Acta Sci. Pol., Biotechnologia 8(4) 2009, 25-36

Transkrypt

1 Acta Sci. Pol., Biotechnologia 8() 9, 5- WZROST Z SACHAROZY KLONÓW DRO D Y YARROWIA LIPOLYTICA Z GENEM INWERTAZY Z SACCHAROMYCES CEREVISIAE Ewa Walczak, Ma gorzata Robak Uniwersytet Przyrodniczy we Wroc awiu Streszczenie. Celem bada by a ocena wzrostu potencjalnych producentów heterologicznych bia ek: klonów Suc + dro d y Yarrowia lipolytica A-. Wzrost z sacharozy oceniano dla transformantów, dla szczepu wyj ciowego (dzikiego) A- i referencyjnego rekombinowanego szczepu W9 ura-. Badane transformanty ró ni y si zdolno ci do wzrostu z sacharozy (d ugo trwania lag fazy, moment osi gni cia fazy stacjonarnej wzrostu). Natomiast bez wzgl du na typ przeprowadzonej modyfikacji nie odnotowano ró nic we wzro cie z fruktozy i glukozy. Oceniano tak e wp yw pocz tkowego ph hodowli (,8) oraz dodatku peptonu (, i,%) na indukcj promotora XPR. Wykazano, e KLON oraz KLON wyrastaj obficie z sacharozy ju przy minimalnej dawce peptonu (,%). Z kolei stabilizacja ph w pocz tkowym okresie wzrostu na poziomie,8 wp yn a pozytywnie na przebieg hodowli. Nawet w pod o u zawieraj cym % sacharozy, pomimo d u szej lag fazy, klony wyrasta y lepiej z buforem ni bez. S owa kluczowe: Yarrowia lipolytica, Suc + Ura +, Suc + Ura -, sacharoza, XPR, Bioscreen C WST P Obecnie wiod cymi gatunkami, wykorzystywanymi w badaniach nad produkcj heterologicznych bia ek, s : Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Kluyveromyces lactis, Hansenula polymorpha, Arxula adeninivorans oraz Yarrowia lipolytica [Gellissen i in. 5, Robak i Walczak 9]. Ten ostatni jest kolejnym gatunkiem, zdobywaj cym popularno jako gospodarz w produkcji obcych bia ek. W oparciu o ró ne systemy ekspresji szczepy Y. lipolytica mog wydziela na litr pod o a nawet kilka gramów bia ek, pochodz cych od bakterii, grzybów, ro lin lub ssaków, w tym ludzi [Juretzek i in., Nicaud i in. ]. Od lat 8. intensywnie rozwijaj si badania dotycz ce udoskonalenia szczepów Y. lipolytica, w celu wydajnej produkcji heterologicznych bia ek. Dotychczas opisano Adres do korespondencji Corresponding author: Ma gorzata Robak, Katedra Biotechnologii i Mikrobiologii ywno ci, Uniwersytet Przyrodniczy we Wroc awiu, ul. C.K. Norwida 5, 5-75 Wroc aw, malgorzata.robak@up.wroc.pl

2 E. Walczak, M. Robak zaledwie rekombinowanych szczepów Y. lipolytica, potencjalnych producentów obcych bia ek. Szczepy te posiadaj markery genetyczne, g ównie w postaci auksotrofii leucynowej i uranylowej, umo liwiaj ce dalsz selekcj transformantów [Madzak i in. 5]. Stosunkowo atw selekcj producentów heterologicznych bia ek z wklonowanym obcym genem stanowi zdolno do utylizacji nietypowych dla tego gatunku róde w gla. Jednym z nich jest sacharoza, ulegaj ca hydrolizie pod wp ywem inwertazy, enzymu kodowanego przez gen SUC u