Beata Hryciuk STRESZCZENIE

Transkrypt

1 Beata Hryciuk STRESZCZENIE Ekspresja receptorów dla hormonów steroidowych, naskórkowego czynnika wzrostu typu 2 oraz czynnika wzrostu tkanki łącznej w raku pęcherzyka żółciowego i tkance zdrowej Wstęp i cel pracy: Rak pęcherzyka żółciowego (RPŻ) jest złośliwym nowotworem, który wywodzi się z komórek nabłonka błony śluzowej pęcherzyka żółciowego. RPŻ stanowi 80-95% raków dróg żółciowych, charakteryzuje się niekorzystnym rokowaniem i wysoką śmiertelnością. Odsetek 5-letnich przeżyć u chorych z rozpoznaniem RPŻ w Polsce nie przekracza 10%. W przypadku chorych na nieresekcyjnego lub nawrotowego RPŻ jedyną skuteczną metodą, która wpływa na poprawę parmetrów przeżycia jest chemioterapia z udziałem gemcytabiny i cisplatyny. Dlatego też u chorych na RPŻ tak ważne jest opracowanie nowych metod leczenia systemowego co wiąże się z poznawaniem patomechanizmów molekularnych związanych z etiopatogenezą tego nowotworu. W niniejszej pracy przeprowadzono ocenę porównawczą ekspresji receptorów dla hormonów steroidowych (estrogenowego i progesteronowego), czynnika wzrostu tkanki łącznej (CTGF, ang. Connective Tissue Growth Factor) oraz drugiego receptora naskórkowego czynnika wzrostu (HER2, ang. Human Epidermal Growth) w raku pęcherzyka żółciowego (RPŻ) i tkance zdrowej oraz ich wartości prognostycznej. Materiał i metody: Przedstawiony w pracy materiał obejmuje grupę 60 chorych na RPŻ (w tym 51 kobiet i 9 mężczyzn) rasy kaukaskiej, leczonych w latach w czterech ośrodkach onkologicznych w Polsce: Wojskowym Instytucie Medycznym w Warszawie, Klinice Onkologii i Radioterapii Gdańskiego Uniwersytetu Medycznego w Gdańsku, Opolskim Centrum Onkologii im. prof. Tadeusza Koszarowskiego w Opolu oraz Wojewódzkim Szpitalu Specjalistycznym im. J. Korczaka w Słupsku. Analizę danych klinicznych przeprowadzono na podstawie: danych z dokumentacji medycznej, informacji z Biur Ewidencji Ludności dotyczących ewentualnej daty zgonu, informacji z innych ośrodków onkologicznych, informacji uzyskanych od chorych i ich rodzin. Komputerową, zanonimizowaną bazę zawierającą dane kliniczne zamknięto 1 marca 2018 roku. Ocenę ekspresji ER, ER, PgR, HER2 i CTGF (immunohistochemiczne, IHC) wykonano w oparciu o dostępny, archiwalny

2 materiał tkankowy, z radykalnych lub paliatywnych zabiegów u chorych na RPŻ, z wykorzystaniem przeciwciał, kolejno: DAKO; anti-human; królicze klon EP1; Abcam; antihuman; królicze klon EPR3778; ab133467; DAKO; anti-human; mysie klon 636; Ventana; królicze klon 4B5; Santa Cruz, California; kozie sc W przypadku niejednoznacznego wyniku HER2 (IHC) ocenę liczby kopii genu HER2 wykonano metodą FISH (ang. fluorescent in situ hybridization). Wycinki guzów wybarwionych hematoksyliną i eozyną poddane zostały ponownej ocenie histopatologicznej. Bioptaty fragmentów RPŻ i otaczjącej tkanki zdrowej - rdzenie tkankowe (ang. tissue core) umieszczano we wcześniej przygotowanych, beztkankowych blokach parafinowych biorcach. Mikromacierze tkankowe wykonywano za pomocą aparatu Manual tissue arrayer I firmy Beecher Instruments (MTAI, K7 BioSystems). Analizę statystyczną przeprowadzono za pomocą środowiska statystycznego R w wersji Wyniki: Mediana obserwacji wyniosła 242 dni (zakres 0 do 5075 dni). Mediana czasu całkowitego przeżycia 415 dni (zakres od 1 do 5075 dni). Średnia wieku chorych w momencie rozpoznania 67 lat (zakres lat), mediana BMI 26,2 (mediana 17,7-45,3), 49 chorych (82%) zostało poddanych leczeniu operacyjnemu (cholecystektomia z/lub bez limfadenektomii