NGS ciąg dalszy. Bioinformatyczna analiza danych Wykład 9 Dr Wioleta Drobik-Czwarno

Transkrypt

1 NGS ciąg dalszy Bioinformatyczna analiza danych Wykład 9 Dr Wioleta Drobik-Czwarno

2 Zalety NGS Sekwencjonowanie wysoko-przepustowe wiele próbek na raz Wiele genów w wielu próbkach co daje mniejszy koszt na pojedynczy gen Różne rodzaje danych Technologia jest cały czas udoskonalana Mniejszy koszt Mniejsze prawdopodobieństwo błędów Wyzwania NGS Wymagająca analiza bioinformatyczna Duże ilości danych Technologia jest cały czas udoskonalana, co wiąże się ze ciągłymi zmianami

3 Aplikacje NGS Frese et al., Next-Generation Sequencing: From Understanding Biology to Personalized Medicine

4 NGS w medycynie Onkologia Zaburzenia hematologiczne Warianty strukturalne Wady wrodzone Neurologia i psychiatria Nieinwazyjne testy prenatalne Kardiologia Farmakogenomika Choroby trudne w diagnostyce lub jeszcze niedokładnie poznane Demkow i Plonski, Clinical Applications for Next- Generation Sequencing.

5 NGS a spersonalizowana terapia onkologiczna Wykrywanie wariantów somatycznych na wczesnych etapach rozwoju nowotworu może prowadzić do spersonalizowanej terapii Rzadkie warianty, występujące u mniej niż 1% pacjentów mogą być powiązane z wrażliwością na leki Zrozumienie genetycznego podłoża nowotworów Diagnostyka nowotworów Przewidywanie reakcji na terapie (RNA-seq lub wykrywanie wariantów DNA) Sekwencjonowanie krążącego DNA nowotworowego (ctdna) DNA pochodzące od obumarłej komórki nowotworowej Wprowadzenie na szeroką skalę? Spadek cen Dopracowanie metod analizy bioinformatycznej

6 NGS a spersonalizowana terapia onkologiczna Cumminig et al The Role of Next Generation Sequencing in Enabling Personalized Oncology Therapy

7 Pierwsze prace W roku 2001, zaraz po ukończeniu pierwszego etapu Human Genome Project pierwsze eksony z komórek nowotworowych zostały zsekwenjonowane techniką NGS Niedługo po tym przeprowadzono badania nad ostrą białaczką szpikową (ang. human accute leukemia, AML) u 140 pacjentów (Ley i wsp., 2003). Zidentyfikowano: 6 znanych wcześniej mutacji 7 nieznanych wcześniej mutacji powiązanych z patogenezą

8 Zestawienie za Shen i wsp., 2015

9 Największe problemy dla NGS w praktyce onkologicznej Dostępność próbek, a co za tym idzie często mała wielkość próby Ograniczona ilość materiału biologicznego Materiał pochodzi z biopsji (obciążenie dla pacjenta) bądź jest to ctdna (mała ilość materiału) Konieczne porównanie ze zdrową tkanką (obciążenie dla pacjenta) Problemy etyczne i bezpieczeństwo danych Koszt, brak dokładnej analizy ekonomicznej

10 Możliwości dla NGS w praktyce onkologicznej WGS (Whole genome Sequencing) Duży koszt wygenerowania i obróbki danych Możliwość wykrycia wariantów w sekwencjach nie kodujących, które mogą być powiązane z ekspresją genów WES (Whole exome Sequencing) Mniejszy koszt wygenerowania i przechowywania danych (ok. 2% WGS) Tylko warianty w sekwencjo kodującej Targeted sequencing Mniejszy koszt co umożliwia uzyskanie większego pokrycia DNA-seq + RNA-seq

11 Planowanie doświadczenia NGS o czym należy pamiętać Losowy dobór próbek do eksperymentu lub Wykorzystanie istniejącej struktury rodzinowej Dziedziczenie Potwierdzenie wykrytych wariantów Możliwość sekwencjonowania w grupach (tzw. Pool-seq) Mniejsze koszty Prostsza analiza

12 Bioconductor

13 Czym jest Bioconductor? Projekt zapoczątkowany przez Roberta Gentlemana w 2001 roku Jest to repozytorium kodu służące do gromadzenia, udostępniania i kontroli jakości narzędzi bioinformatycznych stworzonych w języku R

14 Bioconductor Cele projektu: zapewnienie otwartej platformy do analizy danych genomowych, integracja danych z różnych baz danych, promocja dobrej jakościowo dokumentacji i powtarzalności badań Istnieje możliwość dodawania własnych pakietów przez użytkowników

15 Programowanie obiektowe OOP ang. Object-oriented programming OOP: Przedstawienie świata rzeczywistego i relacji w nim zachodzących za pomocą obiektów Zarówno R jak i Bioconductor opiera się paradygmacie programowania OOP. Umożliwia to przedstawienie danych biologicznych w formie obiektów o równych właściwościach. Najważniejsze pojęcia: Klasa jest to typ zmiennej, inaczej definicja pewnej grupy obiektów. Definiuje metody oraz atrybuty. Atrybut jest to indywidualna cecha obiektów danej klasy Metoda funkcjonalność dostarczana przez obiekty, inaczej funkcje, które wykonują zadania na obiektach danej klasy Obiekt jest instancją danej klasy, konkretna zmienna danego typu