S. cerevisiae. Dzi ki zdolno ci do wzrostu z sacharozy, rekombinowane szczepy Y. lipolytica mog wykorzystywa substraty zawieraj ce sacharoz (niehydrolizowana melasa, cukier spo ywczy i inne) [Nicaud i in. 989, Wojtatowicz i in. 997]. Tak zdolno do wzrostu z sacharozy wykazuje zaledwie osiem rekombinowanych szczepów Y. lipolytica [Madzak i in. 5]. Rekombinowane szczepy nale ce do tego gatunku dro d y znacznie ró ni si wydajno ci produkcji obcych bia ek. Na wydajno produkcji heterologicznego bia ka wp ywa wydajno ekspresji genów (si a promotora, regulacja transkrypcji i translacji), potranslacyjne modyfikacje oraz sposób wydzielania bia ka [Watson i in. 8]. Stosowanie indukcyjnych promotorów umo liwia kontrol zarówno momentu, jak i poziomu ekspresji genu. Promotor XPR, wykorzystany w wielu projektach zak adaj cych produkcj heterologicznych bia ek, jest najlepiej poznanym i najcz ciej stosowanym spo ród znanych promotorów Y. lipolytica [Nicaud i in. 989, Hamsa i in. 99, Park i in. 997]. Pomimo pozyskania przez niezale ne laboratoria szczepów b d cych potencjalnymi producentami obcych bia ek wci poszukiwani s nowi gospodarze, pochodz cy od szczepów dzikich izolowanych z naturalnych róde. Takim szczepem jest izobat Y. lipolytica A- zdeponowany w kolekcji kultur w Katedrze Biotechnologii i Mikrobiologii ywno ci Uniwersytetu Przyrodniczego we Wroc awiu, który poddano transformacji, uzyskuj c liczne klony o fenotypie Suc + [Walczak i in. 7a,b]. Celem pracy by a ocena zdolno ci do wzrostu z sacharozy, glukozy i fruktozy klonów Y. lipolytica o fenotypie Suc + Ura + oraz Suc + Ura - posiadaj cych gen inwertazy z S. cerevisiae. Analizowano tak e wp yw dodatku peptonu w dawce, i,% oraz buforu fosforanowego o ph,8 jako czynników indykuj cych promotor XPR, warunkuj cego ekspresj genu SUC. MATERIA I METODY Mikroorganizmy. Przedmiotem bada by o zmodyfikowanych genetycznie szczepów dro d y Yarrowia lipolytica, otrzymanych na drodze transformacji szczepu dzikiego Y. lipolytica A- (MATA,Ura + Suc - ) ekspresyjn kaset dro d ow z plazmidu pina. Kaseta dro d owa integruj ca w obr bie genu URA, zawiera a sekwencj genu SUC dro d y S. cerevisiae znajduj cego si pod kontrol promotora indukcyjnego i terminatora genu XPR dro d y Y. lipolytica. Pozyskane klony wykazywa y fenotyp Suc + Ura - lub Suc + Ura + i by y wynikiem integracji kasety dro d owej odpowiednio w homologiczne lub przypadkowe (heterologiczne) miejsce genomu. Zestawione w tabeli szczepy dro d y otrzymano w 7 roku [Walczak i in. 7a,b]. Mikrohodowle prowadzono w analizatorze Bioscreen C, umo liwiaj cym wykonanie równolegle mikrohodowli oraz pomiar g sto ci optycznej (OD -58 nm ) co 5 min. Do mikrostudzienek kasety wprowadzono μl pod o a p ynnego z tiamin (MMT). ród o w gla stanowi a glukoza (%), fruktoza (%) lub sacharoza ( %). Acta Sci. Pol.

