A N N A L E S U N I V E R S I T A T I S M A R I A E C U R I E - S K Ł O D O W S K A L U B L I N P O L O N I A

Transkrypt

1 A N N A L E S U N I V E R S I T A T I S M A R I A E C U R I E - S K Ł O D O W S K A L U B L I N P O L O N I A VOL. LXI, SECTIO DD 006 * Zakład Mikrobiologii Weterynaryjnej, ** Zakład Prewencji Weterynaryjnej, *** Zakład Biochemii Katedry Biochemii i Fizjologii Zwierzt, **** Katedra Anatomii i Histologii Zwierzt Akademii Rolniczej w Lublinie STANISŁAW TOKARZEWSKI *, ANDRZEJ WERNICKI **, MARTA KANKOFER ***, RENATA URBAN-CHMIEL **, MARCIN ARCISZEWSKI **** Transport jako czynnik wzmagajcy reakcje stresowe u brojlerów kurzych Transport of chicken broilers as an agent increased stress response STRESZCZENIE Intensywna produkcja zwierzt, a zwłaszcza drobiu, w istotny sposób sprzyja wystpowaniu sytuacji stresowych. Powszechnie znany jest fakt niekorzystnego wpływu stresu na organizm ptaków, prowadzcy do wzrostu zachorowalnoci na skutek zakłóce odpowiedzi immunologicznej. W wyniku tego nawet słabo patogenne drobnoustroje mog przyczynia si do wystpowania infekcji i rozwoju klinicznego obrazu choroby. Celem przeprowadzonych bada było okrelenie wpływu transportu jako czynnika wzmagajcego reakcje stresowe u brojlerów kurzych. Badania wykonano na grupach ptaków rasy Ross 08 w wieku i 0 dni, z których kada liczyła sztuk. Ptaki były klinicznie zdrowe, wolne od pasoytów oraz wolne od zakae pałeczkami Salmonella spp. Podczas dowiadczenia kad sztuk przetrzymywano w oddzielnej klatce. Ptaki transportowano godzin na odległo 80 km. Materiał do bada stanowiły rozmazy krwi oraz krew pobrana z yły skrzydłowej przed transportem, bezporednio po transporcie oraz na dni po transporcie. W celu okrelenia natenia stresu obliczono stosunek heterofilów do limfocytów (H/L), który u ptaków jest podstawowym wskanikiem stresu. W próbkach surowic oznaczono stenie białka całkowitego przy wykorzystaniu reakcji biuretowej przy długoci fali 6 nm. Stenie kortyzolu w surowicach okrelono testem ELISA, po zastosowaniu ekstrakcji eterowej metod Möstla i in. oraz Palme a i in. Uzyskane wyniki poddano analizie statystycznej testem t-studenta. W wyniku przeprowadzonych dowiadcze stwierdzono statystycznie istotny wzrost H/L (p<0,0) w obydwu grupach brojlerów bezporednio po transporcie. Wykazano nieznaczny wzrost stenia białka całkowitego zarówno u ptaków w wieku, jak i 0 dni, szczególnie widoczny w. dniu po transporcie. W surowicach - oraz 0-dniowych brojlerów kurzych zaobserwowano statystycznie istotny wzrost (p<0,0) stenia kortyzolu po transporcie w porównaniu z warto- ciami uzyskanymi przed transportem. Otrzymany w badaniach własnych istotny wzrost poziomu H/L oraz kortyzolu w surowicach przewoonych brojlerów kurzych wiadczy o przebiegu reakcji stresowej wywołanej czynnikami zwizanymi z transportem. Słowa kluczowe: stres transportowy, brojlery kurze, współczynnik H/L, kortyzol, białko całkowite