16 Programowanie obiektowe OOP ang. Object-oriented programming Przykład 1: Klasa: Człowiek Metody: spanie, jedzenie, poruszanie się, mówienie, itd. Atrybuty: imię, nazwisko, data urodzenia itd. Obiekty klasy człowiek: Janek, Kasia, Adam Przykład 2: Klasa: DNA Metody: zwróć sekwencję komplementarna, zwróć sekwencję odwrotna, przetłumacz na sekwencję AA Atrybuty: długość, identyfikator Obiekty klasy DNA: sekwencja_1, sekwencja_2

17 Programowanie obiektowe OOP ang. Object-oriented programming Funkcja generyczna sprawdza podane argumenty i dobiera odpowiednią metodę. Przykłady w R: plot, summary, print Wywołując funkję generyczną uzyskany efekt będzie zależny od klasy jej argumentów a dokładniej metod danej klasy Pozwala to dopasować obliczenia bezpośrednio do typu danych

18 Instalacja Zanim zaczniemy instalować podstawę oraz pakiety: source(" Instalacja: bioclite() służy do instalacji szeregu pakietów tworzących podstawę bioconductora Instalacja pakietow nie będących w podstawowej wersji: bioclite("snpchip")

19 Przykładowe pakiety podstawowe do analizy sekwencji Biostrings klasy oraz funkcje dla sekwencji BSgenome i inne sekwencje referencyjne dla różnych gatunków GenomicRanges manipulowanie przedziałami genomowymi GenomicFeatures pozyskiwanie i manipulowanie danymi z publicznych baz danych

20 Pakiety podstawowe Biobase: Podstawowe klasy i definicje, które pozwalają na dokładny opis danych oraz manipulowanie nimi Funkcje niezbędne do działania wielu pakietów, zastępujące funkcję w podstawowej wersji R Huber, W., Carey, J. V, Gentleman, R., Anders, S., Carlson, M., Carvalho, S. B, Bravo, C. H, Davis, S., Gatto, L., Girke, T., Gottardo, R., Hahne, F., Hansen, D. K, Irizarry, A. R, Lawrence, M., Love, I. M, MacDonald, J., Obenchain, V., Ole's, K. A, Pag'es, H., Reyes, A., Shannon, P., Smyth, K. G, Tenenbaum, D., Waldron, L., Morgan and M. (2015). Orchestrating high-throughput genomic analysis with Bioconductor. Nature Methods, 12(2), pp

21 Pakiety podstawowe Biostrings: Wydajne (oszczędzające RAM) kontenery na ciągi znaków, algorytmy dopasowania oraz inne funkcje, dla szybkiego manipulowania dużymi sekwencjami biologicznymi lub ich zestawami. Pagès H, Aboyoun P, Gentleman R and DebRoy S (2017). Biostrings: String objects representing biological sequences, and matching algorithms. R package version

22 Przykładowe pakiety: Adnotacja: annotate, annaffy, biomart Graphics/GUIs: geneplotter, hexbin, limmagui, explorase Pre-processing: affy, affycomp, oligo, makecdfenv, vsn, gcrm, limma Differential gene expression: genefilter, limma, ROC, siggenes, EBArrays, factdesign GSEA/Hypergeometric Testing GSEABase, Category, GOstats, topgo Graphs and networks: graph, RBGL, Rgraphviz Flow Cytometry: flowcore, flowviz, flowutils Protein Interactions: ppidata, ppistats, ScISI, Rintact Sequence Data: Biostrings,ShortRead,rtracklayer,IRanges,GenomicFeatures, VariantAnnotation Other data: xcms, DNAcopy, PROcess, acgh, rsbml, SBMLR, Rdisop

23 Instrukcje Źródło: I dużo więcej w advanced workflows

24 GWAS w R a Bioconductor GenABEL Bioconductor GWASTools SNPRelate SNPRelate umożliwia wykonanie analizy PCA oraz analizę podobieństwa PCA vs MDS: informacja o % zmienności genetycznej wyjaśnianej przez każdy komponent Informacje o % udziale każdego markera w danych komponencie (loadings)

25 Jak zacząć z pakietem Biostrings? Instalacja: source(" bioclite("biostrings ) Ładowanie pakietu: require(biostrings) Wygenerowanie przykładowej sekwencji o długości 10pz: seq_raw <- sample(letters[c(1,3,7,20)], size=10, replace=true) Wynik: [1] "C" "G" "T" "A" "T" "T" "G" "G" "A" "A" seq = paste(seq_raw, collapse="")

26 Klasa Xstrings i BStrings Klasa pozwala na tworzenie, przechowywanie oraz zapewnia metody pracy z różnymi typami tekstu Najważniejsze subklasy Bstring - DNAString, RNAString, AAString DNAString klasa obiektów, umożliwia wydajne manipulowanie i przechowywanie długich sekwencji DNA Bstring przechowuje sekwencje w kodzie IUPAC Tworzenie obiektu klasy Bstring bstring<-bstring( tekst ) bstring 9-letter Bstring instance seq: tekst

27 IUPAC Międzynarodowa Unia Chemii Czystej i Stosowanej ang. International Union of Pure and Applied Chemistry Kod, który uwzględnia również zdegenerowane zasady

28 Dziękuję za uwagę