3 Wzrost z sacharozy klonów dro d y 7 Tabela. Stosowane szczepy Y. lipolytica Table. Applied Y. lipolytica strains Lp. No. Szczep Y.lipolytica Strain Y.lipolytica Genotyp Genotype Fenotyp Phenotype. A- WT MATA URA Suc - Ura +. W 9 ura- ref. MATA, ura-:pxpr::suc Suc + Ura -. A- A8 MATA, ura-:pxpr::suc. A- B55- MATA, ura-:pxpr::suc 5. A- B5- MATA, ura-:pxpr::suc. A- B57- MATA, ura-:pxpr::suc 7. A- KLON MATA, X-:pXPR::SUC 8. A- KLON MATA, X-:pXPR::SUC 9. A- B7- MATA, X-:pXPR::SUC Suc + Ura -. A- B- MATA, X-:pXPR::SUC. A- BA-5 MATA, X-:pXPR::SUC. A- B5-5 MATA, X-:pXPR::SUC Suc + Ura +. A- B58- MATA, X-:pXPR::SUC. A- B59- MATA, X-:pXPR::SUC 5. A- B- MATA, X-:pXPR::SUC. A- B-5 MATA, X-:pXPR::SUC 7. A- B- MATA, X-:pXPR::SUC 8. A- KLON MATA Suc - Ura + 9. A- KLON MATA, X-:pXPR::SUC. A- KLON MATA, X-:pXPR::SUC. A- KLON 7 MATA, X-:pXPR::SUC. A- KLON 9 MATA URA. A- KLON MATA Suc + Ura +. A- KLON 9 MATA 5. A- KLON MATA. A- KLON 5 MATA 7. A- KLON 8 MATA 8. A- KLON MATA Biotechnologia 8() 9

4 8 E. Walczak, M. Robak W celu indukcji promotora XPR dodano do pod o a, lub,% peptonu oraz w wybranych wariantach hodowli 5 mm bufor fosforanowy o ph,8. Uracyl ( mg l - ) dodawano w hodowli klonów niezdolnych do syntezy uracylu (fenotyp Ura - ). Inokulum (5 μl) stanowi a -godz. hodowla wstrz sana dro d y, prowadzona w pod o u YPG, w temp. 8 C, standaryzowana w sterylnym p ynie fizjologicznym do g sto ci zawieraj cej oko o komórek w ml. G sto wyznaczono z równania krzywej zale no ci OD 55 od ilo ci komórek obecnych w ml. Komórki dro d y liczono w komorze Thoma, zliczaj c komórki w trzech preparatach mikrobiologicznych. Hodowl prowadzono w temp. 5 C, przez 7 9 godz., przy ci g ym wstrz saniu. Ka dy wariant hodowli wykonano w trzech powtórzeniach. Kontrol czysto ci stanowi o μl pod o a bez inokulum. Zastosowanie programu BioLink umo liwi o ledzenie krzywych wzrostu w trakcie prowadzenia hodowli. Dla wybranych klonów i wariantów pod o a wyznaczono: maksymalny przyrost OD w czasie (ΔOD max, h - ), plon biomasy (OD max ), czas trwania lag fazy (h) oraz czas wzrostu (h). Oznaczenie glukozy, fruktozy i sacharozy. Cukry oznaczano metod HPLC na kolumnie Animex HPX 87H po czonej z detektorem RI w temperaturze pokojowej. Szybko przep ywu fazy ciek ej (,N H SO ) wynosi a, ml h -. Ubytek substratu (sacharozy) oraz przyrost i ubytek produktów (glukozy i fruktozy) obliczono z powierzchni piku, w odniesieniu do standardów [Rywi ska 8]. OMÓWIENIE WYNIKÓW Wszystkie badane klony o fenotypie Suc + Ura + wykazywa y zbli one warto ci plonu biomasy w mikrohodowli prowadzonej w pod o u MMT z % glukozy (rys. ). Pewne zró nicowanie widoczne by o w d ugo ci trwania lag fazy poszczególnych szczepów. Najwy szy plon biomasy (,78), przy najkrótszym czasie lag fazy ( h) oraz maksymalnej szybko ci wzrostu równej,9 h - odnotowano dla genotypu transformanta KLON. Najd u szy czas lag fazy (~ h) odnotowano dla szczepu referencyjnego W9ura- oraz dla szczepu KLON. Ten ostatni oraz B5-5 wyrasta y najlepiej w pod o u MMT z % sacharozy i,% peptonu, osi gaj c podobn ilo biomasy (OD = odpowiednio, i,), przy maksymalnym przyro cie OD w czasie:, h - i,57 h - (rys. ). Krzywe wzrostu pozosta ych klonów mia y przebieg liniowy, a maksymalny plon biomasy nie przekroczy,7 (OD). Szczep wyj ciowy nie wyrasta w warunkach do wiadczenia. W odr bnym do wiadczeniu stwierdzono, e poszczególne klony o fenotypie Suc + Ura + w zró nicowany sposób wyrastaj w pod o u MMT z % sacharozy i,% peptonu (rys. ). Oceniano wzrost szczepu wyj ciowego oraz klonów. Krzywe sporz dzone dla wi kszo ci transformantów, a zw aszcza dla KLON, obrazuj liniowy wzrost dro d y i wskazuj jednocze nie na zró nicowany metabolizm szczepów. Tym razem najwy szy plon biomasy odnotowano dla KLON i KLON. Wynosi on,8 i,55 warto ci OD, przy maksymalnym przyro cie w czasie, h - i, h -, odpowiednio dla pierwszego i drugiego z opisywanych klonów. Warto maksymalnej szybko ci wzrostu szczepu KLON, wyznaczona w dwóch do wiadczeniach by a podobna (, h - oraz, h - ). Niemniej szybko wzrostu transformantów by a ponad dwukrotnie ni sza ni warto wyznaczona przez Robak [7] dla szczepu wyj ciowego (dzikiego) Acta Sci. Pol.

