Badania mikrobiologiczne osadu jako narzędzie oceny efektywności procesu denitryfikacji

Transkrypt

1 Badania mikrobiologiczne osadu jako narzędzie oceny efektywności procesu denitryfikacji dr Katarzyna Jankowska dr inŝ. Aneta Łuczkiewicz dr inŝ. Eliza Kulbat mgr inŝ. Sylwia Fudala - KsiąŜek Osad czynny zasiedlają: - bakterie heterotroficzne - podstawowe rodzaje: Zooglea, Flavobacterium, Alcaligens, Bacillus, Achromobacter, Corynebacterium, Comomonas, Brevibacterium i Actinobacter - bakterie autotroficzne - bakterie nitryfikacyjne (Nitrosomonas, Nitrospira) - bakterie fotoautotroficzne - purpurowe bakterie niesiarkowe (Rhodospirllaceae), purpurowych i zielonych bakterii siarkowych - osiadłe i swobodnie pływające pierwotniaki, wrotki, nicienie, larwy owadów i pajęczaków. Ogólna liczba bakterii w osadzie szacowana jest od 1.6 x10 9 /cm 3 do 2.4 x10 10 /cm 3 (Limpiyakorn i wsp.2004) Po zastosowaniu po technik niehodowlanych z wykorzystaniem barwników epifluorescencyjnych liczba bakterii w kłaczkach osadu szacowana jest na do 1-10 x /g z czego 80 % to komórki aktywne Frakcja mikroorganizmów stanowi 5-20 % kłaczka reszta to substancje koloidalne

2 Mikroorganizmy osadu czynnego zdolne są do utleniania materii organicznej i transformacji substratów pokarmowych a takŝe produkują polisacharydy i inne polimery, które wspomagają flokulacje biomasy mikroorganizmów. Jako układ ekologiczny osad czynny charakteryzuje się zaleŝnościami troficznymi typowymi dla łańcucha dertrytusowego Techniki tradycyjne (obserwacje w mikroskopie jasnego pola i techniki hodowlane) pozwoliły na opracowanie modelowego zespołu mikroorganizmów. Jednak ten opis okazał się nie adekwatny do dynamiki metabolizmu zespołu mikroorganizmów występujących oczyszczalniach Laboratorium Biotechnologii Środowiska Pracownia Mikrobiologiczna Phoenix System (BD Biosciences, USA), biochemiczna identyfikacja i ocena antybiotykoopornośći szczepów bakteryjnych

3 Laboratorium Biotechnologii Środowiska Pracownia Mikrobiologiczna metody mikroskopowe

4 Barwienie metodą Grama

5 Barwienie metodą Neissera - odróŝnienie bakterii poli-p Efektywność biologicznego oczyszczania ścieków zaleŝy od składu zespołu mikroorganizmów oraz od jego aktywności. Stosowane tradycyjne metody hodowli w warunkach laboratoryjnych pozwalały na identyfikacje do 15 % wszystkich mikroorganizmów wchodzących w skład tej biocenozy. Wprowadzenie w latach 90-tych technik molekularnych umoŝliwiło prawdopodobne określenie składu oraz dynamiki metabolicznej zespołu mikroorganizmów, występujących w reaktorach oczyszczających ścieki oraz określenie kluczowej roli dominantów prowadzących róŝne typy procesów metabolicznych Znajomość ekologii zespołu mikroorganizmów jest konieczna do wyjaśnienia czynników wpływających na efektywność i stabilność biocenozy biologicznej oczyszczalni ścieków oraz do rozwoju strategii umoŝliwiających właściwe wykorzystanie procesów

