Transkrypt

1 POSTÊPY BIOLOGII KOMÓRKI TOM NR 1 (65 84) HISTON H1.2 PRZEDSTAWICIEL HISTONÓW CZNIKOWYCH 65 HISTON H1.2 PRZEDSTAWICIEL HISTONÓW CZNIKOWYCH O FUNKCJI ZNACZNIKA APOPTOZY* HISTONE H1.2 MEMBER OF LINKER HISTONES WITH APOPTOSIS MARKER FUNCTION Arleta BOROWIAK, Zofia M. KILIAÑSKA Zak³ad Biochemii Medycznej Katedry Cytobiochemii, Uniwersytet ódzki Streszczenie: W komórkach ssaków zidentyfikowano co najmniej 11 podtypów histonów ³¹cznikowych. Przez wiele lat uwa ano, e histony rodziny H1 odpowiadaj¹ g³ównie za formowanie struktury chromatyny wy szego rzêdu, jej stabilizacjê i pe³ni¹ funkcjê inhibitora dostêpnoœci do DNA. Wyniki badañ ostatnich lat wskazuj¹ jednak, e warianty histonu H1 mog¹ uczestniczyæ w specyficznej regulacji ekspresji genów, proliferacji, starzenia i indukcji apoptozy. Wci¹ niewiele wiadomo, które warianty H1 bior¹ udzia³ w tych procesach i z jak¹ skutecznoœci¹. Przypuszcza siê, e poszczególne warianty histonu H1 mog¹ pe³niæ odmienne funkcje i mog¹ regulowaæ ró ne promotory genów lub te same, ale w inny sposób. Wyciszenie ekspresji genów koduj¹cych niektóre warianty H1 pozwoli³o wykazaæ charakterystyczne zró nicowanie ich ekspresji. Wœród poszczególnych przedstawicieli H1 tylko histon H1.2 wykazuje aktywnoœæ proapoptotyczn¹. Wyniki badañ wykaza³y, e ten wariant H1 uczestniczy w przebiegu apoptozy na szlaku mitochondrialnym i indukuje wyp³yw z mitochondriów czynników apoptogennych. Pocz¹tkowo uwa ano, e translokacja H1.2 z j¹dra komórkowego do cytosolu (cytozolu) jest indukowana g³ównie przez dwuniciowe pêkniêcia DNA. Jednak e kolejne badania ujawni³y, e inne uszkodzenia DNA, dzia³anie zwi¹zków niegenotoksycznych, a tak e proces spontanicznej apoptozy mog¹ prowadziæ do wyp³ywu H1.2 z j¹dra komórkowego. Pionierskie wyniki doniesieñ dotycz¹cych udzia³u tego wariantu H1 w apoptozie sugeruj¹, e bia³ko to mo e zostaæ uznane za wczesny marker tego procesu. Sugeruje siê, e obecnoœæ H1.2 w cytosolu komórek nowotworowych mo e wskazywaæ na dobrze rokuj¹c¹ odpowiedÿ pacjenta na zastosowan¹ terapiê. S³owa kluczowe: warianty histonu H1, apoptoza, szlak mitochondrialny, marker apoptozy. Summary: Eleven linker histone subtypes have been identified to date in mammalian cells. For many years has been thought that members of H1 family are mainly responsible for the formation of higher order structures of chromatin, its stabilization and as DNA accessibility inhibitor. Experimental data from recent years revealed, however, that H1 variants may participate in specific gene regulation, proliferation, senescence, and apoptosis induction. Still little is known which H1 variants take part in above processes and with what efficiacy. It is supposed that particular H1 representatives may performed different *Praca wykonana w ramach badañ w³asnych Uniwersytetu ódzkiego nr 505/0375 oraz projektu pt. Doktoranci Regionalna Inwestycja w M³odych Naukowców D RIM wspó³finansowanego przez Uniê Europejsk¹.

2 66 A. BOROWIAK, Z. M. KILIAÑSKA functions and regulate diverse gene promotors or the same ones but in a different way. The silencing of gene expression coding some H1 variants allows to show diversity in their expression. Among particular H1 subtypes H1.2 only indicates proapoptotic activity. Obtained results revealed that this H1 variant participates in mitochondrial pathway of apoptosis and induces apoptogenic agents from mitochondria. At the beginning it has been demonstrated that H1.2 translocation from cell nucleus to cytosol is induced by DNA double strand breaks only. However, next data revealed, that other DNA damages, activity of non-genotoxic agents as well as spontaneous apoptosis may trigger the release of H1.2 from nucleus. Pioneer reports about this H1 variant participation in apoptosis suggest, that this protein may be recognized as early apoptosis marker. Viewed from this perspective, H1.2 presence in cancer cell cytosol may indicate that applied therapy has good prognostic value for patient. Key words: H1 variants, apoptosis, mitochondrial pathway, apoptosis marker. 1. HISTONY CZNIKOWE H1; MIKROHETEROGENNOŒÆ W komórkach organizmów eukariotycznych DNA ulega upakowaniu w kompleks nukleoproteinowy zwany chromatyn¹. Podstawow¹ jednostk¹ struktury chromatyny stanowi nukleosom zbudowany z podwójnych cz¹steczek histonów H2A, H2B, H3 i H4 formuj¹cych rdzeñ z nawiniêtym nañ DNA o d³ugoœci 146/147 par nukleotydów (pnt). Z kolei silnie lizynowe histony ³¹cznikowe H1 wi¹ ¹ nukleosomy i oddzia³uj¹ z wra liwym na nukleazy ³¹cznikowym DNA o zmiennej d³ugoœci oko³o 20 do 90 pnt [34,47]. Histony typu H1 wi¹ ¹ siê z DNA nawiniêtym na oktamer histonów w pobli u nici wstêpuj¹cej i zstêpuj¹cej DNA, stabilizuj¹c w³ókna chromatyny [9,28,50]. Dane literaturowe wskazuj¹, e histony ³¹cznikowe stanowi¹ unikatow¹ rodzinê wœród histonów z powodu wystêpowania wœród nich najwy szej liczby wariantów sekwencyjnych. Wystêpowanie ich heterogennoœci wydaje siê byæ uwarunkowane ewolucyjnie zarówno wœród krêgowców, jak i roœlin [4,28]. W analizowanych dot¹d organizmach H1 wystêpuje zwykle wiêcej ni jeden ich wariant [28,29]. W organizmach ssaków, w tym cz³owieka, zidentyfikowano 11 podtypów H1 [4,26,64]. Zespó³ badawczy pod kierunkiem D. Doenecke [26] wœród przedstawicieli H1 cz³owieka wyró nia powszechnie wystêpuj¹ce histony H1.1, H1.2, H1.3, H1.4, H1.5, H1.0 i H1.x oraz grupê homologów, których ekspresja jest specyficzna dla tkanek czy rozwoju organizmu: H1t, H1T2, HILS1 i H1.oo (tab. 1). W innym podziale wariantów H1 u ssaków wyró nia siê 7 histonów somatycznych (H1 s ), tj. H1.1 H1.5, H1.0 i H1.x, trzy warianty spermatogeniczne H1t, H1T2 i HILS1 oraz wariant specyficzny dla oocytów H1.oo [4]. Geny koduj¹ce powszechnie wystêpuj¹ce podtypy H1.1 H1.5, a tak e H1t u cz³owieka s¹ usytuowane na krótkim ramieniu chromosomu 6. (6p ) [2]. Ekspresja genów koduj¹cych subtypy H1.1 H1.5 jest zale na od replikacji; ich transkrypty nie ulegaj¹ poliadenylacji i zawieraj¹ na 3'-koñcu cz¹steczki strukturê szpilki do w³osów [42]. Poziom H1.1 jest niski, a jego ekspresja jest specyficzna dla kilku tkanek, tj. grasicy, j¹der, œledziony, limfocytów i komórek nerwowych [66]. W prawie wszystkich komórkach ssaków podtypy H1.2 i H1.4 nale ¹ do dominuj¹cych w rodzinie H1 [44]. Ekspresja histonu H1.2 mo e przebiegaæ zale nie b¹dÿ niezale nie od replikacji DNA, a jego transkrypt ulega poliadenylacji [10]. Na uwagê zas³uguje,

3 HISTON H1.2 PRZEDSTAWICIEL HISTONÓW CZNIKOWYCH 67 TABELA 1. Podtypy histonu H1 w komórkach/narz¹dach cz³owieka (wg [26] zmodyfikowano) TABLE 1. Histone H1 subtypes in human cells/organs (according to [26] modified] Podtypy histonu H1 Liczba Geny koduj¹ce subtypy Miejsce ekspresji a (synonimy) aminokwasów c (i ich synonimy); loci (komórki/narz¹dy) b H1.1 (H1a) H1.2 (H1c) H1.3 (H1d) H1.4 (H1e) H1.5 (H1b) H1t H1T2 H1oo (H1foo) HILS (Hils1) H1x (H1X, H1.X) H1.0 (H1 ) HIST1HA (H1F1); HIST1HC (H1F2); HIST1HD (H1F3); HIST1HE (H1F4); HIST1HB (H1F5); HIST1H1T (H1FT); H1FNT (HANP1); H1FOO; HILS1; H1FX; H 1FV (H1FO); 6P P P P P P q q q q q13. 1 Powszechne wystêpowanie j.w. j.w. j.w. j.w. Spermatocyty Spermatydy Oocyty Spermatydy Powszechne wystêpowanie Komórki zró nicowane a b H1a-H1e ortologi wariantów histonu H1 u myszy; d³ugoœæ ³añcucha bez inicjuj¹cej reszty c metioniny; H1.1-H1.5 i H1T loci genów w tzw. histone major cluster wraz z genami histonów rdzeniowych e geny koduj¹ce H1.0 i H1.x s¹ umieszczone odpowiednio na chromosomach 22. i 3. [55]. Poziom syntetyzowanych na ich matrycy bia³ek wykazuje zró nicowane wartoœci. Ekspresja genu koduj¹cego H1.0, podobnie jak histonu H5 (ang. replacement H1 subtypes) jest niezale na od replikacji DNA [14]. Transkrypt dla H1.0 ulega poliadenylacji i jest wykorzystywany w ostatecznie zró nicowanych komórkach [68]. Wariant H1.0 wystêpuje w komórkach ssaków i jest najbli szym strukturalnym homologiem wœród przedstawicieli rodziny H1 histonu H5 ptaków oraz zimnokrwistych krêgowców (gady, p³azy, ryby) [35]. Z kolei synteza H1.x, w której uczestniczy poliadenylowany transkrypt, utrzymuje siê na niezmienionym poziomie przez cykl komórkowy czy po indukcji ró nicowania. Immunochemiczna analiza potwierdzi³a jego wewn¹trzj¹derkowe rozmieszczenie, g³ównie w nukleazoopornej chromatynie [57]. Podkreœla siê, e lokalizacja w j¹drze komórkowym nosi cechy pewnej specyficznoœci. Wykorzystuj¹c znakowane za pomoc¹ reporterowego bia³ka GFP (ang. Green Fluorescent Protein) g³ównych subtypów H1 w j¹drach fibroblastów myszy wykazano, e H1.1, H1.2 i H1.3 g³ównie s¹ umiejscowione w euchromatynie, natomiast H1.4 i H1.5 pozostaj¹ zwi¹zane z heterochromatyn¹. H1.2, który stanowi dominuj¹cy wariant wœród histonów ³¹cznikowych jest jednoczeœnie s³abo zwi¹zanym sk³adnikiem nukleosomów. Ta w³aœciwoœæ mo e uwra liwiaæ miejsce jego wi¹zania z DNA na uszkodzenia w postaci podwójnych pêkniêæ DBSs (ang. Double Strand Breaks) [61]. Histony ³¹cznikowe reprezentuj¹ najwolniej ewoluuj¹ce bia³ka i wystêpuj¹ powszechnie w organizmach eukariotycznych. Wœród Prokaryota opisano bia³ka o znacznym do nich podobieñstwie, tzw. histone-like proteins [29] Struktura pierwszorzêdowa Analizy struktury wariantów H1 cz³owieka oraz H5 erytrocytów ptaków, p³azów, gadów i ryb wskazuj¹ na obecnoœæ w ich cz¹steczkach trzech domen, tj. N- i C- koñcowej, odpowiednio opisywanych symbolami NTD i CTD (ang. N-, C-terminal

