowym przez czynnik cieplny (i) Wszystkie części tusz wieprzowych powinny być poddawane działaniu czynnika cieplnego zgodnie z wymogami przedstawionymi w tabeli poniżej: Minimalna temperatura we wnętrzu Minimalny czas Stopnie Celsjusza Stopnie Fahrenheita godz godz godz godz godz min min min min min min min kilka sekund (ii) Czas i temperatura powinny być kontrolowane przez właściwie skalibrowane przyrządy pomiarowe. (iii) Wzrost temperatury od 60 0 F (15,5 0 C) do F (49 0 C) nie powinien przekraczać 2 godzin, chyba, że mięso jest poddawane procesowi wędzenia lub zakwaszania. (iv) Czas, w zakresie temperatur F (58,9-59,5 0 C), nie musi być kontrolowany pod warunkiem, że produkty mięsne nie przekraczają 5,1 cm grubości (2 cale) a proces chłodzenia nie rozpoczyna się wcześniej niż 5 minut od chwili osiągnięcia temperatury 58,9 0 C (138 0 F). (v) Wytwórca powinien stosować takie procedury, które gwarantują właściwe ogrzewanie całego produktu. Jest niezmiernie ważne, aby każda część kiełbasy, każda szynka i inne produkty poddawane obróbce cieplnej w wodzie były w niej całkowicie zanurzone przez cały okres stosowanej procedury.

19 19 Załącznik IV. Inaktywacja larw nicieni z rodzaju Trichinella przez komercyjne mrożenie mięsa wieprzowego Na każdym etapie przygotowań i po wstępnym schłodzeniu do temperatury nie wyższej niż 40 0 F (4 0 C) lub wstępnym zamrożeniu, wszystkie części tkanki mięśniowej świń i jej przetwory, powinny być poddane ciągłemu działaniu niskich temperatur przedstawionych w Tabeli 1. Okres przetrzymywania produktów mięsnych w określonych temperaturach zależy od grubości kawałków przetrzymywanego mięsa oraz rozmiarów pojemników zawierających produkty mięsne. Tabela 1 - Wymagany okres mrożenia w niskich temperaturach Temperatura 0 F ( 0 C) Grupa 1 (dni) Grupa 2 (dni) 5 (-15.0) (-23.3) (-28.9) 6 12 (i) Do grupy 1 zaliczane są produkty w oddzielnych dużych kawałkach, których grubość nie przekracza ok. 15 cm (6 cali), jak również odległości między poziomami regałów i krat (a także opakowań) do składowania produktów nie przekraczają tej wartości. (ii) Do grupy 2 zaliczane są produkty w dużych kawałkach, warstwach lub opakowaniach, których grubość przekracza 15 cm (6 cali) a nie przekracza 68 cm (27 cali). Ta ostatnia wartość dotyczy również wysokości pojemników/kontenerów. (iii) Mięso, jak i jego przetwory w opakowaniach, poddawane obróbce termicznej (mrożenie) powinno być tak składowane, aby była zapewniona cyrkulacja powietrza pomiędzy kawałkami, bryłami, warstwami, puszkami, beczkami i poziomami składowanego mięsa, w celu zapewnienia właściwej (zadanej) temperatury mrożenia. 8 Komercyjne mrożenie mięsa wieprzowego lub jego produktów nie jest właściwe do inaktywacji włośnia T. britovi, który jest oporny na mrożenie. Skądinąd wiemy, że ten gatunek wykazuje niską inwazyjność u świni domowej i stąd wynika jego małe zagrożenie dla ludzi (Pozio, E., Kapel, C.M.O., Gajadhar, A.A., Boireau, P., Dupouy-Camet, J., Gamble, H.R Trichinella in pork: current knowledge on the suitability of freezing as a public health measure. Eurosurveillance, 11: ).

20 20 Tabela 2 - Alternatywne okresy mrożenia w niskich temperaturach Minimalna temperatura we wnętrzu Minimalny czas Stopnie Fahrenheita Stopnie Celsjusza godz godz godz godz godz godz godz ½ godz. (iii) Zamiast warunków opisanych w Tabeli 1, może być stosowane komercyjne suszenie sublimacyjne (liofilizacja) lub kontrolowane zamrażanie z pomiarem temperatury w środku tuszy, zgodnie z zasadami opisanymi w Tabeli 2. (iv) Pomieszczenia lub inne przestrzenie zamknięte, w których składowane są produkty mięsne podlegające mrożeniu, powinny być wyposażone w sprawne termometry umieszczone na lub powyżej najwyższego poziomu składowania i z dala od wytwornic niskiej temperatury.