wrotnej i hepatektomii, u 35 (58%) chorych stwierdzono współistnienie kamicy żółciowej. Nawroty choroby stwierdzono u 31 chorych (52%), z czego 29 chorych (48%) zostało poddanych chemioterapii paliatywnej. We wszystkich przypadkach stwierdzono raka gruczołowego ang. Adenocarcinoma, NOS. Cechę pt1, pt2, pt3, pt4 stwierdzono kolejno u 13 (21,7%), 23 (38,3%), 14 (23,3%), 4 (6,7%) chorych, a u 6 (10,0%) nie określono cechy pt. Cechę pn0 i pn1 stwierdzono kolejno u 11 (18,3%) i 13 (21,7% chorych), u 36 chorych (60%) nie określono cechy p N (pnx). W 11 przypadkach (18,3%) obserwowano wysoko zróżnicowane raki (G1), w 29 przypadkach (48,3%) pośrednie zróżnicowanie (G2), natomiast nisko zróżnicowane RPŻ (G3) obserwowano u 11 chorych (18,3%). W wyniku przeprowadzonych analiz IHC, nie wykazano ekspresji ER w RPŻ i tkance zdrowej. W RPŻ w porównaniu z tkanką zdrową stwierdzono nieco wyższą ekspresję ER (p=0,0041) i niższą ekspresję HER2 oraz cytoplazmatyczną PgR (cytopgr) (kolejno p=0,0002 i p<10-15 ). Nie stwierdzono różnicy w ekspresji CTGF pomiędzy RPŻ a tkanką zdrową (p=0,1634). Stwierdzono pozytywną korelację pomiędzy ekspresją HER2 i CTGF, w RPŻ i tkance zdrowej (p=0,003 i p=0,000). W RPŻ i tkance zdrowej wykazano pozytywną korelację ER i HER2 (nieznamienną statystycznie, kolejno p=0,056 i p=0,052). Ocena ekspresji ER, cytopgr, HER2, CTGF w RPŻ nie wykazała związku z obecnością kamicy, kolejno p=0,39; p=1; p=1; p=0,17; p=1. Natomiast zaobserwowano wzrost ekspresji cytopgr w tkance zdrowej u chorych

3 z kamicą p=0,04. W badaniu IHC HER2(3+) stwierdzono w RPŻ u 3 chorych, IHC HER2(2+) w RPŻ w 9 przypadkach i 11 przypadkach w tkance zdrowej. W badaniu FISH amplifikację HER2 stwierdzono w 2 przypadkach RPŻ. Łącznie kryteria przyjęte dla HER2-dodatniego raka piersi stwierdzono u 5 chorych (8,2%). W analizie jednoczynnikowej stwierdzono związek pomiędzy skróceniem całkowitego czasu przeżycia a wiekiem >70 r.ż. (p=0,028) i cechą pt (p=0,031). Poprawę OS obserwowano w grupie chorych, którzy otrzymali chemioterapię w okresie uogólnienia choroby (p=0,002). Dla badanych biomarkerów (jako zmiennej ciągłej, bezprogowej H-score) stwierdzono korzystny związek pomiędzy OS a ekspresją ER w tkance zdrowej (p=0,025), z kolei ekspresja ER w RPŻ wiązał się z pogorszeniem OS (p=0,018). Cecha HER2 w RPŻ nie wpłynęła na OS (p=0,12). W analizie wieloczynnikowej związek z OS stwierdzono dla wieku > 70 r.ż. i cechy pt oraz ekspresji ER w RPŻ (p=0,003) lub w otaczającej tkance zdrowej (p=0,007). Omównienie i wnioski: Wyniki przedstawione w pracy stanowią pierwszą łączną analizę ekspresji receptorów dla hormonów steroidowych - ER, oraz PgR, HER2 i CTGF - zarówno w RPŻ i przylegającej tkance zdrowej w populacji polskiej, rasy kaukaskiej. W badanej grupie nie wykazano ekspresji ER w tkance RPŻ, jak i otaczającej tkance zdrowej, natomiast w RPŻ obserwowano wyższą ekspresję ER RPŻ w porównaniu do tkanki zdrowej. Co więcej ekspresja ER w RPŻ wiązała się z gorszym OS, a w tkance zdrowej pęcherzyka żółciowego z poprawą OS. Przeciwnie do ekspresji ER wyższą ekspresję cytopgr stwierdzono w tkance zdrowej pęcherzyka żółciowego w porównaniu do RPŻ. Ponadto ekspresja cytopgr w tkance zdrowej związana była z obecnością kamicy, co może wynikać z aktywacji genów zależnych od progesteronu, a jednocześnie negatywnie korelowała z ekspresją CTGF. W związku z uzyskanymi wynikami rola hormonów płciowych i ekspresji różnych izoform receptorów oraz szlaków metabolicznych w etiopatogenezie RPŻ wymaga dalszych