Znaczenie inhibitorów cholinoesteraz w terapii zespołów otępiennych towarzyszących chorobie Alzheimera oraz ich poszukiwanie w materiale roślinnym

Transkrypt

1 Znaczenie inhibitorów cholinoesteraz w terapii zespołów otępiennych towarzyszących chorobie Alzheimera oraz ich poszukiwanie w materiale roślinnym Dr hab. n. farm. Tomasz Mroczek Katedra i Zakład Farmakognozji z Pracownią Roślin Leczniczych UM w Lublinie, ul. Chodźki 1, Lublin tmroczek@pharmacognosy.org

2 1. WPROWADZENIE znaczenie inhibitorów acetylo- (AChE) i butyrylocholinoesterazy (BuChE) w leczeniu choroby Alzheimera (AD) techniki chromatograficzne sprzężone ze spektrometrią mas w analizie inhibitorów cholinoesteraz bioautograficzne testy wykrywania inhibitorów cholinoesteraz

3

4

5

6 Typy strukturalne naturalnych IChE Alkaloidy Indole: Fizostygmina Riwastygmina (Rivastygminum, Exelon, Symelon, Nimvastid)

7 Typy strukturalne naturalnych IChE Alkaloidy Amaryllidaceae: Galantamina (Razadyne, Reminyl, Nivalin) Sanguinina

8 Typy strukturalne naturalnych IChE Alkaloidy Lycopodium: Steroidowe: H N O H NH 2 Hupercyna A Imperycyna

9 Typy strukturalne naturalnych IChE Alkaloidy Isochinolinowe: Berberyna Koralina

10 Typy strukturalne naturalnych IChE Terpenoidy Diterpenoidy: Dihydrotanszinon Kryptotanszinon

11 Typy strukturalne naturalnych IChE Ksantony Bellidifolina Bellidyna

12 Typy strukturalne naturalnych IChE Aktywność IC50 iache (BuChE)* Compound IC50 (human tissue; nm) IC50 (neocortex; nm) Donepenzil Physostigmine 22 (1260) 39 Tacrine Galanthamine 575 (12 590) 646 Rivastigmine 9120 > * Jackisch et al. J. Alzheimers Dis. 2009, 16(3):

13 Substancje roślinne Rodzina Amaryllidaceae rodzaj Narcissus (cebule 15 różnych gatunków i odmian hodowlanych) Galanthus nivalis L. (cebule i ziela) Leucojum vernum var. carpaticum (cebule i ziela), L. aestivum Maibacher (cebule i ziela) rośliny afrykańskie (pochodzenie RPA, cebule): Scadoxus katherinae, S. puniceus, Crinum moorei, Crinum macowanii, Boophone disticha Rodzina Liliaceae Fritillaria imperialis var. lutea, Fritillaria imperialis var. rubra maxima (cebule) Rodzina Hyacinthaceae Muscari sp. (cebule 10 gatunków i odmian hodowlanych)

14 Substancje roślinne Rodzina Convolvulaceae: Ipomea hederifolia, I. coccinea (ziele) Rodzina Umbelliferae Peucedanum alsaticum (owoce, ziele) Inne (izoflawony z rodzaju Iris sp., związki syntetyczne...)

15 Substancje roślinne (przykłady) Narcissus cv. Hawera Crinum moorei Leucojum vernum

16 Substancje roślinne (cd.) Scadoxus puniceus Boophone disticha Fritillaria imperialis var. rubra maxima

17 Ciśnieniowa ekstrakcja cieczowa (PLE) ASE 100 ASE 200 Proces PLE

18 Ciśnieniowa ekstrakcja cieczowa (PLE) * * T. Mroczek, J. Mazurek, Anal. Chim. Acta 633 (2009)

19 Ciśnieniowa ekstrakcja cieczowa (PLE) * Gal; MeOH Lyc; MeOH Gal; TarMeOH Lyc; TarMeOH

20 Ekstrakcja ciecz-ciało stałe (SPE)

21 Ekstrakcja ciecz-ciało stałe (SPE) ** ** T. Mroczek, J. Chromatogr. A 1216 (2009)

22 Skrining ekstraktów metodą HPTLCdensytometryczną Densytogram ekstraktu z cebul N. jonquilla `Pipit` oczyszczonego metodą CE-SPE, po rozwinięciu w układzie chloroform-metanol-25%amoniak (9:0.5:0.5, v/v/v). Gal galantamina, Lk likoryna, Ltp zw. typu likoryny, Gtp zw. typu galantaminy; Gal LOD (ng/ l) 0.09, Lk LOD 0.13 (S/N = 3:1)