4 68 A. BOROWIAK, Z. M. KILIAÑSKA tail domain) silnie zasadowych i nieustrukturalizowanych. Otaczaj¹ one trzeci¹ domenê globularn¹ GD (ang. globular domain) o najwy szym stopniu konserwatywnoœci wœród histonów ³¹cznikowych, zbudowanej z oko³o 75 aminokwasów [26,29,35]. Badania krystalograficzne ujawni³y, e w domenie GD wystêpuj¹ 3 a-helisy oraz struktura tzw. uskrzydlonej helisy (ang. winged helix), która stanowi odcinek wi¹zania z DNA [4]. Krótszy N-koñcowy ogon subtypów H1 zawiera oko³o aa, wœród których wystêpuje wysoki odsetek zasadowych aminokwasów, proliny i alaniny. Domena C-koñcowa wariantów H1 jest najbardziej zró nicowana w d³ugoœci ³añcucha ( aa) i zwykle stanowi ponad 50% cz¹steczki. W jej sk³adzie charakterystyczny jest wysoki odsetek lizyny, seryny i proliny [35]. Ten region przyjmuje specyficzn¹ strukturê, kiedy wi¹ e siê z DNA [26,27]. Wydaje siê, e funkcjonaln¹ heterogennoœæ subtypów H1 w komórkach ssaków mo na wi¹zaæ z ró nicami struktury pierwszorzêdowej g³ównie domeny C- koñcowej ich cz¹steczek [61] (por. ryc. 1). Ostatnie doniesienia McBryanta i wsp. [43] podkreœlaj¹, e CTD opisywanej rodziny H1 poœredniczy w interakcjach zarówno z DNA, jak i specyficznymi bia³kami. Ponadto ten odcinek jest zwi¹zany z aktywnoœci¹ apoptotycznej endonukleazy DFF40/CAD (ang. DNA Fragmentation Factor 40/Caspase Activated Deoxyribonuclease) [65] Modyfikacje potranslacyjne histonów ³¹cznikowych Potranslacyjne modyfikacje histonów ³¹cznikowych poznano w znacznie mniejszym stopniu ni histonów rdzeniowych [47,66]. Jak dot¹d najwiêksz¹ uwagê zogni-skowano na ich fosforylacji/defosforylacji, zmapowaniu miejsc tej modyfikacji w cz¹steczkach g³ównych wariantów H1 oraz funkcji zmodyfikowanych bia³ek [21,26,55,56,64,66]. Proces fosforylacji histonów H1 zmienia siê podczas cyklu komórkowego, chocia wci¹ nie ma jasnoœci, jak ta modyfikacja moduluje interakcjê DNA z tymi bia³kami podczas interfazy i mitozy. Pionierskie prace wykorzystuj¹ce jako model komórki CHO (ang. Chinese Hamster Ovary) zasugerowa³y, e w póÿnej fazie G 1 cyklu komórkowego dochodzi do pojedynczej fosforylacji H1, a podczas fazy S i G 2 przy³¹czaj¹ siê trzy reszty fosforanowe na cz¹steczkê H1. Natomiast podczas mitozy na ³añcuch H1 mo e zostaæ enzymatycznie przeniesione 6 reszt fosforanowych [24]. Podkreœlono, e podczas interfazy fosforylacji ulegaj¹ reszty Ser i Thr w C-koñcu, natomiast podczas mitozy w N-koñcu ³añcucha H1. Na tym etapie badañ nie podano preferencji modyfikacji okreœlonego motywu sekwencyjnego przez kinazê/y. Fosforylacjê histonów ³¹cznikowych in vivo, przebiegaj¹c¹ w sposób zale ny od cyklu komórkowego katalizuj¹ cyklino-zale ne kinazy Cdks (ang. Cyclin dependent kinases) tworz¹ce kompleksy z odpowiedni¹ cyklin¹. W komórkach CHO opisano 4 kinazy dokonuj¹ce fosforylacji H1, tj. 1) interfazowo-specyficzn¹ kinazê B (p33 CDC2 /cyklina A), 2) póÿno-interfazow¹ kinazê A (p34 CDC2 /cyklina A), 3) mitotyczn¹ kinazê C (p34 CDC2 /cyklina B) i 4) kinazê M p34 CDC2 /nieznana cyklina) [58]. Wymienione kinazy, poza motywem sekwencyjnym rozpoznawanym przez Cdk (S/T)PXK, (gdzie: S/T Ser/Thr, P Pro, X dowolny aminokwas, K Lys) fosforyluj¹ równie inne miejsce cz¹steczki H1.

5 HISTON H1.2 PRZEDSTAWICIEL HISTONÓW CZNIKOWYCH 69 RYCINA 1. Sekwencje aminokwasowe i udokumentowane miejsca potranslacyjnych modyfikacji g³ównych wariantów H1 cz³owieka. Czarn¹ lini¹ zaznaczono motyw uskrzydlonej helisy jako strukturalnego wyznacznika domeny globularnej, powy ej której znajduje siê domena N-koñcowa, a poni ej domena C-koñcowa. Zmapowane miejsca modyfikacji potranslacyjnych w histonach ³¹cznikowych oznaczono ró nymi kolorami, a ubikwitylowane reszty Lys(K) podkreœlono. * Miejsca acetylacji/metylacji nie s¹ oznaczone precyzyjnie dotyczy to acetylacji Lys168 i metylacji Lys169 b¹dÿ acetylacji i metylacji Lys168 w histonach H1.3 i H1.4 oraz odpowiednio Lys167 i Lys168 w H1.5 (wg [26,29,66]) FIGURE 1. Amino acid sequences and documented posttranslational modification sites in main human H1 histones. The sequence spam representing the winged motif as the structural determinant of globular domain is illustrated with a black line, above which N-terminal domain and below which C-terminal domain is located, respectively. The mapped posttranslational modification sites in are marked with different coloures and ubiquitination sites of Lys(K) are underlined. * Acetylation/methylation sites have not been assigned exactly; either acetylation of Lys168 and methylation of Lys169 or acetylation and methylation of Lys168 in H1.3 and H1.4 and Lys167 and Lys168 in H1.5, respectively (based on [26,29,66])

6 70 A. BOROWIAK, Z. M. KILIAÑSKA Po kilkunastu latach w laboratorium Lindnera [55,56,59] stosuj¹c do frakcjonowania histonów ³¹cznikowych kilka linii ludzkich komórek bia³aczkowych techniki HPLC (ang. High-Performance Liquid Chromatography), HILIC (ang. Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography) oraz spektrometriê mas udowodniono, e wœród histonów H1 mo e dojœæ równie do fosforylacji N-koñca cz¹steczki podczas interfazy. Okaza³o siê, e w komórkach CCFR-CEM [56] oraz komórkach HEK293 [59] w przeciwieñstwie do H1.2, H1.3 i H1.4 modyfikowanych podczas interfazy na resztach Ser w motywie sekwencyjnym SPK(A)K w C-koñcu cz¹steczki wariant H1.5 ulega fosforylacji zarówno w N-, jak i C-koñcu ³añcucha. Podczas interfazy fosforylacja H1.5 rozpoczyna siê w³¹czeniem reszty fosforanowej na Ser17, potem modyfikacja obejmuje Ser172 i koñczy siê fosforylacj¹ Ser188. Z kolei podczas póÿnej fazy G 2 i mitozy nastêpuje zwiêkszona fosforylacja H1.5 na resztach Thr137 albo Thr154 w obrêbie motywu TPKK [55]. Modyfikacje reszt Thr przebiegaj¹ g³ównie w profazie, metafazie i ulegaj¹ spadkowi w anafazie, przed rozpoczêciem dekondensacji chromosomów. Wykazano ponadto fosforylacjê Thr10 w N-koñcowej domenie H1.5, w której brak motywu sekwencji rozpoznawanej przez kinazy modyfikuj¹ce histony. Opisana modyfikacja pojawia siê w profazie i wygasa przed dekondensacj¹ chromosomów podczas telofazy [59]. Ró nice przebiegu fosforylacji H1.5 w porównaniu z H1.2, H.1.3 i H1.4 mog¹ prowadziæ do os³abienia wi¹zania N- i C-koñcowych domen tego bia³ka z DNA podczas interfazy, co podkreœla istotê odmiennego zachowania badanych wariantów. Szczególnie wa na wydaje siê mitotyczna fosforylacja w H1.5 reszt Thr137 lub Thr154 z uwagi na dowody, e to C-koñcowy region H1 in vivo moduluj¹ oddzia- ³ywania z chromatyn¹ [43,61]. W tym kontekœcie godne podkreœlenia jest wstêpne doniesienie potwierdzaj¹ce przez badania immunofluorescencyjne, e równie H1.4 ulega mitotycznej fosforylacji na Ser145 [56]. Ujawniono, e fosforylacja H1 jest wa nym wydarzeniem w przebiegu replikacji DNA. Niedawno przedstawiono wyniki doœwiadczeñ wskazuj¹ce, e in vivo miejsca replikuj¹cego DNA i ufosforylowanego H1 pokrywaj¹ siê, a modyfikacja tego histonu jest zale na od kinazy Cdk2 [3]. Stwierdzono, e bia³ko Cdc45 (ang. Cell division cycle 45), czynnik nieodzowny dla inicjacji i elongacji replikacji DNA, rekrutuje Cdk2 do miejsc replikacji. Fosforylacja H1 indukuje dekondensacjê chromatyny, co stwarza warunki u³atwiaj¹ce replikacjê DNA i przesuw wide³ek replikacyjnych. Talasz i wsp. [59] potwierdzili, e miejsce ufosforylowanych wariantów H1.5, a tak e H1.2 wspó³lokalizuj¹ z miejscami replikacji i transkrypcji. Zjawisko fosforylacji na okreœlonym poziomie jest nieodzowne dla przebiegu fazy S interfazy, ale równie odpowiada za stan kondensacji mitotycznej. Pozbawienie histonu H1 zapobiega prawid³owemu u³o eniu i segregacji chromatyd w anafazie [40]. Wysuniêto hipotezê, e usuniêcie histonu H1 bezpoœrednio wp³ywa na architekturê chromosomów przez destabilizacjê w³ókna chromatynowego 30 nm przyczyniaj¹c siê do formowania wyd³u onych interfazowych w³ókien chromatyny, co w konsekwencji prowadzi do d³u szych skondensowanych chromosomów w mitozie [41]. Korelacjê miêdzy fosforylacj¹ chromosomów potwierdzono przez wykorzystanie inhibitora kinaz staurosporyny [60]. W komórkach myszy, blokowanych w mitozie przez nokodazol wprowadzenie

