Szkolenie pt. Manipulacje genomowe u ryb łososiowatych: znaczenie, procedury i diagnostyka rezultatów Olsztyn 16 luty 17 luty 2008

Transkrypt

1 Szkolenie pt. Manipulacje genomowe u ryb łososiowatych: znaczenie, procedury i diagnostyka rezultatów Olsztyn 16 luty 17 luty 2008 dr Konrad Ocalewicz

2 Determinacja i dyferencjacja płci u ryb produkcja jednopłciowych stad ryb łososiowatych Konrad Ocalewicz Katedra Ichtiologii Wydział Ochrony Środowiska i Rybactwa UWM Olsztyn

3 Plan prezentacji Determinacja i dyferencjacja płci Definicja fenotypowej płci ryb. Genetyczne podstawy procesu determinacji płci ryb. Morfologicznie zróżnicowane chromosomy płci ryb. Ewolucja chromosomu Y u ryb łososiowatych. Mapowanie chromosomów płci ryb. Praktyczne wykorzystanie wiedzy na temat determinacji i dyferencjacji płci u ryb produkcja jednopłciowych stad ryb łososiowatych.

4 Czy nam się to podoba, czy nie, z faktem istnienia płci musimy się pogodzić. Problem w tym, że gdy już podział na płci zaistniał, zaczął być dominującym czynnikiem organizującym życie organizmów, nie wyłączając ludzi.

5 Po co nam rozmnażanie płciowe? Dla ludzi rozmnażanie płciowe jest: jedynym sposobem, aby mieć dzieci, i, jak się wydaje, taki jest cel wszystkich biologicznych zjawisk, zwanych płciowością. Chociaż poznano wiele lepszych, wydajniejszych sposobów reprodukcji: -pierwotniaki rozmnażają się przez podział na dwie komórki potomne; -robaki pączkują czy rozdzielają się na wiele fragmentów; -truskawki wyrastają z rozmnóżek; -wierzby rosną z odszczepionych gałązek, -mniszek lekarski wytwarza bez procesu płciowego nasiona; -dziewicze mszyce rodzą dziewicze córki, które są już ciężarne w chwili urodzenia itd.....

6 Typy rozmnażania: bezpłciowe (np. partenogeneza-dzieworództwo) samica płciowe samiec

7 Jaki jest w takim razie sens rozmnażania płciowego? Lewis Carroll (wł.charles Lutwidge Dodgson) (ur. 27 stycznia 1832, zm. 14 stycznia 1898) brytyjski pisarz, matematyk i fotograf. Hipoteza "Czerwonej Królowej" "W moim kraju - mówi zdumiona Alicja - zwykle jest się w innym miejscu, jeśli biegło się tak szybko i tak długo"... Żeby przetrwać, trzeba się ciągle bronić i bezustannie atakować. Uciekać jak gazela przed gepardem, żeby nie być pożartym i ścigać jak gepard gazelę, żeby nie paść z głodu, gdy obiad nie da się dogonić. Niszczyć bakterie, żeby nie być przez nie zniszczonym. Trzeba się wciąż ścigać z innymi, żeby pozostać wśród żywych. Leigh Van Valen, ewolucjonista, University in Chicago

8 Ewolucja chromosomów płci ssaków : zdefiniowany proces determinacji i dyferencjacji płci u człowieka

9 Chromosomy płci ssaków : mysz

10 Resolution and evolution of the duck-billed platypus karyotype with an X1Y1X2Y2X3Y3X4Y4X5Y5 male sex chromosome constitution Willem Rens *,, Frank Grützner, Patricia C. M. O'Brien *, Helen Fairclough *, Jennifer A. M. Graves, and Malcolm A. Ferguson-Smith * *Centre for Veterinary Science, University of Cambridge, Cambridge CB3 OES, United Kingdom; and Comparative Genomics Group, Research School of Biological Sciences, Australian National University, Canberra ACT 2601, Australia

11 In contrast, sex determination in birds operates through a ZZ/ZW system in which the female is the heterogametic sex.

12 FISH mapping of DMRT1 on chicken Z chromosome. a, Hybridization of DMRT1 cosmid to a female chicken metaphase spread. The biotinylated DNA probe is detected by FITC-avidin (green fluorescence). Chromosomes are counterstained with DAPI. b, DAPI banding of the same metaphase spread, converted by Oncor Image software into G-like bands. c, G-banded karyotype of chicken macrochromosomes hybridized with DMRT1 (green spot on Z chromosome). Nanda et al Nature Genetics 21, (1999)