6 Prowadzono badania porównawcze z zastosowaniem sond oligonykleotydowych, komplementarnych do wybranych regionów 16S i 23S rrna oraz składu hodowlanego uzyskanego poprzez izolacje 255 izolatów osadu czynnego rosnących na podłoŝach zestalonych agarem Badania wykazały zupełnie odmienną dominacje grup bakterii w zaleŝności od zastosowanej techniki Wagner M. and Loy A., Current Opinion in Biotechnology, 2002, 13: Zastosowanie techniki hodowlanej wskazywało na dominacje bakterii naleŝących do Gama Proteobacteria, stosunkowo rzadko izolowano bakterie naleŝące do Beta Proteobacteria (Acidovorax, Alicaligenes i Comomonas), pojedyncze izolaty z grupy Gramdodatnich o wysokim udziale par G+C w DNA naleŝały do Arthrobacter, Microbacterium i Mycobacterium. Analiza z zastosowaniem technik molekularnych wykazała Ŝe in situ w osadzie dominowały bakterie naleŝące do Beta Proteobacteria oraz grupy Gramdodatnich o wysokim udziale par G+C Wagner M. and Loy A., Current Opinion in Biotechnology, 2002, 13: W pracach prowadzonych w ciągu ostatnich piętnastu latach w oczyszczalniach róŝnego typu wskazano Ŝe większości bioreaktorów przewaŝają bakterie z pod typu Beta- Proteobacteria (ponad 50% wszystkich klonów), Obok nich licznie reprezentowane są bakterie zaleŝące do typów Bacterioidetes, Chloroflexi oraz Planctomycetes. W reaktorach ze zwiększonym biologicznym usuwaniem fosforu dominują grupy bakterii Gramdodatnich o wysokim udziale par G+C, wskazując na ich role w usuwaniu fosforu. Wagner M. and Loy A., Current Opinion in Biotechnology, 2002, 13:

7 Określenie liczebności i biomasy komórek bakteryjnych barwienie DAPI (4',6-diamidyno-2-fenyloindol) Barwienie DAPI (4',6-diamidyno-2-fenyloindol)

8 Określenie aktywności metabolicznej komórek bakteryjnych barwienie BacLight viability kit staining (Live/Dead -L/D)) Określenie aktywności metabolicznej komórek bakteryjnych Określenie aktywności metabolicznej komórek bakteryjnych

9 Barwienie DAPI (4',6-diamidyno-2-fenyloindol) Określenie aktywności metabolicznej komórek bakteryjnych Określenie aktywności metabolicznej komórek bakteryjnych

10 Określenie aktywności metabolicznej komórek bakteryjnych Określenie aktywności metabolicznej komórek bakteryjnych Quantification of uncultured microorganisms by fluorescence microscopy and digital image analysis Daims H. & Wagner M., Appl Microbiol Biotechnol, 2007

11 Barwienie cząstek wirusowych (Sybr Gold II) Zastosowanie technik biologii molekularnej pozwala na uzyskanie informacji w następujących etapach badań: 1) ekstrakcja kwasów nukleinowych osadu czynnego 2) amplifikacja genów 16S rdna za pomocą PCR 3) konstrukcja biblioteki ryboklonów 4) sekwencjonowanie ryboklonów 5) identyfikacja sekwencji z wykorzystaniem sekwencji banku genów. Dodatkowo zastosowanie techniki hybrydyzacji in situ FISH pozwala na ilościowe określenie mikroorganizmów dominujących w osadzie.

12 Fluorescencyjna hybrydyzacja In situ (FISH) - technika cytogenetyczną, słuŝąca do wykrywania określonej sekwencji DNA za pomocą fluorescencyjnych sond DNA. W celu analizy badanego materiału konieczne jest uŝycie mikroskopii fluorescencyjnej. - fragment RNA znakowany fluorescencyjnie (sonda oligonukleotydowa) nanoszony jest na preparat i podawany jest krótkotrwałej denaturacji w podwyŝszonej temperaturze, a następnie kilkugodzinnej hybrydyzacji. - kolejnym etapem jest usunięcie nadmiaru niezhybrydyzowanej sondy przez kilkukrotne odpłukanie preparatu - następnie barwi się wszystkie komórki bakteryjne (barwnik DAPI). Popularnymi znacznikami fluorescencyjnymi, uŝywanymi do znakowania sond są rodamina i fluoresceina, a takŝe kumaryna. Amann R. i wsp. Max Planck Institute for Marine, Microbiology, Bremen Barwienie DAPI (4',6-diamidyno-2-fenyloindol)