5 Wzrost z sacharozy klonów dro d y 9 A- i jego mutantów octanowych wyrastaj cych w pod o u MMT z glukoz. Szczep dziki (A-) oraz mutanty octanowe w zró nicowany sposób wyrasta y tak e w pod o- u z glicerolem, octanem sodu, etanolem. Zatem nieukierunkowane zmiany w genomie, czyli mutacje spowodowane na wietlaniem w UV, prowadz do pozyskania szczepów o zró nicowanych w a ciwo ciach metabolicznych. Mo liwe jest, e obserwowane ró nice we wzro cie pozyskanych klonów o fenotypie Suc +, uzyskanych po transformacji jednego szczepu wyj ciowego t sam sekwencj, mog y by spowodowane integracj kasety w odmienne miejsca genomu. Mo e to by zwi zane z wp ywem s siedztwa ró nych sekwencji na regulacj ekspresji genu inwertazy lub obecno ci dwóch kopii wprowadzonego genu SUC potwierdzon w badaniach dla B5-5 (wyniki przygotowywane do druku). Efektem tego mo e by zró nicowana indukcja promotora XPR u ró nych szczepów. Bez peptonu klony Y. lipolytica z genem inwertazy nie s zdolne do wzrostu w pod o u z sacharoz. Indukcj peptonem promotora XPR odnotowali ju w 989 roku Nicaud i in., a potwierdzili Blanchin-Roland i in. [99] oraz Madzak i in. [], wykazuj c jednocze nie wp yw ph na regulacje jego ekspresji. OD [ - 58 nm] OD [ - 58 nm],75,5,5,75,5,5,75,5,5,75,5,5 MMT Glu% czas czas [h] [h] time MMT Suc Suc% Pepton Pepton,% czas [h] czas [h] time Szczep Strain. Y. lipolytica A- B7-. Y. lipolytica A- BA-5. Y. lipolytica A- B-. Y. lipolytica A- B Y. lipolytica A- B58-. Y. lipolytica A- B59-7. Y. lipolytica A- B- 8. Y. lipolytica A- B-5 9. Y. lipolytica A- B-. Y. lipolytica A- KLON. Y. lipolytica A- KLON. Y. lipolytica A- W9 ura- Rys.. Wzrost klonów o fenotypie Suc + Ura + na pod o u MMT z % glukozy oraz z % sacharozy i,% peptonu Fig.. Suc + Ura + clones growth on MMT medium with % glucose and % sucrose and,% peptone Biotechnologia 8() 9

6 E. Walczak, M. Robak OD [ - 58 nm] OD [ - 58 nm] MMT Sacharoza %, Pepton,%,75 Sucrose Peptone,5,5,75,5, czas czas [h] [h] time MMT Sacharoza %, Pepton,% Sucrose Peptone,75,5,5,75,5, czas czas [h] [h] time Szczep Strain. Y. lipolytica A- WT. Y. lipolytica A- KLON. Y. lipolytica A- KLON. Y. lipolytica A- KLON 5. Y. lipolytica A- KLON. Y. lipolytica A- KLON 7. Y. lipolytica A- KLON 7 8. Y. lipolytica A- KLON 9 9. Y. lipolytica A- KLON. Y. lipolytica A- KLON 9. Y. lipolytica A- KLON. Y. lipolytica A- KLON 5. Y. lipolytica A- KLON 8. Y. lipolytica A- KLON Rys.. Wzrost wybranych szczepów o fenotypie Suc + Ura + na pod o u MMT z % sacharozy oraz, lub,% peptonu Fig.. Growth of Suc + Ura + selected strains on MMT medium with % sucrose and, or,% peptone OD [ - 58 nm],75,5,5,75,5,5 MMT MMT Suc% % Pepton,% Uracyl Peptone Uracil czas [h] time czas [h] 5 Szczep Strain. Y. lipolytica A- B5-. Y. lipolytica A- B55-. Y. lipolytica A- B57-. Y. lipolytica A- A8 5. Y. lipolytica A- WT. Y. lipolytica A- W9 ura- Rys.. Wzrost klonów o fenotypie Suc + Ura - na pod o u MMT z,% peptonu, % sacharozy i uracylem Fig.. Growth of Suc + Ura - strains on MMT medium with,% peptone, % sucrose and uracil Acta Sci. Pol.