13 Ewolucja chromosomów płci ssaków : zdefiniowany proces determinacji i dyferencjacji płci u człowieka

14 chromosomy płci XX chromosomy płci XY

15 Ewolucja chromosomów płci: zdefiniowany proces determinacji i dyferencjacji płci u człowieka 1. SYGNAŁ WYWOŁAWCZY: AKTYWNOŚĆ ODPOWIEDNICH GENÓW 2. URUCHOMIENIE GENÓW REGULATOROWYCH 3. AKTYWACJA GENÓW, POD KONTROLĄ KTÓRYCH TWORZĄ SIĘ GONADY I DRUGORZĘDOWE CECHY PŁCIOWE

16 Ewolucja chromosomów płci: zdefiniowany proces determinacji i dyferencjacji płci u człowieka gonada pierwotna jądra jajniki X Y mężczyzna kobieta X X

17 Ewolucja chromosomów płci prawdopodobny scenariusz gonosomy niezróżnicowane chromosomy płci

18 Ewolucja chromosomów płci prawdopodobny scenariusz SOX3 gonosomy: proto Y i proto X

19 Ewolucja chromosomów płci prawdopodobny scenariusz Gen determinujący płeć; SRY gonosomy: proto Y i proto X

20 Ewolucja chromosomów płci prawdopodobny scenariusz Sekwencje powtarzalne DNA zakłócające rekombinację całego regionu wokół TDF TDF

21 Ewolucja chromosomów płci prawdopodobny scenariusz Skracanie się chromosomu Y, sekwencje powtarzalne DNA łatwo ulęgają różnego rodzaju mutacjom: delecje, translokacje, etc. TDF Morfologicznie łatwo wyróżnialny chromosom Y

22 Ewolucja chromosomów płci: zdefiniowany proces determinacji i dyferencjacji płci u człowieka TDF gonada pierwotna jądra jajniki X Y mężczyzna kobieta X X

23 UMIEJĘTNOŚĆ IDENTYFIKACJI GENETYCZNEJ PŁCI U LUDZI : 1. Analiza genetycznie uwarunkowanych chorób sprzężonych z płcią. 2. Prenatalna identyfikacja zaburzeń chromosomów X i Y. 3. Badania medyczno-sądowe.

24 Programowanie płci u zwierząt hodowlanych (gamety) -inseminacji frakcjami nasienia bogatymi w plemniki z chromosomem X lub Y, Nasienie rozdziela się na podstawie: -różnic masy poszczególnych plemników (Iwasaki i in. 1988), -zawartości DNA (Johnson 1991), -antygenu H-Y (Peter i in. 1993) oraz -ruchliwości plemników zawierających chromosom X i Y.

25 Programowanie płci u zwierząt hodowlanych (zarodki) Zarodki uzyskane dzięki zapłodnieniu in vitro są: -poddawane badaniu aktywności enzymów kodowanych przez geny leżące na chromosomie X (Monk i Handyside 1988), -stwierdzaniu obecności antygenu H-Y charakterystycznego dla płci samczej (White i in. 1987), -cytogenetycznej i molekularnej identyfikacji genotypów płci XX i XY (Picard i in. 1984, Aasen i Medrano 1990, Jaszczak i Sysa 1995).

26 RYBY Determinacja płci Dyferencjacja płci

27 Fenotypowa płeć ryb: rozdzielnopłciowość Gonochoryzm rozdzielnopłciowość gonochoryzm zróżnicowany (rozwój gonad z gonady pierwotnej nie mającej cech jajników ani jąder) gonochoryzm niezróżnicowany (rozwój gonad z jajnikopodobnej gonady)

28 Dyferencjacja płci ryb: obojnactwo - hermafrodytyzm hermafrodytyzm protoandralny (czasowa zmiana funkcji gonad z jąder w jajniki) hermafrodytyzm protogynalny (czasowa zmiana funkcji gonad z jajników na jądra)

29 Dyferencjacja płci ryb: obojnactwo - hermafrodytyzm hermafrodytyzm synchroniczny (jednoczesne występowanie jąder i jajników) Serranus scriba L