7 HISTON H1.2 PRZEDSTAWICIEL HISTONÓW CZNIKOWYCH 71 staurosporyny prowadzi do szybkiej defosforylacji H1, której towarzyszy dekondensacja chromosomów. Na obecnym etapie badañ mo na stwierdziæ, e fosforylacja przedstawicieli rodziny H1 mo e funkcjonowaæ jako wczesny mechanizm indukuj¹cy remodelowanie chromatyny, umo liwiaj¹ce dostêp czynników aktywuj¹cych geny, replikacjê DNA i jego naprawê. Jedna z najczêœciej cytowanych publikacji dotycz¹ca modyfikacji histonów ³¹cznikowych (dwóch linii komórkowych cz³owieka i oœmiu tkanek myszy) wymienia kilka dodatkowych miejsc fosforylacji g³ównych wariantów H1 (por. ryc. 1) wskazuj¹c na ich potencjaln¹ rolê w regulacji interakcji z DNA [66]. W cytowanej publikacji zasygnalizowano równie inne modyfikacje potranslacyjne g³ównych wariantów H1, tj. acetylacji, metylacji, ubikwitylacji i formylacji [66]. Wnikliwa analiza zmapowanych miejsc tych modyfikacji ujawni³a, e dotycz¹ one w znacznym stopniu aminokwasów domeny globularnej histonów ³¹cznikowych (por. ryc. 1), co sugeruje mo liwoœæ ich wp³ywu na oddzia³ywania tego regionu w wi¹zaniu DNA. Z opublikowanych dot¹d badañ nad istotn¹ dla struktury chromatyny modyfikacj¹ przez metylacjê histonów ³¹cznikowych nale y wspomnieæ, e najwczeœniej doniesiono o metylacji H1.4 [38,62]. Pocz¹tkowo wykazano, e modyfikacjê tê katalizuje metylotransferaza histonowa Ezh2 (sk³adnik kompleksu PRC2 i PRC4; ang. Polycomb Repressive Complex 2.4) metyluj¹c Lys26 wspomnianego wariantu (H1.4K26me2). Okaza³o siê, e ta metylacja, poprzedzona deacetylacj¹ Lys26, umo liwia wi¹zanie siê H1.4 z bia³kiem heterochromatyny HP1 i ogranicza transkrypcjê chromatyny. Ponadto przedstawiono wyniki wskazuj¹ce, e fosforylacja s¹siaduj¹cej Ser27 w H1.4 os³abia wi¹zanie HP1 [13]. W 2010 roku doniesiono, e spoœród kilkunastu metylotransferaz enzymy G9a i Glp1 dokonuj¹ metylacji zarówno in vivo, jak i in vitro g³ównie C-koñcowych ogonów histonów ³¹cznikowych [64]. G³ównymi substratami G9a/Glp1 obok H1.2 s¹ H1.3, H1.5 i H1.0. W cytowanym doniesieniu wykazano, e obydwa enzymy wykazuj¹ specyficznoœæ wariantow¹, co udokumentowano g³ównie w odniesieniu do H1.2 i H1.4, w których zmapowano miejsca metylacji. W histonie H1.2 modyfikacji tej ulega Lys187, natomiast w przypadku H1.4 potwierdzono metylacjê Lys26. Na podkreœlenie zas³uguje obserwacja, e zmetylowany wariant H1.4 rekrutuje cz¹steczki bia³ka HP1, natomiast zmodyfikowany H1.2 nie wykazuje takiej zdolnoœci. Chocia na aktualnym etapie badañ trudno interpretowaæ znaczenie przedstawionych wyników (poza zmian¹ struktury chromatyny), to zapewne ugruntowuj¹ one pogl¹d o odrêbnoœci funkcjonalnej wariantów H1. Przyjmuje siê, e histony ³¹cznikowe odpowiadaj¹ za przestrzenne u³o enie nukleosomów i u³atwiaj¹ osi¹ganie przez chromatynê struktury wy szego rzêdu, która cechuje opornoœæ na dzia³anie nukleaz [33]. Warianty histonu H1 blokuj¹ dostêp czynnikom transkrypcyjnym, polimerazie RNA II do DNA. Podkreœla siê, e mog¹ uczestniczyæ w regulacji aktywnoœci genów i ró nych procesach komórkowych, takich jak: proliferacja, starzenie czy apoptoza [8,17,26,36,46,54].

8 72 A. BOROWIAK, Z. M. KILIAÑSKA 2. ROLA WARIANTÓW HISTONU H1 W CYKLU KOMÓRKOWYM I REGULACJI EKSPRESJI GENÓW Poziom i sk³ad histonów ³¹cznikowych zmienia siê podczas rozwoju embrionalnego i ró nicowania komórek [30]. Wzrost poziomu ekspresji genów koduj¹cych warianty histonu H1 negatywnie reguluje aktywnoœæ chromatyny [54]. Wyniki doœwiadczeñ sugeruj¹, e poszczególne podtypy H1 mog¹ pe³niæ ró ne funkcje w regulacji ekspresji genów i wzroœcie komórek [1,4,8]. Znaczny spadek ekspresji podtypów histonu H1 mo e drastycznie wp³ywaæ na prze ycie niektórych organizmów. Przypuszcza siê tak e, e wyciszenie ekspresji jednego z podtypów mo e byæ kompensowane przez zmiany ekspresji pozosta³ych [15,17,39]. Opublikowane blisko dekadê temu wyniki badañ zespo³u Skoultchiego [15,16] wskazywa³y, e pozbawienie myszy jednego b¹dÿ dwóch wariantów H1 nie powoduje wiêkszych zmian fenotypowych, dziêki zjawisku kompensacji przez inne podtypy tego histonu. Natomiast usuniêcie trzech g³ównych wariantów H1, tj. H1c, H1d i H1e, skutkuje spadkiem ok. 50% puli H1, powoduj¹c efekt letalny (œmieræ 10-dniowych zarodków myszy). Ponadto, zaobserwowano zmiany w modyfikacjach histonów rdzeniowych. Brak H1 zmienia dramatycznie strukturê chromatyny, w tym lokalne zmniejszenie jej upakowania, a tak e ograniczenie niektórych modyfikacji histonów rdzeniowych, np. 4-krotny spadek acetylacji Lys 12 w histonie H4 i 2-krotne ograniczenie trimetylacji Lys 27 w histonie H3. Pomimo zmian w komórkach pozbawionych opisywanych wariantów H1, dziêki zjawisku kompensacji tylko niewielka liczba genów zmienia swoj¹ ekspresjê. Odbiciem tych zmian i zaburzeñ regulacji genów jest metylacja DNA, dziêki której specyficzne regiony CpG ulegaj¹ tej modyfikacji [17]. Wykazano równie, e H1.2 specyficznie zmienia organizacjê chromatyny i u³o enie nukleosomów (ang. spacing) [9,26]. W mysich macierzystych komórkach embrionalnych pozbawionych H1.2 zmniejsza siê upakowanie chromatyny, w porównaniu z innymi podtypami histonu ³¹cznikowego. Spadek ekspresji H1.2 mo e byæ czêœciowo rekompensowany przez zmniejszenie upakowania nukleosomów wyra one wartoœci¹ NRL (ang. Nucleosome Repeat Length) z ok. 185 do 174 pnt. Uzupe³nienie brakuj¹cego wariantu H1.2 przez jego rekombinant umo liwia powrót do kontrolnego stanu upakowania nukleosomów [54,67]. Wyciszenie ekspresji genu przez shrna (ang. short hairpin RNA), z wykluczeniem kolejnych wariantów H1 w ludzkich komórkach raka piersi linii T47D, pozwoli³o stwierdziæ, e ograniczenie ekspresji pojedynczych podtypów H1 nie wp³ywa istotnie na poziom pozosta³ych. Kolejne doœwiadczenia ujawni³y, e podczas wyciszania i ograniczania skutków kompensacji poszczególnych wariantów H1, g³ównie H1.2 i H1.4, zmianom ekspresji ulega³y ró ne geny [54]. Interesuj¹cy wydaje siê fakt, e spadek poziomu histonu H1.2 przyczynia³ siê do zatrzymania ludzkich komórek nowotworowych raka piersi linii T47D (komórki pozbawione ekspresji p53), traktowanych doksocyklin¹, w fazie G 1 cyklu komórkowego. Natomiast w przypadku komórek raka piersi linii MCF7 (komórki z ekspresj¹ p53) nie wyst¹pi³o zatrzymanie komórek w fazie G 1, ale sta³y siê one bardziej wra liwe na apoptozê. Ponadto wyka-