23 Skrining ekstraktów metodą HPTLCdensytometryczną 0,2 0,18 % 0,16 0,14 0,12 0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 0 TeteaTete Hawera Carlton Jetfire Pipit BabyMoon LeuVernBb LeuVernHb GalNivBb ScadKath Lk Gal Graficzne porównanie zawartości galantaminy i likoryny w wybranych roślinach rodziny Amaryllidaceae (HPTLC-densytometria); Tete a tete N.`tete a tete`, Hawera N.`hawera`, Carlton- N.`carlton`, Jetfire N.`jetfire`, Pipit N. jonquilla `Pipit`, BabyMoon- N. jonquilla `Baby Moon`, LeuVernBb Leucoium vernum var. carpaticum cebula, LeuVernHb L. Vernum var. carpaticum ziele, GalNivBb Galanthus nivalis cebula, ScadKath Scadoxus katherinae. Lk likoryna, Gal galantamina.

24 Skrining ekstraktów metodą RP-HPLC-DAD Analiza RP-HPLC-DAD ekstraktu z cebul N. jonquilla`pipit` oczyszczonego metodą CE-SPE (sorbent XTerra C18, elucja gradientowa, l 207 nm), ; Lk likoryna, Gal galantamina, Ltp zw. typu likoryny, Gtp zw. typu galantaminy; Gal LOD (ng/ l) 0.016, Lk LOD 0.01 (ng/ l) (S/N = 3:1); RSD t R %)

25 Analiza HPLC(HILIC)/DAD/ESI-TOF-MS ** Agilent 6210 LC-MSD TOF

26 HPLC/ESI-TOF-MS ** 3.44 pg 4.0 pg 3.6 pg

27 HPLC/ESI-TOF-MS ** LOD fg!

28 HPLC/ESI-TOF-MS **

29 HPLC/ESI-TOF-MS ** Fragmentacja w źródle jonów (in-source) z dokładnością pomiaru masy w zakresie 0-2 ppm

30 HPLC/ESI-TOF-MS HPLC/ESI-TOF-MS N. jonquilla Pipit VLC Nowy zw. naturalny -C 2 H 5 N -C 6 H 5 COOH Nowy zw. naturalny -C 2 H 5 N -C 6 H 5 COOH

31 HPLC/ESI-TOF-MS Fritillaria imperialis var. lutea Nowe zw. naturalne

32 HPLC/ESI-TOF-MS Fritillaria imperialis var. lutea

33 HPLC/ESI-TOF-MS F. imperialis var. lutea Fragmentacja zw. 28 w źródle jonów

34 Analiza HPLC(HILIC)/DAD/ESI/QTOF-MS Agilent 6530B LC-QTOF N. jonquilla Pipit Galantamina

35 Bioautografia TLC Metoda Ellmana

36 Metoda HPLC-UV-MS z bioreaktorem biochemicznym na podst. metody Ellmana K. Ingkaninan i wsp. J. Chromatogr. A, 2000, 872, 61-73

37 Bioautografia TLC ** H 3 C O 4 O AChE OH + 4 H 2 O 4 4 CH 3 COOH + N N + N + N ZnCl 4 2 H 3 CO OCH 3 2 H 3 CO OCH 3 N N N N OH Cl - OH OH Zn 2+ Cl - Cl - Zn 2+ Cl - OH Cl - 4 N N N N H 3 CO OCH 3

38 Bioautografia TLC ** LOD 4.5 pg!

39 Bioautografia TLC ** IC M Gal IC M IC M Dh-Gal N-formyl nor-gal ujemny pik dihydrogalantaminy ujemny pik galantaminy

40 Bioautografia TLC ** 3b-glukozyd-imperialiny Gal HO O NH O O HO O O Fritillaria imperialis var. lutea (6); var. rubra (7) HO OH OH Cymarozyd hupeheninozydu (zw. 28)