badań. W niniejszej pracy wykazano, że w populacji kaukaskiej u chorych na RPŻ nadekspresja lub/i amplifikacja HER2 występuje rzadko w guzie pierwotnym (8% chorych) i nie jest niekorzystnym czynnikiem rokowniczym. Nie stwierdza się różnicy w ekspresji CTGF w RPŻ i otaczającej tkance zdrowej oraz wpływu tego biomarkera na rokowanie. Odmienne wyniki odnośnie CTGF uzyskane w niniejszej pracy mogą wynikać z różnic w etiopatogenezie RPŻ pomiędzy populacjami chilijską i kaukaską. Natomiast wykazano związek pomiędzy ekspresją HER2 i CTGF oraz ER w RPŻ i przylegającej tkance zdrowej co wskazuje na powiązanie tych szlaków sygnałowych w procesach fizjologicznych i patologii pęcherzyka żółciowego. Podobnie jak w wielu innych doniesieniach, w badanej grupie wiek chorych powyżej 70 r.ż.

4 w momencie rozpoznania, i cecha pt wiązały się ze skróceniem OS. Oba czynniki w skojarzeniu z ekspresją ER w RPŻ lub otaczającej tkance zdrowej stanowiły najbardzej wartościowy model rokowniczy. Z uwagi na retrospektywny charakter pracy i względnie małą grupę chorych uzyskane wyniki należy interpretować z dużą ostrożnością, niemniej jednak stwarzają one przesłanki do dalszych badań. Aplikacyjna wartość uzyskanych wyników w aspekcie m.in. działań profilaktycznych, wymagałaby przeprowadzenia prospektywnych badań z losowym doborem chorych. SUMMARY Expression of receptors for steroid hormones (estrogen and progesterone), connective tissue growth factor (CTGF) and the second human epidermal growth (HER2) in gallbladder cancer and healthy tissue Introduction and objective of the study: Gallbladder cancer is a malignant tumor, which comes from epithelial cells of mucous membrane of gallbladder. Gallbladder cancer constitutes 80-90% of cholangiocarcinoma and is characterized by poor prognosis and high mortality rate. The 5-year survival rate of patients with gallbladder cancer in Poland does not exceed 10%. In case of unresectable or recurrent gallbladder cancer, the only efficient method that allows improving survival parameters is chemotherapy with gemcitabine and cisplatin. Therefore, in case of patients with gallbladder cancer, it is so important to develop new methods of systemic therapy, which is associated with learning molecular pathomechanisms related to ethiopathogenesis of the aforesaid cancer. This study includes comparative assessment of expression of receptors for steroid hormones (estrogen and progesterone), connective tissue growth factor (CTGF) and the second human epidermal growth (HER2) in gallbladder cancer and healthy tissue, and their prognostic value. Material and methods: The material described in the study covers a group of 60 Caucasian patients with gallbladder cancer (51 women and 9 men), treated in in four oncology centers in Poland: Military Medical Institute in Warsaw, Oncology and Radiotherapy Clinic of the Medical University of Gdańsk, Prof. Tadeusz Koszarowski Oncology Center in Opole and J. Korczak Voivodeship Specialist Hospital in Słupsk. The analysis of clinical data was