9 HISTON H1.2 PRZEDSTAWICIEL HISTONÓW CZNIKOWYCH 73 zano, e brak H1.2 powoduje zmiany w ekspresji ok. 70 genów, zaanga owanych w przebieg i regulacjê cyklu komórkowego, replikacjê oraz regulacjê struktury chromatyny, m.in. spadek ekspresji genów koduj¹cych Cdc2 (ang. Cell division cycle 2), Cdk2, PCNA (ang. Proliferation Cell Nuclear Antigen) czy bia³ek MCM (ang. Minichromosome Maintenance), których nie obserwowano w komórkach prawid- ³owych [54]. Przypuszcza siê, e aktywnoœæ poszczególnych wariantów H1 zale y od ich poziomu oraz od typu analizowanych komórek/tkanek. Odnotowano na przyk³ad, e w komórkach raka szyjki macicy HeLa, histon H1.2 stanowi ok. 50% z wszystkich podtypów H1, równie w komórkach HEK293T (ang. Human Embryonic Kidney) wystêpuje on w du ym stê eniu. Mo na przypuszczaæ, e spadek zawartoœci tego bia³ka mo e znacz¹co wp³ywaæ na przebieg cyklu komórkowego czy regulacjê genów w opisywanych komórkach. Doniesiono, e podtyp H1.2 wchodzi w sk³ad kompleksu hamuj¹cego p53-zale n¹ transkrypcjê w komórkach HeLa [32]. Warianty H1 wymagaj¹ do swojej aktywnoœci interakcji z innymi bia³kami wi¹ ¹cymi DNA lub z kofaktorami, tak jak opisano w przypadku Msx1 (ang. Msh homeo box homolog 1), Baf (ang. Barrier to autointegration factor 1), SirT1 (ang. Silent information regulator (Sir2)-like family deacetylase), HP1 (ang. Heterochromatin Protein-1) czy DFF40/CAD. Wykazano, e H1.2 wchodzi w sk³ad kompleksu hamuj¹cego zale n¹ od p53 acetylacjê chromatyny. Czynniki PURa (ang. Purinerich single-stranded DNA protein a) i YB1 (ang. Y-box Binding protein) koordynuj¹ aktywnoœæ H1.2 jako represora i mog¹ wi¹zaæ siê zarówno do tego histonu, jak i do p53. Ponadto zaobserwowano, e polimeraza poli(adp-rybozy)1 PARP1 (ang. Polymerase poly (ADP-ribose)1) mo e oddzia³ywaæ z H1.2 i z p53, przez co u³atwia interakcjê pomiêdzy tymi cz¹steczkami [32]. Powszechnie wiadomo, e histony ³¹cznikowe funkcjonuj¹ jako represory transkrypcji, ale przypuszcza siê, e poszczególne podtypy mog¹ dzia³aæ odmiennie i tylko na wybrane geny. Badania in vitro przeprowadzone na modelu mysich komórek raka piersi wskazuj¹, e nadekspresja wariantów H1.0 i H1.2 wp³ywa na wzrost guza nowotworowego indukowanego zarówno hormonalnie, jak i wywo³anego wirusem MMTV 9 (ang. Mouse Mammary Tumor Virus 9) [23]. Wœród obserwowanych zmian wydaje siê, e w przebudowie (ang. remodeling) regionu promotorowego MMTV w odpowiedzi na progesteron uczestniczy H1. Zdarzeniem inicjuj¹cym wi¹zanie receptora progesteronu (PR) do sekwencji HREs (ang. Hormone Response Elements) jest fosforylacja H1. Dziêki niej dochodzi do rekrutacji kompleksu Nurf (ang. Nucleosome remodeling factor) do regionu promotorowego, co umo liwia przebudowê chromatyny i struktury rdzenia nukleosomu. Te zmiany czyni¹ DNA bardziej dostêpnym dla czynnika NF-1 (ang. Nuclear Factor-1) i innych regulatorów PR. W kolejnym etapie, H1 opuszcza promotor, co inicjuje transkrypcjê. Nieufosforylowana forma tego histonu, w przeciwieñstwie do ufosforylowanej, hamuje g³ówne bia³ka kompleksu przebudowuj¹cego chromatynê [37]. D³ugotrwa³e i rozleg³e uszkodzenia DNA mog¹ w konsekwencji prowadziæ do zmian nowotworowych. Przed takimi zmianami komórka broni siê wykorzystuj¹c ró ne mechanizmy naprawy (np. udzia³ polipeptydu p53), które utrzymuj¹ stabilnoœæ genów. Jednak e organizmy wy sze cechuje nadwy ka w liczbie powstaj¹cych

10 74 A. BOROWIAK, Z. M. KILIAÑSKA komórek, st¹d alternatywnym i pewniejszym sposobem jest eliminacja komórek z uszkodzonym DNA na szlaku apoptozy. W tym kontekœcie na uwagê zas³uguj¹ doniesienia o roli wariantu H1.2 w apoptozie, wywo³anej uszkodzeniami DNA [36]. Dotychczasowe dane wskazuj¹, e histon H1.2 uczestniczy w przebiegu apoptozy, g³ównie na szlaku mitochondrialnym. 3. SZLAK MITOCHONDRIALNY APOPTOZY Komórki apoptotyczne wykazuj¹ charakterystyczne zmiany morfologiczne i biochemiczne, do których zalicza siê m.in. obkurczanie komórek, degradacjê DNA i kondensacjê chromatyny, spadek potencja³u b³on mitochondriów i wyp³yw bia³ek z przestrzeni mitochondrialnej. W przebiegu wewnêtrznego/mitochondrialnego szlaku apoptozy dochodzi do aktywacji kaspaz i kalpain, indukowanych np. zmian¹ poziomu jonów wapnia, stresem, uszkodzeniami DNA, zmianami poziomu Ca 2+, RFT czy niektórymi lekami [31]. Aktywacja kaspaz w apoptozie zachodzi kaskadowo, czyli kolejne prokaspazy s¹ indukowane przez aktywne ju proteazy. Pierwsze w mechanizmie kaskady funkcjonuj¹ kaspazy inicjatorowe: -2, -8, -9, -10, a nastêpnie kaspazy wykonawcze: -3, -6 i -7, których szlaki przecinaj¹ siê, a nawet ³¹cz¹ ze szlakami sygnalizacyjnymi z udzia³em kalpain. W odpowiedzi na sygna³ œmierci proapoptotyczne bia³ka rodziny Bcl-2 (B-cell leukemia/lymphoma-2), które mog¹ stanowiæ sk³adniki b³on mitochondrialnych, np. Bak (ang. Bcl-2 antagonist/killer) b¹dÿ rekrutowane z cytosolu, np. Bax (ang. Bcl-2 associated X protein), Bim (ang. Bcl-2 interacting mediator of cell death), Bid (ang. BH3 interacting domain death agonist) czy Bad (ang. Bcl-2 antagonist of cell death), aktywuj¹ mitochondria. Przeorganizowanie struktury mitochondriów powoduje zmiany przepuszczalnoœci ich zewnêtrznych b³on, umo liwiaj¹c wyp³yw czynników apoptotycznych, np. cytochromu c, AIF (ang. Apoptosis inducing factor) czy endonukleazy G do cytoplazmy. Obecnoœæ inhibitorów apoptozy bia³ek Bcl-2 i Bcl- XL (ang. Bcl-x protein long isoform) zapobiega tym zdarzeniom [6,11]. Przemieszczenie czynników apoptogennych z mitochondriów do cytosolu powoduje aktywacjê prokaspazy-9, która wraz z cytochromem c i bia³kiem adaptorowym Apaf-1 (ang. Apoptotic protease activating factor-1) formuj¹ apoptosom. Ostatnim etapem jest aktywacja proteaz wykonawczych prokaspaz-3 i -7 [31]. Cz³onkowie rodziny Bcl-2 reprezentuj¹ g³ówne regulatory wydarzeñ na szlaku mitochondrialnym, cechuje je obecnoœæ od 1 do 4 domen homologii BH (ang. Bcl-2 homology). Przedstawicieli tej rodziny zalicza siê do trzech podrodzin: 1) antyapoptotyczne wielodomenowe bia³ka: np. Bcl-2, Bcl-X L i Mcl-1 (ang. Myeloid cell leukemia-1); 2) proapoptotyczne wielodomenowe cz¹steczki z homologicznymi domenami BH1, BH2 i BH3, takie jak: Bax i Bak; 3) proapoptotyczne bia³ka z pojedyncz¹ domen¹ BH opisywan¹ jako BH3 (tzw. BH3-only), m.in.: Bid, Bim, Puma (ang. p53 upregulated modulator of apoptosis), Bad czy Noxa. W ywych komórkach bia³ka Bak i Bax wystêpuj¹ jako monomery, natomiast po otrzymaniu

11 HISTON H1.2 PRZEDSTAWICIEL HISTONÓW CZNIKOWYCH 75 sygna³u œmierci, dochodzi do zmian konformacyjnych, ich nastêpczej oligomeryzacji i wbudowania do zewnêtrznej b³ony mitochondrialnej. Wykazano, e komórki pozbawione tych dwóch bia³ek proapoptotycznych rodziny Bcl-2 s¹ oporne na zwi¹zki przeciwnowotworowe [33,46,49,52]. 4. H1.2 A APOPTOZA W 2003 roku Konishi i wsp. [36] jako pierwsi opublikowali w czasopiœmie Cell wyniki doœwiadczeñ wskazuj¹ce, e wariant H1.2 uczestniczy w uwalnianiu cytochromu c z mitochondriów kilku tkanek gryzoni oraz linii komórkowych po ekspozycji na promieniowanie X i ró ne czynniki uszkadzaj¹ce DNA. Badania te wykaza³y, e zarówno komórki nowotworowe MCF7, jak i tymocyty szczurze pozbawione opisywanego wariantu H1 cechuje prze ywalnoœæ i opornoœæ na apoptozê indukowan¹ promieniowaniem X wy sza w porównaniu z komórkami zawieraj¹cymi gen koduj¹cy ten wariant H1. Eliminacja H1.2 nie hamuje mo liwych szlaków apoptotycznych, poniewa mo e dochodziæ do aktywacji innych czynników, jak np. Bax czy Bid. Rola tych polipeptydów w œmierci programowanej indukowanej translokacj¹ opisywanego wariantu H1 jest nieznaczna. W mysich komórkach jelita cienkiego, w których nie potwierdzono aktywnoœci bia³ka Bax w wyniku wyp³ywu H1.2 indukowanego promieniowaniem X, odnotowano proteolizê laminy B1 oraz aktywacjê endonukleazy DFF40/CAD i prokaspazy-3. Natomiast komórki pozbawione tego histonu wykazywa³y siln¹ opornoœæ na zastosowany czynnik genotoksyczny. Komórki MCF7 zarówno z funkcjonalnym genem H1.2, jak i pozbawione jego ekspresji traktowane UV, a tak e paklitakselem i czynnikiem TNF-a (ang. Tumor Necrosis Factor-a) wykazywa³y zbli ony stopieñ indukcji apoptozy i uwalniania cytochromu c. Kolejne doniesienia potwierdzi³y wyp³yw H1.2 z j¹dra komórkowego do cytoplazmy po ekspozycji ludzkich komórek nowotworowych SCCTF (ang. Squamous Carcinoma Cell Line) na zwi¹zek genotoksyczny bleomycynê [46]. Okaza³o siê, e w komórkach nowotworowych, w których odnotowano spadek wra liwoœci na czynniki przeciwnowotworowe, wystêpuje niski poziom czynników apoptogennych w mitochondriach oraz zmniejszenie ekspresji podtypu H1.2 [36]. Wykazano, e w immortalizowanych komórkach MEF (ang. Mouse Embryonic Fibroblast) eksponowanych na promieniowanie UV wariant H1.2 mo e funkcjonowaæ jako regulator powstawania apoptosomu i aktywnoœci prokaspazy-3 i -7 [53]. W ekstraktach komórek pozbawionych bia³ka Apaf-1 i kaspazy-9 histon H1.2 nie okazywa³ zdolnoœci aktywacji kaspaz wykonawczych. Sugeruje siê, e wariant H1.2 w cytoplazmie wi¹ e siê do domeny CARD (ang. Caspase Recruitment Domain) prokaspazy-9 i bia³ka Apaf-1 oraz przyczynia siê do wyp³ywu cytochromu c z nastêpczym utworzeniem apoptosomu. Ta aktywnoœæ histonu H1.2 wymaga nak³adu energii pochodz¹cej z hydrolizy ATP [53]. Natomiast w komórkach MEF pozbawionych genu Apaf-1, promieniowanie X indukuje wyp³yw H1 z j¹dra komórkowego,