30 Dyferencjacja płci ryb: wpływ warunków środowiskowych

31 Podstawy genetycznej determinacji płci u ryb: systemy determinacji Gatunek Pstrąg tęczowy (Oncorhynchus mykiss) System determinacji płci Chromosomy płci samicy Chromosomy płci samca XY XX XY Tilapia aurea WZ WZ ZZ Zmienniak plamisty (Xiphophorus maculatus) WXY WX, WY, XX XY, YY Sternoptyx diaphana X0 XX X0 Colisa lalius Z0 Z0 ZZ Apereiedon affinis WWZ WWZ ZZ Hoplias XYY XX XYY Megupsilon apons XXY XXXX XXY Limia caudofasciata Geny determinujące płeć położone są na autosomach

32 Ewolucja chromosomów płci ryb: poszukiwanie czynnika determinującego płeć ryb TDF=dmrt1bY u ryb? dmrt1by powstał w wyniku duplikacji genu dmrt1a dmrt1a proces determinacji i dyferencjacji płci u kręgowców dmrt1a konserwatywna budowa oraz funkcja samiec samica Schartle et al.trends in Genetics: 2001

33 Ewolucja chromosomów płci ryb: poszukiwanie czynnika determinującego płeć ryb dmrt1by nie jest pierwotnym włącznikiem płci u ryb Schartl et al. Trends in Genetics. 2002

34 Ewolucja chromosomów płci ryb: poszukiwanie czynnika determinującego płeć ryb Wiek chromosomu Y u ryb Schartl et al. Trends in Genetics. 2002

35 Wiek chromosomów płci 300 mln lat Chromosom Y człowieka 10 mln lat Chromosom Y Oryzias latipes

36

37 Chromosomy płci ryb są na bardzo wczesnym etapie morfologicznego różnicowania się!

38 Ocalewicz et al. 2008

39 Chromosomy płci ryb są na bardzo wczesnym etapie morfologicznego różnicowania się! Salmonidae Thymallus - Brachymystax - Hucho - Salvelinus + (2 gatunki: S. namaycush, S. fontinalis) Salmo - Oncorhynchus + (4 gatunki: O. tshawytscha, kisutch, nerka, Oncorhynchus mykiss) Ocalewicz et al. Cytogenet Genome Res. 2004

40 Chromosomy płci ryb są na bardzo wczesnym etapie morfologicznego różnicowania się! wyróżnialne chromosomy płci u ryb łososiowatych : chromosom Y lake trout (Salvelinus namaycush) pstrąg źródlany (Salvelinus fontinalis) sockey salmon (Oncorhynchus nerka) Pstrąg tęczowy (Oncorhynchus mykiss) Salmonidae Salvelinus namaycush Salvelinus fontinalis Oncorhynchus nerka Oncorhynchus mykiss

41 Chromosomy płci ryb są na bardzo wczesnym etapie morfologicznego różnicowania się! Genetic map of the sex linkage groups in Arctic charr (AC4), brown trout (BT28), Atlantic salmon (AS1), and rainbow trout (RT18) generated from male parents. Estimates of map distances between markers are indicated in centimorgans. Woram et al. 2003

42 Podstawy genetycznej determinacji płci u ryb: systemy determinacji Gatunek Pstrąg tęczowy (Oncorhynchus mykiss) System determinacji płci Chromosomy płci samicy Chromosomy płci samca XY XX XY Tilapia aurea WZ WZ ZZ Zmienniak plamisty (Xiphophorus maculatus) WXY WX, WY, XX XY, YY Sternoptyx diaphana X0 XX X0 Colisa lalius Z0 Z0 ZZ Apereiedon affinis WWZ WWZ ZZ Hoplias XYY XX XYY Megupsilon apons XXY XXXX XXY Limia caudofasciata Geny determinujące płeć położone są na autosomach

43

44 Pstrąg tęczowy YY Ocalewicz et al. 2007, Aquaculture

45 Dyferencjacja płci u pstrąga tęczowego (Oncorhynchus mykiss) samica samiec Przekrój przez jajniki (a) i jądra (b) pstrąga tęczowego

46 Determinacja płci u pstrąga tęczowego (Oncorhynchus mykiss) Pstrąg tęczowy (Oncorhynchus mykiss) linia Donaldson + linia SW - linia ARL - linia Rutki + linia CW + linia HC + linia Maliszewski (palomino, albinotyczne) + linia OSU + linia niemiecka (IFW) + Ameryka Północna Europa

47 Determinacja płci u pstrąga tęczowego (Oncorhynchus mykiss) samica samiec Płeć gonadowa: 25 samic i 22 samce Genotyp płci: 25 XX, 19 XY, 3 samce XX