5 conducted on the basis of: information from medical records, information from the Population Registration Office regarding potential date of death, information from other oncology centers, information obtained from patients and their families. The digital anonymized database that included clinical data was closed on March 1, The expression of ER, ER, PgR, HER2 and CTGF (immunohistochemical, IHC) was assessed on the basis of available archive tissue material, from radical or palliative treatment of patients suffering from gallbladder cancer, using antibodies, successively: DAKO; anti-human; rabbit clone EP1; Abcam; anti-human; rabbit clone EPR3778; ab133467; DAKO; anti-human; mouse clone 636; Ventana; rabbit clone 4B5; Santa Cruz, California; goat sc In case of ambiguous result of HER2 (IHC), the assessment of the number of copies of gene HER2 was performed using FISH method (fluorescent in situ hybridization). Tumor specimens stained with haematoxylin and eosin were subject to another histopathological evaluation. Biopsy specimens of gallbladder cancer and surrounding healthy tissue - "tissue bore" - were placed on the previously prepared tissue-free paraffin blocks "recipients". Tissue microarrays were constructed using Manual tissue arrayer I by Beecher Instruments (MTAI, K7 BioSystems). The statistical analysis was conducted using statistical environment R, rev Results: The observation median was 242 days (from 0 to 5075 days). The median of the overall survival rate was 415 days (from 1 to 5075 days). The average age of patients at the date of diagnosis was 67 years (from 31 to 97), the median of BMI ( ); 49 patients (82%) were subjected to surgical treatment (cholecystectomy with or without lymph node dissection and hepatectomy); 35 (58%) patients were diagnosed with coexistence of gallstones. Relapses were seen in 31 patients (52%), out of whom 29 (48%) were treated with palliative chemotherapy. In all cases, Adenocarcinoma, NOS was diagnosed. Tumor stages pt1, pt2, pt3, pt4 were observed in 13 (21.7%), 23 (38.3%), 14 (23.3%), 4 (6.7%) patients, and in 6 (10.0%), feature pt was not seen. Stages pn0 and pn1 were observed in 11 (18.3%) and 13 (21.7%) patients, and in 36 (60%), feature pn (pnx) was not seen. In 11 cases (18.3%), highly varied cancer was diagnosed (G1), in 29 cases (48.3%) - medium varied cancer (G2), whereas in 11 cases (18.3%) - low varied gallbladder cancer (G3). As a result of IHC analyses, no expression of ER in gallbladder cancer and healthy tissue was observed. In case of gallbladder cancer, when compared with healthy tissue, a bit higher expression of ER (p=0.0041), lower expression of HER2 and cytoplasmic expression of PgR (cytopgr) (p= and p<10-15 ) were determined. No differences in the expression of CTGF between gallbladder cancer and healthy tissue (p=0.1634) were found. A positive correlation between the expression of HER2

6 and CTGF was observed in gallbladder cancer and healthy tissue (p=0.003 and p=0.000). The positive correlation between ER and HER2 (insignificant in statistical terms p=0.056 and p=0.052) was found in gallbladder cancer and healthy tissue. The assessment of expression of ER, cytopgr, HER2, CTGF in gallbladder cancer did not show any connection with gallstones: p=0.39; p=1; p=1; p=0.17; p=1. On the other hand, the increased expression of cytopgr in healthy tissue of patients suffering from gallstones p=0.04 was observed. During IHC analysis, HER2(3+) was seen in 3 patients in gallbladder cancer, IHC HER2(2+) in 9 patients in gallbladder cancer, and in 11 patients - in healthy tissue. During FISH analysis, amplification of HER2 was observed in 2 patients with gallbladder cancer. In summary, the criteria for HER2-positive breast cancer were met in 5 patients (8.2%). During single-factor analysis, a correlation between decreased overall survival (OS) rate and age >70 of patients with gallbladder cancer (p=0.028) and stage pt (p=0,031) was reported. The improved OS was observed in a group of