12 76 A. BOROWIAK, Z. M. KILIAÑSKA w podobnym stopniu, jak w komórkach MEF z funkcjonalnym genem Apaf-1, to wskazuje, e translokacja tego histonu poprzedza aktywacjê kaspaz [36]. Ponadto obserwowano, e wyp³yw H1.2 poprzedza proteolizê markera apoptozy PARP1, co sugeruje, e jego aktywnoœæ zwi¹zana jest z kaspazo-zale nym mechanizmem œmierci programowanej komórek CLL [20]. Zastosowanie w opisanych doœwiadczeniach inhibitorów kaspaz: (Ac-Tyr-Val-Lys(biotynylo)-Asp-formyloketon) i Z-VAD (N-benzyloksykarbonylo-Val-Ala-Asp-fluorometyloketon) sugeruje, e translokacja H1.2 poprzedza aktywacjê kaspaz [20,36,53] Oddzia³ywanie H1.2 z bia³kiem Bak Obecnie uwa a siê, e istotê sposobu funkcjonowania H1.2 stanowi jego oddzia- ³ywanie z proapoptotycznymi bia³kami rodziny Bcl-2 i/lub z zewnêtrzn¹ b³on¹ mitochondrialn¹. Aktywnoœæ H1.2 badano w mitochondriach wyizolowanych z w¹troby szczura oraz tymocytów szczurzych, poddanych promieniowaniu X [36]. Okaza³o siê, e bia³ko Bax, w przeciwieñstwie do Bak, nie jest istotne w sygnalizacji apoptotycznej z udzia³em tego histonu. Zarówno komórki pozbawione Bax, jak i te z funkcjonalnym genem s¹ w takim samym stopniu wra liwe na dzia³anie czynnika genotoksycznego. Natomiast wyniki immunofluorescencji z zastosowaniem przeciwcia³ rozpoznaj¹cych aktywny Bak wskazuj¹, e rekombinowany wariant H1.2 wywo³uje, w sposób zale ny od stê enia, oligomeryzacjê tego bia³ka proapoptotycznego. Ponadto zaobserwowano, e mitochondria wydzielone z mysich komórek z deficytem polipeptydów Bak i Bax pozostawa³y niewra liwe na obecnoœæ H1.2 poni ej stê enia 50 mg/ml. Jednak wy szy poziom tego wariantu H1 w komórkach indukowa³ wyp³yw cytochromu c w sposób niezale ny od oligomeryzacji bia³ka Bak [36]. Stwierdzono tak e, e komórki nowotworowe, które cechuje niska ekspresja proapoptotycznych bia³ek Bak i Bax [33,49,52] oraz brak histonu H1.2 (w cytosolu) s¹ bardziej oporne na zwi¹zki przeciwnowotworowe [18,36,46]. Obserwacje te sugeruj¹, e aktywacja cz¹steczek Bak jest nieodzowna do wyp³ywu cytochromu c. Wydaje siê, e poznanie regionu domeny H1.2 wi¹ ¹cej bia³ko Bak mo e przyczyniæ siê do wyjaœnienia roli tego czynnika w apoptozie p53 a wyp³yw H1.2 Okaza³o siê, e ekspozycja tymocytów myszy z ekspresj¹ p53 lub z czêœciow¹ b¹dÿ ca³kowit¹ delecj¹ tego genu na promieniowanie X, prowadzi do indukcji apoptozy tylko w dwóch pierwszych modelach doœwiadczalnych [36]. W komórkach pozbawionych genu p53 nie wykazano wyp³ywu czynników mitochondrialnych ani aktywacji kaspaz, a tak e nie odnotowano wzrostu poziomu H1.2 w cytosolu. Obserwacje te sugeruj¹, e bia³ko p53 mo e indukowaæ translokacjê histonu ³¹cznikowego tylko w wyniku dzia³ania niektórych czynników genotoksycznych. Zak³ada siê, e H1.2 odgrywa znacz¹c¹ rolê w przekazywaniu sygna³u do mitochondriów w komórkach traktowanych czynnikami generuj¹cymi DBSs. Wydaje siê, e jego translokacji nie wywo³uj¹ TNF-a, staurosporyna, cykloheksymid, paklitaksel czy UV. Analiza komórek MCF7, transfekowanych wektorami z funkcjonalnym H1.2

13 HISTON H1.2 PRZEDSTAWICIEL HISTONÓW CZNIKOWYCH 77 i antysensowymi RNA H1.2, które nastêpnie naœwietlano promieniami X, dowiod³a, e wyp³yw cytochromu c z mitochondriów obserwuje siê tylko w przypadku komórek, w których dochodzi do translokacji H1.2 do cytosolu. Ponadto odnotowano, e ekspresja genów regulowanych przez p53, jak np: p21, Bax, Perp i Puma, nie ró ni siê pomiêdzy opisywanymi komórkami. Na podstawie tych spostrze eñ zasugerowano, e w apoptozie indukowanej promieniowaniem X wyp³yw czynników mitochondrialnych zale y od translokacji H1.2, którego poziom wydaje siê zale eæ od aktywnoœci p53 [36]. Wyniki opublikowanych ostatnio doœwiadczeñ ujawni³y, e zarówno czynniki genotoksyczne (fludarabina, mitoksantron, etopozyd czy promieniowanie X), jak i niegenotoksyczny (deksametazon) mog¹ wywo³ywaæ wyp³yw j¹drowego H1.2 w komórkach przewlek³ej bia³aczki limfocytowej CLL (ang. Chronic Lymphocytic Leukemia). Pierwsze indukuj¹ przemieszczenie opisywanego histonu z j¹dra komórkowego do cytosolu tylko w przypadku funkcjonalnego genu p53. Natomiast deksametazon, zwi¹zek, który nie powoduje uszkodzeñ DNA, mo e równie przyczyniaæ siê do translokacji H1.2, niezale nie od statusu produktu genu supresorowego [20]. Dowiedziono równie, e delecja genu (11q ) koduj¹cego kinazê ATM (ang. Ataxia Telangiectasia Mutated), która fosforyluje m.in. p53 czy histon H2AX (marker DSBs) nie wp³ywa na przemieszczenie histonu H1.2 z j¹dra komórkowego do cytosolu. W wyniku spontanicznej apoptozy w komórkach CLL mo e dochodziæ do niewielkiego wyp³ywu histonu H1.2, który mo e zale eæ od aktywnoœci bia³ka p53 [7,20]. Zaobserwowano, e u chorych na CLL wyp³yw H1.2 koreluje z obecnoœci¹ zaburzeñ genetycznych oraz pozytywn¹ odpowiedzi¹ na zastosowany zwi¹zek przeciwnowotworowy. Ekspozycja komórek CLL (z delecj¹ genu p53) na czynniki genotoksyczne ujawni³a, e wykazuj¹ one ni szy poziom translokacji H1.2, w porównaniu z komórkami o kariotypie prawid³owym czy z delecj¹ ATM. Brak przemieszczania siê tego wariantu z j¹dra komórkowego do cytosolu, pomimo spadku prze ywalnoœci komórek bia³aczkowych i proteolitycznego ciêcia PARP1 po ich traktowaniu deksametazonem, przemawia za uruchamianiem innych szlaków apoptotycznych, np. z udzia³em Bax czy Bid. W opisywanym przypadku 80% stanowi³y komórki CLL z delecj¹ 17p13, st¹d mo na przypuszczaæ, e po nabyciu przez komórki bia³aczkowe opornoœci na zwi¹zki genotoksyczne, to leki niegenotoksyczne mog¹ okazaæ siê wysoce skutecznym induktorem apoptozy. W tym kontekœcie istotne wydaj¹ siê wyniki doœwiadczeñ z u yciem czynników indukuj¹cych apoptozê, niezale nie od statusu bia³ka p53. W tych przypadkach obserwowano wyp³yw tego wariantu H1 w przypadku zarówno komórek z del 17p13, jak i z prawid³owym kariotypem. Okaza³o siê, e komórki CLL z delecj¹ genu ATM oraz z funkcjonalnym genem wykazuj¹ podobny odsetek wyp³ywu histonu H1.2 i zbli ony spadek prze ywalnoœci zarówno po ich ekspozycji na leki genotoksyczne, niegenotoksyczny deksametazon, jak i podczas ich spontanicznej apoptozy. Wydaje siê, e wyp³yw opisywanego wariantu H1 nie zale y od aktywnoœci kinazy ATM, a dane kliniczne potwierdzaj¹, e mimo zale noœci i wspólnego przebiegu œcie ek sygnalizacyjnych z udzia³em bia³ek ATM i p53, u czêœci chorych na CLL wyniki terapii nie s¹ to same [20].