41 Bioautografia TLC Piranochromony i furanokumaryny (Peucedanum alsaticum) *** H HO HO CH 3 CH 3 O O H CH 3 CH 3 H O H OH H O O H H H OH CH 3 O 2'' H (R) (R) 3'' CH O 4'' 3 O CH 3 CH 3 H H 3' 4' (S) 2' O H OH 5 8 H O O 3 2 H H H OH Bioautografia związków z Peucedanum alsaticum. Faza ruchoma: n-heptan-dichlorometan-octan etylu (4:4:2, v/v/v) z dodatkiem octanu 2-naftylu o stężeniu 30 mg/20 ml mieszaniny. Ścieżka 1: metanol (1 μl), ścieżka 2: notoptol (20 μl, 1 mg/10 ml), ścieżka 3: mieszanina związków B pochodzących z ekstraktu z Peucedanum alsaticum (20 μl, 1 mg/10 ml), ścieżka 4: alsatikol i alsatikokumaryna (20 μl, 1 mg/10 ml), ścieżka 5: alsatikol, alsatikokumaryna i diwarikatol (20 μl, 1 mg/10 ml), ścieżka 6: ledeburiellol (20 μl, 0,1 mg/10 ml), ścieżka 7: izoimperatoryna (20 μl, 0,15 mg/10 ml), ścieżka 8: wzorzec galantaminy (1,1 ng). ***K. Skalicka-Woźniak, T. Mroczek, I. Garrard, K. Głowniak. (2009) J. Chromatogr. A, Vol. 1216, Issue 30:

42 Bioautografia TLC Kumaryny proste, inne furanokumaryny, mangiferyna (ksanton) Bioautograficzna analiza wybranych kumaryn prostych, furanokumaryn oraz ksantonu mangiferyny. Faza ruchoma: n-heptan-dichlorometan-octan etylu (4:4:2, v/v/v) z dodatkiem octanu 2-naftylu o stężeniu 30 mg/20 ml mieszaniny. Ścieżka 1: metanol (1 μl), ścieżka 2: bergapten (20 μl, 0,22 mg/10 ml), ścieżka 3: ksantotoksyna (20 μl, 0,54 mg/10 ml), ścieżka 4: ksantotoksol (20 μl, 0,26 mg/10 ml), ścieżka 5: ostol (20 μl, 0,21 mg/10 ml), ścieżka 6: mangiferyna (20 μl, 0,2 mg/10 ml), ścieżka 7: izoimperatoryna (10 μl, 0,15 mg/10 ml), ścieżka 8: wzorzec galantaminy (1,1 ng).

43 TLC/HPLC/ESI-TOF-MS/Bioautografia TLC System TLC/HPLC/DAD/ESI-TOF-MS Interfejs TLC-MS

44 TLC/HPLC/ESI-TOF-MS/Bioautografia TLC Badanie produktów biotransformacji galantaminy w kulturach Aspergillus celullose i A. niger PhAc-Gal Gal-OH O Farn3OH-Gal N-tlenek galantaminy

45 Testy in vivo Model myszy transgenicznych APP- Presenilin Locomotor activity Morris Water Maze Elevated T-maze Testy genetyczne

46 WNIOSKI Inhibitory cholinoesterazy wciąż stanowią istotne narzędzie w terapii zespołów otępiennych towarzyszących chorobie Alzheimera W połączeniu z memantyną mogą być stosowane również w bardziej zaawansowanym stadium AD Wciąż potrzeba badań nad pozyskiwaniem nowym bardziej aktywnych IChE, posiadających mniejsze działania niepożądane oraz przydatnych w zaawansowanej chorobie Alzheimera Techniki chromatograficzne sprzężone ze spektrometrią mas wysokiej rozdzielczości oraz bioautografią TLC stanowią bardzo cenne narzędzie poszukiwanie potencjalnie nowych leków przydatnych w terapii AD

47 DZIĘKUJĘ ZA UWAGĘ!