7 Wzrost z sacharozy klonów dro d y Wad stosowania tego promotora w produkcji bia ka prowadzonej na skal przemys ow jest konieczno regulacji jego aktywno ci, wymagaj ca obecno ci peptonu lub utrzymania odpowiedniego ph rodowiska. Dlatego d y si do pozyskania klonów, u których ju minimalna dawka peptonu warunkuje aktywno promotora. W przypadku badanych transformantów zastosowano dwie dawki peptonu:, i,%. Z danych przedstawionych na rysunku wynika, e przy dawce,% wyrastaj wszystkie klony, a niektórym do wzrostu z sacharozy wystarcza ju,% peptonu. Zatem dla pozyskanych klonów wystarczaj ca dawka induktora jest od,7 do 5 razy mniejsza, ni dawka odnotowana przez innych badaczy [Nicaud i in. 989, Förster i in. 7]. W niezale nych badaniach stwierdzili oni, e niezb dna dawka peptonu, warunkuj ca ekspresj inwertazy wynosi od,7 do,5%. W warunkach do wiadczenia przy,% dodatku peptonu dobrze wyrasta y dwa transformanty: KLON i KLON. Wysoki by plon biomasy (odpowiednio,9 i,5 OD) i zadowalaj cy przyrost OD w czasie (odpowiednio, i,9 h - ) (rys. ). Czas trwania lag fazy dla KLON by taki sam jak w hodowli z,% peptonu, a dla KLON by krótszy o ponad godziny. Wydaje si wi c, e promotor XPR u tych dwóch klonów jest w inny sposób regulowany ni u pozosta ych transformantów, które przy,% peptonu nie by y zdolne do wzrostu z sacharozy. Prawdopodobnie indukcja samego promotora u tych klonów jest g ównie wynikiem dzia ania ph, a mniej peptonu. Podobne spostrze enia odnotowali Förster i in. [7]. W kolejnym do wiadczeniu analizowano wzrost w pod o u MMT z % sacharozy i,% peptonu klonów o fenotypie Suc + Ura -. Wyrasta y one s abiej z sacharozy ni klony o fenotypie Suc + Ura + (rys. ). Najwy szy plon biomasy, równy,9 OD, przy rednim maksymalnym przyro cie OD,5 h -, stwierdzono dla szczepu referencyjnego W9ura-. Spo ród pozyskanych transformantów najwy szy plon biomasy (OD,75), najwi kszy maksymalny przyrost OD w czasie (,7 h ) i najkrótszy okres lag fazy ( h) odnotowano dla klonu B55-. Pozosta e klony wyrasta y s abiej i nie osi gn - y stacjonarnej fazy wzrostu. Kolejn mikrohodowl prowadzono dla szczepu wyj ciowego, klonów o fenotypie Suc + Ura + (B5-5) oraz Suc + Ura - (A8 oraz B57-). Jako ród o w gla zastosowano % sacharozy, % fruktozy lub % glukozy. Jednolity wzrost klonów odnotowano na pod- o u z % glukozy oraz % fruktozy (rys. ). Szczep wyj ciowy (dziki) oraz B57- wyrasta y najlepiej z glukozy, osi gaj c plon biomasy (OD),7 i,. Dla pozosta- ych klonów warto ta by a minimalnie ni sza. Dla wszystkich szczepów oraz rodzica mo na zaobserwowa, e wzrost logarytmiczny transformantów trwa godzin hodowli na glukozie i 8 h hodowli na fruktozie, co wiadczy o tym, e przeprowadzone modyfikacje nie wp yn y na szybko wykorzystania glukozy i fruktozy. Natomiast przeprowadzona analiza ponownie wykaza a zró nicowan zdolno wybranych klonów do hydrolizy sacharozy (rys. ). Szczep B5-5 osi ga najwi kszy plon biomasy oraz wykazywa najwi kszy przyrost OD w czasie. W badaniach z wykorzystaniem promotora XPR warunkiem jego indukcji jest dodatek peptonu oraz utrzymanie ph,8 hodowli np. przez dozowanie,5 N NaOH. Dlatego w nast pnym cyklu mikrohodowli analizowano wp yw buforu fosforanowego ph,8 na plon biomasy, szybko przyrostu OD oraz d ugo lag fazy szczepu wyj- ciowego i trzech klonów o fenotypie Suc + Ura + : KLON, B5-5 oraz B-. Biotechnologia 8() 9