14 78 A. BOROWIAK, Z. M. KILIAÑSKA 4.3. H1.2 a przepuszczalnoœæ b³on mitochondrialnych Apoptogenne w³aœciwoœci H1.2 przypisuje siê m.in. trójwymiarowej strukturze i dodatniemu ³adunkowi charakteryzuj¹cymi to bia³ko [63]. Analizy chemiczne ujawni³y, e poziom fosfatydyloseryny (PS) wzrasta 3-krotnie w zewnêtrznej b³onie komórek nowotworowych w porównaniu z ich prawid³owym odpowiednikiem. Wydaje siê, e mo liwoœæ ograniczenia wzrostu komórek ulegaj¹cych transformacji nowotworowej mo e wynikaæ z adsorpcji zasadowych bia³ek do ujemnie na³adowanych cz¹steczek PS zewnêtrznej warstwy b³ony komórkowej. St¹d mo e dochodziæ do integracji miêdzy zasadowymi przedstawicielami rodziny H1 a b³on¹ mitochondriów. Prawdopodobnie opisywany wariant H1 mo e byæ w³¹czony w mitochondrialny szlak apoptozy, na którym dochodzi do uwalniania cytochromu c z mitochondriów. Wykazano, e komórki bia³aczkowe linii K562, HL60, SKW3, a tak e ludzkie limfocyty poddane elektroporacji w obecnoœci kilku bia³ek zasadowych (cytochrom c, ca³kowity histon H1, metylowana albumina) ulegaj¹ apoptotycznej œmierci potwierdzonej fragmentacj¹ DNA. Wyniki doœwiadczeñ przeprowadzonych na wyizolowanych mitochondriach w¹troby szczura potwierdzi³y, e wyp³yw cytochromu c i innych bia³ek proapoptotycznych z tych organelli przebiega przy ich wysokim stanie energetycznym i zaburzeniu ujemnie na³adowanej, zewnêtrznej b³ony mitochondrialnej. Wydaje siê, e odmienne roz³o enie ³adunków elektrycznych w b³onach komórek umieraj¹cych na szlaku apoptozy mo e byæ spowodowane obecnoœci¹ dodatnio na³adowanych bia³ek, takich jak np. histony ³¹cznikowe H1, które wi¹ ¹ siê z zewnêtrzn¹ b³on¹ mitochondriów i/lub oddzia³uj¹ z cz¹steczkami usytuowanymi w tej b³onie [63]. W komórkach apoptotycznych odnotowano równie zwiêkszony wyp³yw cytochromu c z mitochondriów, które osi¹gaj¹ wy szy stan energetyczny, wynikaj¹cy m.in. ze wzrostu ³adunków ujemnych na powierzchni ich zewnêtrznej b³ony. Okreœlono równie, e w zewnêtrznej b³onie mitochondriów mo e pojawiaæ siê nawet ok. 23% ogólnej mitochondrialnej puli kardiolipiny, która jest g³ównie sk³adnikiem wewnêtrznej b³ony tych struktur i nadaje powierzchni ³adunek ujemny. Przypuszcza siê, e dodatnio na³adowany histon ³¹cznikowy H1 silnie wi¹ e siê z ujemnie na³adowan¹ zewnêtrzn¹ powierzchni¹ mitochondriów, u³atwiaj¹c wyp³yw czynników apoptogennych. Ponadto oddzia³ywanie H1 z ujemn¹ powierzchni¹ tych organelli wydaje siê byæ silniejsze ni cytochromu c, co umo liwia uwalnianie tego bia³ka z mitochondriów do cytosolu. Indukcjê apoptozy zwi¹zan¹ z obecnoœci¹ histonu H1 odnotowano tylko w komórkach bia³aczkowych, limfocyty zdrowych dawców nie ulega³y apoptozie w obecnoœci egzogennego H1 bez indukowania mitochondriów przez impulsy elektryczne. Zak³ada siê, e wzrost asymetrii ³adunków na powierzchni b³on mitochondrialnych prowadzi do ich reorganizacji i mo e indukowaæ apoptozê komórek nowotworowych [63]. Konishi i wsp. [36] wykazali, e opisywany histon nie indukuje charakterystycznych dla apoptozy zmian w megakana³ach MPTP (ang. Mitochondria Permeability Transition Pore), tj. nie powoduje spadku potencja³u b³on mitochondrialnych DY. Doœwiadczenia, w których u yto dwóch inhibitorów formowania kana³ów PT cyklosporyny A i EGTA, dowodz¹, e obecny w cytosolu H1.2 indukuje wyp³yw cytochromu c z mitochondriów niezale nie od megakana³ów i zmian potencja³u b³on mitochondrialnych.

15 HISTON H1.2 PRZEDSTAWICIEL HISTONÓW CZNIKOWYCH 79 Jak dot¹d zaproponowano kilka hipotez dotycz¹cych mechanizmów indukcji zmian w przepuszczalnoœci zewnêtrznej b³ony mitochondriów. Utrata integralnoœci b³on mitochondrialnych mo e byæ wynikiem przemieszczenia wbudowanych bia³ek i zaburzeniem ich potencja³u. W wyniku tych zmian dochodzi do powstawania porów i kana³ów, dziêki którym mo liwy jest wyp³yw ma³ocz¹steczkowych polipeptydów, w tym cytochromu c z przestrzeni miêdzyb³onowej mitochondriów do cytosolu [11, 31]. Regiony odcinków a-helikalnych H1.2 s¹ silnie zasadowe, dlatego uwa a siê, e mog¹ oddzia- ³ywaæ z ujemnie na³adowanymi fosfolipidami i powodowaæ zmiany w rozmiesz-czeniu ³adunku na powierzchni b³on, indukuj¹c apoptozê. Przyjmuje siê, e wyp³yw cytochromu c jest mo liwy dziêki interakcji miêdzy histonem H1.2 i bia³kiem Bak. Oddzia³ywanie tych polipeptydów mo e byæ bezpoœrednie i/lub poœrednie, poniewa histon ten mo e wp³ywaæ na rozmieszczenie lipidów w b³onach mitochondriów i w ten sposób poœrednio aktywuje proapoptotyczne bia³ko Bak [36,46,63] Oddzia³ywanie H1.2 z endonukleaz¹ DFF40/CAD Inna hipoteza zak³ada, e podczas apoptozy histon H1 oddzia³uje z endonukleaz¹ DFF40/CAD, co u³atwia wi¹zanie tego enzymu do DNA i skutkuje jego aktywacj¹ [45, 65]. Dowiedziono, e niektóre podtypy histonu ³¹cznikowego wraz z bia³kami niehistonowymi HMGB1/2 (ang. High Mobility Group Box1/2) rekrutuj¹ DFF40 do ³¹cznikowego DNA i wzmagaj¹ aktywnoœæ tej endonukleazy. Z opublikowanych doniesieñ wynika, e H1 jest niezbêdny do aktywacji DFF40/CAD w komórkach ostrej bia³aczki promielocytowej linii NB4 podczas ich apoptozy indukowanej trichostatyn¹ A [45]. Analiza piêciu somatycznych podtypów histonów ³¹cznikowych wykaza³a, e cechuje je ró ne powinowactwo do hetero-, jak i euchromatyny. Okaza³o siê, e cz¹steczki endonukleazy oddzia³uj¹ z analizowanymi podtypami H1 w ywych komórkach, natomiast podczas apoptozy preferuj¹ tylko niektóre z nich. Enzym DFF40/ CAD w kompleksie z jego regulatorem/inhibitorem, tj. DFF40-DFF45 wystêpuj¹ w j¹drze komórkowym zarówno w komórkach yj¹cych, jak i apoptotycznych. Uznaje siê, e dopiero po uzyskaniu sygna³u do apoptozy dochodzi do proteolitycznego odciêcia DFF45 z opisywanego heterodimeru przez kaspazê-3. Za oddzia³ywanie miêdzy histonami ³¹cznikowymi a DFF40/CAD odpowiada ich C-koñcowa domena [45,61,65]. Aktualnie akceptuje siê, e przemieszczenie H1.2 z j¹dra komórkowego do mitochondriów ma g³êboki sens biologiczny, gdy organelle te odgrywaj¹ kluczow¹ rolê w sygnalizacji apoptotycznej komórek nowotworowych traktowanych lekami zarówno genotoksycznymi, jak i niegenotoksycznymi [20]. 5. WYP YW H1.2 Z J DRA KOMÓRKOWEGO DO CYTOSOLU Powszechnie wiadomo, e podtyp H1.2 w komórkach yj¹cych wystêpuje na terenie j¹dra komórkowego, z wyj¹tkiem mitozy, podczas której niewielk¹ iloœæ tego bia³ka wykrywa siê w cytoplazmie. Jak dot¹d mechanizm translokacji tego wariantu H1 z j¹dra komórkowego do cytosolu jest s³abo poznany.