13 Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ - FISH AOB bakterie utleniające amoniak do azotynów AOB - N so1225 NOB bakterie utleniające azotyny do azotanów NOB - N tspa dni 49 dni 83 dni Zmiana struktury populacji bakterii w reaktorze typu chemostat bakterie redukujące azotyny do azotanów NOB Nitrospira sonda znakowana karbocjaniną Ntspa712 (czerwony), Nitrobacter sonda znakowana fluoresceiną Nit3 (zielony). Nogueira R., Melo L.F., Biot.Bioeng., 2006, v95.n1.s.170 Prowadzono badania związane z identyfikacją bakterii metodą FISH oraz określano właściwości fizjologiczne bakterii osadu czynnego śledząc: - zuŝycie substratów (z izotopami) - gromadzenie substancji wewnątrzkomórkowych (tłuszczów, granul polifosforanowych, granul siarki) - efektywność ektoenzymów w stosunku do substratów znakowanych fluorescencyjnie - łączenie się mikofobowych i mikrofilowych mikrocząstek z róŝnymi bakteriami występującymi w kłaczkach np. bakterii nitkowatych Ginige M.P., et al., 2004, App. Env. Microb., 70, (1)

14 Ginige M.P., et al., 2004, App. Env. Microb., 70, (1) W procesie denitryfikacji w konwencjonalnych oczyszczalniach ścieków powszechnie występują bakterie naleŝące do następujących rodzajów: Alcaligenes, Pseudomonas, Hyphomicrobium, Bacillus, Paracoccus. W ściekach przemysłowych w zaleŝności od rodzaju związku organicznego oraz akceptora elektronów odbywa się odmienna selekcja bakterii denitryfikacyjnych np. metanol selekcjonuje bakterie z rodzaju Paracoccus i Hyphomicrobium, w ściekach zawierających związki fenolu bakterie naleŝące do rodzaju Azoarcus. Ginige M.P., et al., 2004, App. Env. Microb., 70, (1) Denitryfikanty Nazwa sondy organizmy Sekwencja 5-3 FA, % Literatura PAR 651 G_Rb genus Paracoccus Rhodobacter, Roseobacter ACC TCT CTC GAA CTC CAG GTC AGT ATC GAG CCA GTG AG Nef i in,, 1996 Eilers i in., 2000 HyphoCII-654 Curvi997 PAOmix, PAO651 (ACCBA651) AZA645, Azo644 Thau646 ACI208 ZRA23a (ZRA,ZOGLO647) Hyphomicrobium denitrificans, H. methylovorum, H. facilis Curvibacter delicatum wiekszosc Candidatus Accumulibacter cluster większosc Azoarcus cluster Thauera Acidovorax spp. większosc Zoogloea lineage, nie Z. resiniphila CCC ACC TCT ATC GGA CTC CTC TGG TAA CTT CCG TAC CCC TCT GCC AAA CTC CAG GCC GTA CTC TAG CCG TGC TCT GCC GTA CTC TAG CCT T CGC GCA AGG CCT TGC CTG CCG TAC TCT AGT TAT n. det n. det Dayton i in., 2000 Thomson i in., 2004 Crocetti i in., 2000 Hess i in., 1997 Laioie i in., 2000 Amann i in., 1996 Rosselló-Mora i in., 1995 AT1458 Azoarcus-Thauera cluster GAA TCT CAC CGT GGT AAG CGC 50 Rabus i in.,1999 Pae997 Pseudomonas spp. TCT GGA AAG TTC TCA GCA 0 Amann i in., 1996

15