8 E. Walczak, M. Robak OD [ - 58 nm] OD [ - 58 nm] OD [ - 58 nm],75,5,5,75,5,5,75,5,5,75,5,5,75,5,5,75,5,5 MMT Sacharoza % Pepton,% Sucrose Peptone czas czas [h] [h] time MMT Glukoza % Glucose czas czas [h] [h] time MMT Fruktoza % Fructose czas [h] czas time [h] Szczep Strain. Y. lipolytica A- WT. Y. lipolytica A- B5-5. Y. lipolytica A- A8. Y. lipolytica A- B57- Rys.. Wzrost wybranych klonów na pod o ach MMT z % sacharozy i,% peptonu; % glukozy oraz % fruktozy Fig.. Growth of selected strains on MMT medium with % sucrose and,% peptone; % glucose and % fructose Zastosowano pod o e MMT z sacharoz w ilo ci od do %, z,% dodatkiem peptonu oraz buforem fosforanowym ph,8. Obecno buforu pozytywnie wp yn a na plon biomasy uzyskanej w pod o u z ró nymi dawkami sacharozy. Wszystkie klony wyrasta y lepiej w zbuforowanym pod o u (rys. 5). Nie odnotowano znacznych zmian we wzro cie w pod o u zawieraj cym od do % sacharozy, a najwi kszy plon biomasy (OD =,9) uzyskano dla KLON w pod o u z 5% sacharozy. Dopiero przy i % dawce ród a w gla obserwowano ni szy wzrost klonów. W pod o u bez dodatku buforu fosforanowego ph,8 najwy szy plon biomasy (OD =,8) uzyskano dla Acta Sci. Pol.

9 Wzrost z sacharozy klonów dro d y B5-5 w pod o u z % sacharozy, w którym tak e pozosta e szczepy wyrasta y najlepiej. Najwi kszy wp yw obecno ci buforu na plon biomasy dla wszystkich klonów odnotowano w pod o u z i 5% sacharozy. Odnotowano a,7 punktu ró nicy OD. Natomiast jednocze nie ze wzrostem st enia sacharozy mala wp yw buforu na plon biomasy. Prawdopodobnie zastosowany uk ad buforowy by za s aby w stosunku do ilo ci wydzielanego kwasu cytrynowego i obserwowano zahamowanie wzrostu dro d y. Dro d e te s znane z biosyntezy cytrynianu, znacznie zakwaszaj cego pod o e [Wojtatowicz i in. 997]. Pod o e Pod o e MMT z z buforem Medium MMT with buffer Pod o e Pod o e MMT bez bez buforu buforu Medium MMT without buffer OD [8-5 nm],5,5 OD [8-5 nm],5,5 5 Sucrose concentrated 5 Sucrose concentrated Szybko Szybko przyrostu przyrostu OD [g/l/h]] OD Increase [g/l/h]] speed,5,,5 Pod o e Pod o e MMT MMT z z buforem buforem Medium MMT with buffer 5 Sucrose concentrated Szybko przyrostu OD [g/l/h]] Szybko przyrostu OD Increase [g/l/h] speed,5,,5 Pod o e Pod o e MMT MMT bez bez buforu buforu Medium MMT without buffer 5 Sucrose concentrated Szczep Strain. Y. lipolytica A- KLON. Y. lipolytica A- B5-5. Y. lipolytica A- B-. Y. lipolytica A- WT Pod o e MMT z buforem Pod o e MMT z buforem Medium MMT with buffer Pod o e MMT bez buforu Pod o e MMT bez buforu Medium MMT without buffer Lag faza [h] 9 Lag faza [h] 9 5 St enie St enie sacharozy sacharozy [%] [%] Sucrose concentrated 5 Sucrose concentrated Rys. 5. Wzrost klonów o fenotypie Suc + Ura + na pod o u MMT z % sacharozy,,% peptonu oraz buforem fosforanowym o ph,8 Fig. 5. Growth of Suc + Ura + strains on MMT medium with % sucrose,,% peptone and phosphate buffer ph,8 Biotechnologia 8() 9