16 80 A. BOROWIAK, Z. M. KILIAÑSKA Ostatnio Green i wsp. [22] opisali ró nice w translokacji poszczególnych podtypów H1 podczas mitozy fibroblastów cz³owieka. Podczas cyklu komórkowego wœród badanych histonów ³¹cznikowych z najwy sz¹ efektywnoœci¹ przemieszczeniu miêdzy j¹drem komórkowym a cytosolem ulega H1.2. Ekspresjê tego wariantu H1 potwierdzono w j¹drze komórkowym podczas profazy, a nastêpnie w metafazie i wczesnej anafazie obserwowano ca³kowity jego wyp³yw do cytoplazmy. Z kolei w póÿnej anafazie obecnoœæ H1.2 odnotowano w obu przedzia³ach komórkowych, natomiast w telofazie wy³¹cznie w j¹drze komórkowym [22]. Ró nice miêdzy poszczególnymi podtypami H1 dotycz¹ tak e powinowactwa do chromatynowego DNA [19,48]. Wykorzystuj¹c jako model fibroblasty cz³owieka wykazano, e powinowactwo H1.2 do chromatyny spada podczas mitozy, czemu towarzyszy pojawienie siê ufosforylowanej formy H1.2 w cytoplazmie. Fosforylacjê H1.2 katalizuje kinaza Cdk2 i przypuszcza siê, e ta modyfikacja poprzedza jego dysocjacjê od DNA [5,12,25]. Podczas fazy G 1 fosforylacja opisywanego H1 jest bardzo niska; najwy szy jej poziom wystêpuje w czasie mitozy, co wi¹ e siê z kondensacj¹ chromatyny. Uwa a siê, e wyp³yw histonu H1.2 podczas mitozy u³atwia zmianê struktury chromatyny b¹dÿ represjê transkrypcji poprzez umo liwienie dostêpu do DNA czynnikom kondensacji lub inhibitorom transkrypcji [22,51,59]. Jednak wyniki badañ sugeruj¹, e translokacja H1.2 nie jest wymagana do kondensacji chromatyny. Wyizolowany H1 z komórek bêd¹cych w fazie mitozy wykazuje s³ab¹ aktywnoœæ apoptotyczn¹. Ponadto wyp³yw tego bia³ka z j¹dra komórkowego do cytosolu podczas fazy G 2 i mitozy nie powoduje uszkodzeñ mitochondriów, dlatego zak³ada siê, e poziom H1 nie jest wystarczaj¹cy b¹dÿ ufosforylowana forma tego histonu traci aktywnoœæ proapoptotyczn¹ [36]. W oddzia³ywaniu H1.2 na szlaku mitochondrialnym apoptozy mo e okazaæ siê wa na obserwacja, e histon ten jako jedyny wœród wariantów H1 nie zawiera w C-koñcowej domenie sekwencji KXXXPP [36,61]. Obecnoœæ w cytosolu wariantu H1.2 podczas apoptozy mo na t³umaczyæ translokacj¹ b¹dÿ wzrostem jego ekspresji i/lub zak³óceniem jego transportu. Przeprowadzono doœwiadczenia maj¹ce na celu zahamowanie j¹drowego eksportu przez zastosowanie leptomycyny B. W obecnoœci tego zwi¹zku w komórkach MCF7 z funkcjonalnym genem p53 nie odnotowano wzrostu poziomu H1 w cytosolu, po ekspozycji komórek na promieniowanie X. Okaza³o siê, e leptomycyna B skutecznie hamuje apoptozê opisywanych komórek, indukowan¹ czynnikiem wywo³uj¹cym DSBs [36]. Dodatkowo wprowadzenie rekombinowanego H1.2 do cytosolu komórek MEFs, potwierdzi³o, e egzogenny wariant histonu H1 w warunkach prawid³owych jest sprawnie transportowany do j¹dra komórkowego. Ekspozycja badanych komórek na czynnik genotoksyczny spowodowa³a ponowne przemieszczenie pewnej puli tego bia³ka. Przedstawione wyniki sugeruj¹, e obecnoœæ H1.2 w cytosolu komórek apoptotycznych nie jest zwi¹zana z wzrostem jego syntezy a z wynikiem translokacji indukowanej przez czynniki genotoksyczne. Dowiedziono równie, e w wyniku promieniowania X ogólna pula histonów H1 podczas apoptozy mysich tymocytów pozostaje sta³a [36]. Przypuszcza siê, e uszkodzenia DNA, przyczyniaj¹ siê do uwolnienia H1.2 z chromatyny, prawdopodobnie w wyniku przemodelowania struktury DNA lub uszkodzeñ wywo³uj¹cych zmiany innych sk³adników kompleksu chromatynowego.

17 HISTON H1.2 PRZEDSTAWICIEL HISTONÓW CZNIKOWYCH 81 Zmiana lokalizacji komórkowej opisywanego podtypu H1 jest procesem aktywnym i mo e byæ zale na od aktywnoœci bia³ka p53. Wykazano, e bia³ko j¹drowe p53 ulega przemieszczeniu do mitochondriów podczas apoptozy, dlatego uwa a siê, e ten produkt genu supresorowego mo e odgrywaæ bezpoœredni¹ rolê w regulacji wyp³ywu H1.2 z j¹dra komórkowego w wyniku uszkodzeñ DNA. 6. PODSUMOWANIE Dotychczas nie wyjaœniono mechanizmu translokacji histonu H1.2 z j¹dra komórkowego do cytosolu i przebiegu apoptozy z jego udzia³em w komórkach organizmów wielokomórkowych. Uwa a siê, e H1.2 promuje aktywacjê proapoptotycznego bia³ka Bak, indukuj¹c wyp³yw niektórych czynników mitochondrialnych, np. cytochromu c. Wyniki doœwiadczeñ wskazuj¹, e realizacja apoptotycznych szlaków sygnalizacyjnych mo e przebiegaæ ró nymi œcie kami, a nawet ³¹czyæ siê lub przecinaæ na pewnych etapach. Indukcja apoptozy z wyp³ywem z j¹der komórek tego podtypu histonu H1 do cytosolu zachodzi g³ównie w komórkach nowotworowych, co potwierdza równie spadek ich prze ycia wskutek egzogennego wprowadzenia H1.2. Przedstawione dot¹d wyniki badañ wskazuj¹, e uwolniony z j¹dra komórkowego do cytosolu histon H1.2 w komórkach nowotworowych mo e stanowiæ istotny czynnik dla przebiegu apoptozy (m.in. wyp³yw cytochromu c) w wyniku dzia³ania ró nych bodÿców, a nie tylko genotoksycznych, jak s¹dzono pierwotnie. Mechanizm aktywnoœci H1.2 jako apoptotycznego efektora jest wyciszony w przypadkach komórek z wysokim odsetkiem delecji 17p13. Obserwacje te mog¹ choæby czêœciowo wyjaœniaæ mechanizm lekoopornoœci komórek nowotworowych na apoptozê. Kontynuacja badañ nad w³aœciwoœciami i rol¹ H1.2 mo e w przysz³oœci usprawniæ projektowanie nowych strategii leczenia nowotworów, a histon ten mo e okazaæ siê wa nym czynnikiem wykorzystywanym w ograniczaniu lekoopornoœci. Przyjmuje siê, e doœwiadczenia in vitro nie dostarczaj¹ pe³nego obrazu szlaków sygnalizacyjnych zachodz¹cych w komórkach ywych organizmów, ale jednak stanowi¹ podstawê do badañ in vivo. Podsumowuj¹c, mo na stwierdziæ, e wiele dobrze poznanych bia³ek powszechnie wystêpuj¹cych w komórkach, takich jak opisywany wariant H1.2, odgrywa w warunkach stresu wa n¹ rolê w monitorowaniu i przekazywaniu sygna³u o uszkodzeniach oraz wykazuje nieznane jeszcze funkcje m.in. zdolnoœæ do regulacji procesów prowadz¹cych do prze ycia b¹dÿ œmierci komórek, wspó³dzia³aj¹c z takimi wa nymi czynnikami, jak produkt genu supresorowego bia³ko p53. PIŒMIENNICTWO [1] ALAMI R, FAN Y, PACK S, SONBUCHNER TM, BEESE A, LIN Q, GREALLY JM, SKOULTCHI AI, BOUHASSIRA EE. Mammalian linker-histone subtypes differentially affect gene expression in vivo. Proc Natl Acad Sci USA 2003; 100:

18 82 A. BOROWIAK, Z. M. KILIAÑSKA [2] ALBIG W, MEERGANS T, DOENECKE D. Characterization of the H1.5 gene completes the set of human H1 subtype genes. Gene 1997; 184: [3] ALEXANDROW MG, HAMLIN JL. Chromatin decondensation in S-phase involves recruitment of Cdk2 by Cdc45 and histone H1 phosphorylation. J Cell Biol 2005; 168: [4] AUSIO J. Histone variants The structure behind the function. Brief Funct Genomic Proteomic 2006; 5: [5] BAATOUT S, DERRADJI H. About histone H1 phosphorylation during mitosis. Cell Biochem Funct 2006; 24: [6] BEDNAREK J, KILIAÑSKA ZM. Bia³ka przestrzeni miêdzyb³onowej mitochondriów uczestnicz¹ce w procesie apoptozy. Post Biochem 2005; 51: [7] BELLOSILLO B. Spontaneous and drug-induced apoptosis is mediated by conformational changes of Bax and Bak in B-cell chronic lymphocytic leukemia. Blood 2002; 100: [8] BHAN S, MAY W, WARREN SL, SITTMAN DB. Global gene expression analysis reveals specific and redundant roles for H1 variants, H1c and H1(0), in gene expression regulation. Gene 2008; 414: [9] BUSTIN M, CATEZ F, LIM JH. The dynamics of histone H1 function in chromatin. Mol Cell 2005; 17: [10] CHENG G, NANDI A, CLERK S, SKOULTCHI AI. Different 3'-end processing procedures two independently regulated mrnas from a single H1 histone gene. Proc Nat Acad Sci USA 1989; 86: [11] CHIPUC JE, GREEN DR. How do BCL-2 proteins induce mitochondrial outer membrane permeabilization? Trends Cell Biol 2008; 18: [12] CONTRERAS A, HALE TK, STENOIEN DL, ROSEN JM, MANCINI MA, HERRERA RE. The dynamic mobility of histone H1 is regulated by cyclin/cdk phosphorylation. Mol Cell Biol 2003; 23: [13] DAUJAT S, ZEISSLER U, WALDMANN T, HAPPEL N, SCHNEIDER R. HP1 binds specifically to Lys26-methylated histone H1.4, whereas simultaneous Ser27 phosphorylation blocks HP1 binding. J Biol Chem 2005; 280: [14] DOENECKE D, ALBIG W, BOUTERFA H, DRABENT B. Organization and expression of H1 histone genes. J Cell Biochem 1994; 54: [15] FAN Y, SIROTKIN A, RUSSELL RG, AYALA J, SKOULTCHI AI. Individual somatic H1 subtypes are dispensable for mouse development even in mice lacking the H1(0) replacement subtype. Mol Cell Biol 2001; 21: [16] FAN Y, NIKITINA T, MORIN-KENSICKI EM, ZHAO J, MAGNUSON TR, WOODCOCK CL, SKO- ULTCHI AI. H1 linker histones are essential for mouse development and affect nucleosome spacing in vivo. Mol Cell Biol 2003; 23: [17] FAN Y, NIKITINA T, ZHAO J, FLEURY TJ, BHATTACHARYYA R, BOUHASSIRA EE, STEIN A, WOODCOCK CL, SKOULTCHI AI. Histone H1 depletion in mammals alters global chromatin structure but causes specific changes in gene regulation. Cell 2005; 123: [18] FUNAYAMA R, SAITO M, TANOBE H, ISHIKAWA F. Loss of linker histone H1 in cellular senescence. J Cell Biol 2006; 175: [19] GARCIA BA, BUSBY SA, BARBER CM, SHABANOWITZ J, ALLIS CD, HUNT DF. Characterization of phosphorylation sites on histone H1 isoforms by tandem mass spectrometry. J Proteome Res 2004; 3: [20] GINÉ E, CRESPO M, MUNTA ÒOLA A, CALPE E, BAPTISTA MJ, VILLAMOR N, MONTSERRAT E, BOSCH F. Induction of histone H1.2 cytosolic release in chronic lymphocytic leukemia cells after genotoxic and non-genotoxic treatment. Haematologica 2008; 93: [21] GRÉEN A, SARG B, KOUTZAMANI E, GENHEDEN U, LINDNER HH, RUNDQUIST I. Histone H1 dephosphorylation is not a general feature in early apoptosis. Biochemistry 2008; 47: [22] GRÉEN A, LÖNN A, PETERSON KH, OLLINGER K, RUNDQUIST I. Translocation of histone H1 subtypes between chromatin and cytoplasm during mitosis in normal human fibroblasts. Cytometry A 2010; 77: [23] GUNJAN A, BROWN DT. Overproduction of histone H1 variants in vivo increases basal and induced activity of the mouse mammary tumor virus promoter. Nucleic Acids Res 1999; 27: [24] GURLEY LR, VALDEZ JG, BUCHANAN JS. Characterization of the mitotic specific phosphorylation site of histone H1. J Biol Chem 1995; 270: [25] HALE TK, CONTRERAS A, MORRISON AJ, HERRERA RE. Phosphorylation of the linker histone H1 by CDK regulates its binding to HP1alpha. Mol Cell 2006; 22: [26] HAPPEL N, DOENECKE D. Histone H1 and its isoforms: contribution to chromatin structure and function. Gene 2009; 431: 1 12.