patients, who received chemotherapy during the generalization phase of the disease. In case of biomarkers under evaluation (continuous variable, non-threshold H- score), a positive correlation between the OS and expression of ER in healthy tissue (p=0.025) was observed, whereas the expression of ER in gallbladder cancer was related to the decreased OS (p=0.018). Human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) in gallbladder cancer did not affect the OS (p=0.12). In multi-factor analysis, the correlation between the overall survival rate was observed in patients aged > 70 with gallbladder cancer, stage pt, and expression of ER in gallbladder cancer (p=0.003) or in the surrounding healthy tissue (p=0.007). Discussion and conclusions: The results presented in the study constitute the first aggregated analysis of expression of receptors for steroid hormones - ER, and PgR, HER2 and CTGF - in both gallbladder cancer and surrounding healthy tissue in Caucasian Polish population. No expression of ER in the gallbladder cancer tissue or its surrounding healthy tissue was observed, whereas in case of gallbladder cancer, higher expression of ER of gallbladder cancer was reported when compared with healthy tissue. Furthermore, the expression of ER in gallbladder cancer was connected with the decreased OS, whereas in healthy tissue - with the increased OS. Contrary to the expression of ER, the higher expression of cytopgr was observed in healthy tissue of gallbladder when compared with gallbladder cancer. Additionally, the expression of cytopgr in healthy tissue was connected with gallstones, which may be due to the activation of progesterone-dependent genes. The expression also negatively correlated with the expression of CTGF. On the basis of the aforementioned results, the role of sex hormones and expression of different isoforms of receptors and metabolic pathways in

7 ethiopathogenesis of gallbladder cancer requires further research. This study showed that in Caucasian populations of patients with gallbladder cancer, the overexpression and/or amplification of HER2 rarely occur in primary tumor (8% of patients) and do not constitute an unfavorable prognostic favor. No differences in the expression of CTGF in gallbladder cancer and its surrounding healthy tissue or impact of such biomarker on the prognosis were reported. Different results concerning CTGF obtained in this study may result from differences in ethiopathogenesis of gallbladder cancer observed in Chilean and Caucasian populations. On the other hand, a correlation between the expression of HER2, CTGF and ER in gallbladder cancer and its surrounding tissue was reported, which confirms connection between such signaling pathways in physiological processes and pathology of gallbladder. Similarly to many other studies, the age of patients with gallbladder cancer of over 70 at the time of diagnosis as well as stage pt were related to the decreased OS. Both factors, in association with the expression of ER in gallbladder cancer or its surrounding tissue, formed the most favorable prognostic model. Due to retrospective character of the study and relatively small group of patients, the obtained results should be interpreted with considerable caution. Nonetheless, it should not be forgotten that the results give good reason to pursue further research. The application value of the obtained results, in terms of, among other things, preventive measures, would require prospective studies with random choice of patients.