10 E. Walczak, M. Robak Stwierdzono pozytywny wp yw obecno ci buforu fosforanowego o ph,8 na szybko wzrostu i to bez wzgl du na st enie sacharozy w pod o u. W zbuforowanym pod o u MMT szybko przyrostu OD dla KLON i B5-5 ros a wraz z gradacj st enia sacharozy, osi gaj c maksymaln warto w pod o u z % sacharozy (odpowiednio,7 i, h - ) (rys. 5). Dla szczepu B- maksymaln szybko przyrostu OD odnotowano w pod o u z 5% sacharozy (,9 h - ). W przypadku dro d y hodowanych w pod o u bez buforu fosforanowego, maksymalne szybko ci przyrostu OD by y mniejsze i to bez wzgl du na st enie ród a w gla. Najwy sze warto ci przyrostu OD (,88 i,8 h - ) odnotowano przy i 5% sacharozy, odpowiednio dla KLON oraz B5-5. Dodatek buforu mia tak e wp yw na d ugo trwania lag fazy klonów. Obecno buforu fosforanowego spowodowa a wyd u enie lag fazy dla wszystkich klonów (rys. 5). Jedynie klon B- w pod o u z % sacharozy mia krótszy czas lag fazy ni w pod o- u bez buforu. W pod o u MMT bez dodatku buforu czas lag fazy by zdecydowanie krótszy, a wzrost st enia sacharozy powodowa jego wyd u enie do godzin. Najwi ksze ró nice w czasie trwania lag fazy (8 h), ze wzgl du na obecno lub brak buforu obserwowano w pod o u z 5 i % sacharozy. WNIOSKI. Transformanty dro d y Yarrowia lipolytica A- o fenotypie Suc + Ura + oraz Suc + Ura - w ró ny sposób wyrasta y z sacharozy. Wynika to prawdopodobnie z integracji ekspresyjnej kasety dro d owej w ró ne miejsca genomu oraz odmiennej indukcji promotora XPR.. Dwa klony o fenotypie Suc + Ura + wyrasta y z sacharozy, przy nie opisanej dot d bardzo niskiej dawce peptonu (,%). Dla pozosta ych klonów niezb dne by o stosowanie dziesi ciokrotnie wi kszej dawki induktora.. Stwierdzono tak e, e w zbuforowanym rodowisku (ph,8) komórki intensywnie si dzieli y, nie osi gaj c stacjonarnej fazy wzrostu.. Badane klony nie ró ni y si we wzro cie z glukozy oraz fruktozy. Wprowadzone modyfikacje genetyczne nie wp yn y na komórkowy metabolizm tych róde w gla. PI MIENNICTWO Blanchin-Roland S., Cordero Otero R.R., Gaillardin C., 99. Two upstream activating sequence control the expression of the XPR Gene in the yeast Yarrowia lipolytica. Mol. Cell Biol., (): 7 8. Förster A., Aurich A., Mauersberger S., Barth G., 7a. Citric acid production from sucrose using a recombinant strain of the Yarrowia lipolytica. Appl. Microbiol. Biotechnol., 75 (): 9 7. Gellissen G., Kunze G., Gaillardin C., Cregg J.M., Berardi E., Veenhuis M., van der Klei I., 5. New yeast expression platforms based on methylotrophic Hansenula polymorpha and Pichia pastoris and on dimorphic Arxula adeninivorans and Yarrowia lipolytica A comparison. FEMS Yeast Res., 5: Acta Sci. Pol.