48 Determinacja płci u pstrąga tęczowego (Oncorhynchus mykiss) samica Alu I samiec Hinf I

49 Determinacja płci u pstrąga tęczowego (Oncorhynchus mykiss) samica samiec

50 Determinacja płci u pstrąga tęczowego (Oncorhynchus mykiss) Lokalizacja sekwencji 5S rdna na chromosomach pstrągów tęczowych samica XX samiec XY Ocalewicz and Babiak JFB,2003

51 Determinacja płci u pstrąga tęczowego (Oncorhynchus mykiss) androgenetyczna samica XX androgenetyczny samiec YY

52 Determinacja płci u pstrąga tęczowego (Oncorhynchus mykiss) SAMICA (XX) SAMIEC (XY) Giemsa Alu I Hinf I DAPI Ocalewicz Folia biologica, 2002

53 Mapowanie chromosomów płci u ryb łososiowatych Chromosomy w stadium metafazy sekwencjono wanie Klonowanie uzyskanych fragmentów DNA Mikrodysekcja chromosomu X DOP-PCR

54 W przypadku ryb łososiowatych to samice są lepszym materiałem zarybieniowym

55 Potencjalne korzyści wynikające z hodowania ryb jednej płci (samic lub samców): Lepsze tempo wzrostu ryb Redukcja zachowań agresywnych Produkowanie ryb podobnej wielkości (uniformizacja) Późniejsze dojrzewanie płciowe Lepsza jakość mięsa

56 Health Certified SPF Viruses:VHS, IPN, IHN, ONV Protozoa:Myxosoma cerebralis Bacteria:No epizootics of BKD of Furunculosis

57 Pan sized trout (Schwarzwaldforellen /Black forest trout), all female: Available all year round. Price on request. Sterile rainbow trout fingerlings all female triploid: Only on request. Large trout, no gonads, (during winter time all female triploid ): Available all year round. Prices on request.

58 Produkcja jednopłciowych stad pstrąga tęczowego Inaktywacja jądrowego genomu samca, UV) + 1n 0n + 1n = 1n Gynogeneza Podwojenie ilości DNA do 2n 2n

59 Produkcja jednopłciowych stad pstrąga tęczowego Główny szlak biosyntezy steroidów.

60 Produkcja jednopłciowych stad pstrąga tęczowego Produkcja fenotypowych samców Główny szlak biosyntezy steroidów.

61 Produkcja jednopłciowych stad pstrąga tęczowego Produkcja fenotypowych samic Główny szlak biosyntezy steroidów.

62 Normalna samica (XX) Samica gynogenetyczna (XX) Maskulinizacja (niskie dawki androgenów (17-α-metylotestosteron) podawane we wczesnych stadiach rozwojowych) Maskulinizowane samice (neosamce) Fenotyp (samczy), ale genotyp XX Produkcja plemników z chromosomami płci typu X Krzyżowanie neosamca (XX) z normalna samicą (XX) Potomstwo wyłącznie samicze Schemat produkcji samiczego narybku pstrąga tęczowego na drodze feminizacji pośredniej

63 Samica gynogenetyczna (XX) Maskulinizacja (niskie dawki androgenów (17-α-metylotestosteron) podawane we wczesnych stadiach rozwojowych) Maskulinizowane samice (neosamce) Fenotyp (samczy), ale genotyp XX Produkcja plemników z chromosomami płci typu X Krzyżowanie neosamca (XX) z normalna samicą (XX) Potomstwo wyłącznie samicze Schemat produkcji samiczego narybku pstrąga tęczowego na drodze feminizacji pośredniej

64 Produkcja jednopłciowych stad pstrąga tęczowego Lokalizacja sekwencji 5S rdna i wynik barwienia fluorochromem DAPI przeprowadzonego na chromosomach neosamca pstrąga tęczowego

65 Proces zamiany żeńskiej płci fenotypowej na męską najczęściej prowadzi do zaburzeń rozwojowych i wytworzenia nieprawidłowego układu rozrodczego Ciereszko i inni. 2006

66 Produkcja jednopłciowych stad pstrąga tęczowego Główny szlak biosyntezy steroidów.

67 Produkcja jednopłciowych stad pstrąga tęczowego Gene knock-out genu kodującego aromatazę Główny szlak biosyntezy steroidów.

68 Dziękuję za uwagę