19 HISTON H1.2 PRZEDSTAWICIEL HISTONÓW CZNIKOWYCH 83 [27] HENDZEL MJ, LEVER MA, CRAWFORD E, TH'NG JPH. The C-terminal domain ist he primary determinant of histone H1 binding to chromatin in vivo. J Biol Chem 2004; 279: [28] JERZMANOWSKI A. Histony typu H1 u roœlin nieoczekiwane funkcje uniwersalnych elementów systemu epigenetycznego. Post Biol Kom 2009; 36, supl. 25: [29] KASINSKI HE, LEWIS JD, DACKS JB, AUSIO J. Origin of H1 linker histones. FASEB J 2001; 15: [30] KHOCHBIN S. Histone H1 diversity: bridging regulatory signals to linker histone function. Gene 2001; 271: [31] KILIAÑSKA ZM. Apoptoza organizmów zwierzêcych. W: K³yszejko-Stefanowicz L. [red.] Cytobiochemia. Wydawnictwo Naukowe PWN Warszawa 2002: , [32] KIM K, CHOI J, HEO K, KIM H, LEVENS D, KOHNO K, JOHNSON EM, BROCK HW, AN W. Isolation and characterization of a novel H1.2 complex that acts as a repressor of p53-mediated transcription. J Biol Chem 2008; 283: [33] KIM R, EMI M, TANABE K. Role of mitochondria as the gardens of cell death. Cancer Chemother Pharmacol 2006; 57: [34] K YSZEJKO-STEFANOWICZ L. Chromatyna jej struktura oraz DNA. W: Cytobiochemia. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2002a: [35] K YSZEJKO-STEFANOWICZ L. Chromatyna jej komponent bia³kowy. W: Cytobiochemia. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2002b: [36] KONISHI A, SHIMIZU S, HIROTA J, TAKAO T, FAN Y, MATSUOKA Y, ZHANG L, YONEDA Y, FUJII Y, SKOULTCHI AI, TSUJIMOTO Y. Involvement of histone H1.2 in apoptosis induced by DNA doublestrand breaks. Cell 2003; 114: [37] KOOP R, DICROCE L, BEATO M. Histone H1 enhances synergistic activation of the MMTV promoter in chromatin. EMBO J 2003; 22: [38] KUZMICHEV A, MARGUERON R, VAQUERO A, PREISSNER TS, SCHER M, KIRMIZIS A, OUYANG X, BROCKDORFF N, ABATE-SHEN C, FARNHAM P, REINBERG D. Composition and histone substrates of polycomb repressive group complexes change during cellular differentiation. Proc Nat Acad Sci USA 2005; 106: [39] LIN Q, INSELMAN A, HAN X, XU H, ZHANG W, HANDEL MA, SKOULTHI Al. Reductions in linker histone levels are tolerated in developing spermatocytes but cause changes in specific gene expression. J Biol Chem 2004; 279: [40] MARESCA TJ, FREEDMAN BS, HEALD R. Histone H1 is essential for mitotic chromosome architecture and segregation in Xenopus laevis egg extracts. J Biol Chem 2005; 169: [41] MARESCA TJ, HEALD R. The long and the short of it. Linker histone H1 is required for metaphase chromosome compaction. Cell Cycle 2006; 5: [42] MARZLUFF WF, WAGNER EJ, DURONIO RJ. Metabolism and regulation of canonized histone mrnas: life without a poly(a) tail. Nat Rev Genet 2008; 9: [43] McBRYANT SJ, LU X, HANSEN JC. Multifunctionality of the linker histone: an emerging role for protein-protein interactions. Cell Res 2010; 20: [44] MEERGANS T, ALBIG W, DOENECKE D. Varied expression patterns of human H1 histone genes in different cell lines. DNA Cell Biol 1997; 16: [45] NINIOS YP, SEKERI-PATARYAS KE, SOURLINGAS TG. Histone H1 subtype preferences of DFF40 and possible nuclear localization of DFF40/45 in normal and trichostatin A-treated NB4 leukemic cells. Apoptosis 2010; 15: [46] OKAMURA H, YOSHIDA K, AMORIM BR, HANEJI T. Histone H1.2 is translocated to mitochondria and associates with bak in bleomycin-induced apoptotic cells. J Cell Bioch 2008; 103: [47] OLSZEWSKA JM. Nukleosomy i regulacja aktywnoœci chromatyny. Post Biol Kom 2010; 37: [48] ORREGO M, PONTE I, ROQUE A, BUSCHATI N, MORA X, SUAU P. Differential affinity of mammalian histone H1 somatic subtypes for DNA and chromatin. BMC Biol 2007; 5: 22, doi: / [49] REED JC. Proapoptotic multidomain Bcl-2/Bax-family proteins: Mechanisms, physiological roles, and therapeutic opportunities. Cell Death Differ 2006; 13: [50] ROBINSON PJ, RHODES D. Structure of the 30 nm chromatin fibre: A key role for the linker histone. Curr Opin Struct Biol 2006; 16: [51] ROQUE A, PONTE I, ARRONDO JL, SUAU P. Phosphorylation of the carboxy-terminal domain of histone H1: effects on secondary structure and DNA condensation. Nucleic Acids Res 2008; 36: [52] RUIZ-VELA A, OPFERMAN JT, CHENG EH, KORSMEYER SJ. Proapoptotic BAX and BAK control multiple initiator caspases. EMBO Rep 2005; 6:

20 84 A. BOROWIAK, Z. M. KILIAÑSKA [53] RUIZ-VELA A, KORSMEYER SJ. Proapoptotic histone H1.2 induces CASP-3 and -7 activation by forming a protein complex with CYT c, APAF-1 and CASP-9. FEBS Lett 2007; 581: [54] SANCHO M, DIANI E, BEATO M, JORDAN A. Depletion of human histone H1 variants uncovers specific roles in gene expression and cell growth. PLoS Genet 2008; 4: e [55] SARG B, GRÉEN A, SÖDERKVIST P, HELLIGER W, RUNDQUIST I, LINDNER HH. Characterization of sequence variations in human histone H1.2 and H1.4 subtypes. FEBS J 2005; 272: [56] SARG B, HELLIGER W, TALASZ H, FÖRG B, LINDNER HH. Histone H1 phopshorylation occurs sitespecifically during interphase and mitosis. J Biol Chem 2006; 281: [57] STOLDT S, WENZEL D, SCHULZE E, DOENECKE D, HAPPEL N. G 1 phase-dependent nucleolar accumulation of human histone H1x. Biol Cell 2007; 99: [58] SWANK RA, TH'NG JPH, GUO X-W, VALDEZ J, BRADBURY EM, GURLEY LR. Four distinct cyclindependent kinases phosphorylate histone H1 at all of its growth-related phosphorylation sites. Biochemistry 1997; 36: [59] TALASZ H, SARG B, LINDNER HH. Site-specifically phosphorylated forms of H1.5 and H1.2 localized at distinct of the nucleus are related to different processes during the cell cycle. Chromosoma 2009; 118: [60] TH'NG JP, GUO XW, SWANK RA, CRISSMAN HA, BRADBURY EM. Inhibition of histone phosphorylation leads to chromosome decondensation. J Biol Chem 1994; 269: [61] TH'NG JP, SUNG R, YE M, HENDZEL MJ. H1 family histones in the nucleus. Control of binding and localization by the C-terminal domain. J Biol Chem 2005; 280: [62] TROJER P, ZHANG J, YONEZAWA M, SCHMIDT A, ZHENG H, JENUWEIN T, REINBERG D. Dynamic histone H1 isotype 4 methylation and demethylation by histone lysine methyltransferase G91/KMT1C and the jumonji domain-containing JMJD2/KDM4 proteins. J Biol Chem 2009; 284: [63] TSONEVA I, NIKOLOVA B, GEORGIEVA M, GUENOVA M, TOMOV T, ROLS MP, BERGER MR. Induction of apoptosis by electrotransfer of positively charged proteins as Cytochrome C and Histone H1 into cells. Biochem Biophys Acta 2005; 1721: [64]. WEISS T, HERGETH S, ZEISSLER U, IZZO A, TROPBERGER P, ZEE BM, DUNDR M, GARCIA BA, DAUJAR S, SCHNEIDER R. Histone H1 variant-specific methylation by G9a/KMT1C and Glp1/KMT1D. Epigenetics & Chromatin 2010; 3: 7, doi: / [65] WIDLAK P, KALINOWSKA M, PARSEGHIAN MH, LU X, HANSEN JC, GARRARD WT. The histone H1 C-terminal domain binds to the apoptotic nuclease, DNA fragmentation factor (DFF40/CAD) and stimulates DNA cleavage. Biochemistry 2005; 44: [66] WIŒNIEWSKI JR, ZOUGMAN A, KRUGER S, MANN M. Mass spectrometric mapping of linker histone H1 variants reveals multiple acetylations, methylations, and phosphorylation as well as differences between cell culture and tissue. Mol Cell Proteomics 2007; 6: [67] WOODCOCK CL, SKOULTCHI AI, FAN Y. Role of linker histone in chromatin structure and function: H1 stoichiometry and nucleosome repeat length. Chromosome Res 2006; 14: [68] ZLATANOWA J, DOENECKE D. Histone H1 zero: a major player in cell differentiation? FASEB J 1994; 8: Redaktor prowadz¹cy Jerzy Kawiak Otrzymano: r. Przyjêto: r. Zofia M. Kiliañska, Katedra Cytobiochemii U, ul. S. Banacha 12/16, ódÿ zkilian@biol.uni.lodz.pl