11 Wzrost z sacharozy klonów dro d y 5 Hamsa P.V., Chattoo B.B., 99. Cloning and growth-regulated expression of the gene encoding the hepatitis B virus middle surface antigen in Yarrowia lipolytica. Gene, : 5 7. Juretzek T., Le Dall M.T., Mauersberger S., Gaillardin C., Barth G., Nicaud J.M.,. Vectors for gene expression and amplification in the yeast Yarrowia lipolytica. Yeast,, 8(): 97. Madzak C., Nicaud J.M., Gaillardin C., 5. Yarrowia lipolytica, [in:] Gellissen G., (Ed)., Production of recombinant proteins. Novel Microbial and Eukaryotic Expression System. WILEY-VCH VerlagGmbH & Co. KgaA. Madzak C., Treton B., Blanchin-Roland S.,. Strong hybrid promoters and integrative expression/secretion vectors for quasi-constitutive expression of heterologous proteins in the yeast Yarrowia lipolytica. J. Mol. Microbiol. Biotechnol., (): 7. Nicaud J.M., Fabre E., Gaillardin C., 989. Expression of invertase activity in Yarrowia lipolytica and its use as a selective marker. Curr. Genet., (): 5. Nicaud J.M., Madzak C., van der Broek P., Gysler C., Duboc P., Niederberger P., Gaillardin C.,. Protein expression and secretion in the yeast Yarrowia lipolytica. FEMS Yeast Res., : Park C.S., Chang C.C., Kim J.Y., Ogrydziak D.M., Ryu D.Y., 997. Expression, secretion, and processing of rice α-amylase in the yeast Yarrowia lipolytica. J. Biol. Chem., 7: Robak M., 7. Yarrowia lipolytica specific growth rate on acetate medium supplemented with glucose, glycerol, ethanol. Acta Sci. Pol., Biotechnol., ():. Robak M., Walczak E., 9. Niekonwencjonalne dro d e w produkcji heterologicznych bia ek, Biotechnologia, 9(87): 5. Rywi ska A., 8. Wykorzystanie glicerolu odpadowego do biosyntezy kwasu cytrynowego przez Yarrowia lipolytica Wratislavia AWG7. Acta Sci. Pol., Biotechnol. 7():. Walczak E., Robak M., Mauersberger S., 7a. Transformacja szczepu niekonwencjonalnych dro d y Yarrowia lipolytica. III Krajowy Kongres Biotechnologii, 9 wrze nia 7a, Pozna. Walczak E., Robak M., Mauersberger S., 7b. Gene disruption, transformants selection and physiologic properties of Yarrowia lipolytica A clones. 8th International Symposium on Biocatalysis and Biotransformations BIOTRANS b, Oviedo, Hiszpania. Watson J.D., Baker T.A., Bell S.P., Gann A., Levine M., Losick R., 8. Molecular biology of the gene (th Edition). Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. Wojtatowicz M., Rymowicz W., Robak M., arowska B., Nicaud J.M., 997. Kinetics of cell growth amd citric acid production by Yarrowia lipolytica Suc + transformants in sucrose media. Pol. J. Food Nutr. Sci., /7:, 9 5. GROWTH ON SUCROSE OF YARROWIA LIPOLYTICA YEASTS CLONES WITH INVERTASE GENE FROM SACCHAROMYCES CEREVISIAE Abstract. The aim of the study was to evaluate the growth of potential heterologous proteins producers: Suc + clones of Yarrowia lipolytica A-. Growth of transformants, parental strain (wild) and reference strain W9ura- was studied. Transformants showed differences in the ability of growth on sucrose (biomass, lag time duration, beginning of stationary phase). Beside the type of transformation, no differences in yeasts growth were observed on glucose and fructose. Biotechnologia 8() 9

12 E. Walczak, M. Robak Influence of ph (,8) and peptone addition (, and %) on XPR promoter induction was analyzed. Both inducers were effective, allowing yeasts growth on sucrose. Growth of two transformants: KLON and KLON on sucrose was abundant, even with minimal peptone dose (,%). Stabilization of ph at,8 in the first hours of yeasts growth had a positive effect on culture. Clones grew better with buffer in the medium with % sucrose, a substrate concentration which has induced longer lag phase. Key words: Yarrowia lipolytica, Suc + Ura +, Suc + Ura -, sucrose, XPR, Bioscreen C Zaakceptowanodo druku Accepted for print: 5..9 Do cytowania For citation: Walczak E., Robak M., 9. Wzrost z sacharozy klonów dro d y Yarrowia lipolytica z genem inwertazy z Saccharomyces cerevisiae. Acta Sci. Pol. Biotechnol. 8(), 5. Acta Sci. Pol.