2 8 S. TOKARZEWSKI, A. WERNICKI, M. KANKOFER, R. URBAN-CHMIEL I IN. WSTP Jednym z czynników zwizanych z aktualnie stosowanymi systemami produkcji drobiu jest transport. Odbywa si on w rónych okresach ycia ptaków, tj. od bardzo młodych (jednodniowe pisklta), poprzez intensywnie tuczone (brojlery), a po osobniki dojrzałe (nioski towarowe lub reprodukcyjne). Transport, niezalenie od tego, w jaki sposób jest przeprowadzany, stanowi dla przewoonych ptaków ogromny czynnik stresowy. Oddziałujc bezporednio na organizm zwierzt, powoduje powstawanie niekontrolowanej reakcji stresowej. Przyczynami strat zwierzt hodowlanych i rzenych, w tym drobiu, podczas transportu s nieodpowiednie warunki i zmczenie zwierzt, wynikajce z niewłaciwej organizacji. Istotny wpływ odgrywa take stres psychiczny oraz cieplny. Straty ujawniaj si w postaci spadku masy ciała, zachorowa oraz padni przewoonych zwierzt. Przewóz w porze letniej powoduje wiksze zmczenie ni transport zim. Na stopie zmczenia wpływa take sposób chowu ptaków w okresie poprzedzajcym transport, np. brojlery, które zgodnie z cyklem produkcyjnym utrzymywane s na ograniczonej przestrzeni, nieprzyzwyczajone do swobodnego ruchu mcz si szczególnie łatwo. Innym wanym czynnikiem jest masa ciała. Wielko ubytku ciaru przewoonych ptaków nie jest stała i ulega zmianie w zalenoci od przynalenoci gatunkowej, sposobu i czasu trwania przewozu, systemu odywiania w okresie poprzedzajcym transport, stopnia utuczenia, pory roku oraz powierzchni klatek. Przewoone ptaki podlegaj na ogół bardzo silnemu stresowi psychicznemu, który zaley od obsługi i przygotowania rodków transportu [Möstl i in. 999, Graczyk i in. 00]. Bardzo istotnym czynnikiem stresowym jest strach, powstały w wyniku oddzielenia ptaków od ich dotychczasowego miejsca bytowania. Kademu stresowi, a szczególnie psychicznemu, towarzyszy nadmierne wydzielanie hormonów kortykotropowych, które działajc supresyjnie na układ odpornociowy, powoduj zwikszon wraliwo organizmu na zakaenia bakteriami endogennego pochodzenia [De Jong i in. 00]. U zwierzt gospodarskich głównymi kortykoidami s kortyzol, kortyzon i aldosteron, natomiast u ptaków i gadów podstawowym hormonem korowo-nadnerczowym jest kortykosteron, którego koncentracja jest 00-krotnie wiksza ni kortyzolu [Palme i in. 999, Puvadolpirod i Thaxton 000, De Jong i in. 00]. Metabolizm poszczególnych hormonów sterydowych w korze nadnerczy jest kierowany enzymatycznie. Przyjmuje si, e układy enzymatyczne s podobne u wszystkich krgowców, rónice wystpuj natomiast w iloci poszczególnych hormonów. Celem przeprowadzonych bada było okrelenie wpływu czynników zwizanych z transportem ptaków na podstawowe parametry stresu u brojlerów kurzych. MATERIAŁ I METODY Badania wykonano na grupach - i 0-dniowych ptaków rasy Ross 08, z których kada liczyła sztuk. Brojlery kurze pochodziły z ferm zlokalizowanych w okolicach Lublina. Ptaki były klinicznie zdrowe, wolne od pasoytów oraz zakae pałeczkami Salmonella spp. Podczas do- wiadczenia kad sztuk przetrzymywano w oddzielnej klatce. Ptaki przewoono godzin na odległo 80 km. Po przybyciu na miejsce, brojlery były w dobrej kondycji oraz cechowały si charakterystycznym dla tego gatunku ptaków behawiorem. U transportowanych ptaków nie obserwowano adnych klinicznie uchwytnych objawów chorobowych. Materiał do bada stanowiła krew pobrana z yły skrzydłowej przed transportem, bezporednio po jego zakoczeniu oraz na dni po transporcie. Po wykonaniu rozmazów próbki krwi wirowano, a uzyskane surowice przechowywano w temperaturze 0 o C.

3 TRANSPORT JAKO CZYNNIK WZMAGAJ CY REAKCJE STRESOWE... 9 W uzyskanych rozmazach obliczono stosunek heterofilów do limfocytów (H/L) metod Collette a i in. [000]. Rozmazy ogldano pod mikroskopem Nikon, w powikszeniu 600x. W próbkach surowic oznaczono stenie białka całkowitego, wykorzystujc reakcj biuretow (Cormay Total protein 60) i uywajc fotomertu LP 00 (Dr Bruno Lange, GmbH) przy długo- ci fali 6 nm. Stenie kortyzolu w surowicach okrelono testem ELISA (uzyskanym dziki uprzejmoci prof. Ericha Möstla z Uniwersytetu Weterynaryjnego w Wiedniu), po zastosowaniu ekstrakcji eterowej metod Möstla i in. [999] oraz Palme a i in. [999]. Absorbancja próbek była odczytywana bezporednio po zakoczeniu testu, przy uyciu czytnika do mikropłytek Labsystem Multiskan RC, z zastosowaniem filtrów o długociach fal 0 oraz 60 nm. Uzyskane wyniki poddano analizie statystycznej testem t-studenta z wykorzystaniem programu Statistica 6.0. OMÓWIENIE WYNIKÓW Transport jako jeden z podstawowych czynników stresowych oddziałuje modulujco na humoraln i komórkow odpowied immunologiczn zwierzt. Intensywno tego oddziaływania uzaleniona jest głównie od czasu trwania transportu, pory dnia, zastosowanego rodka transportu, warunków rodowiskowych, a take kondycji i wieku przewoonych zwierzt. Podstawowym wskanikiem nasilenia reakcji stresowej u ptaków jest stosunek heterofilów do limfocytów (H/L) [McFarlane i Curtis 989, al-murrani i in. 997]. Według Grossa i Siegla [98] wskanik ten mona uzna za bardziej wiarygodny i obiektywny wyznacznik stresu ni poziom hormonów sterydowych w surowicy. Jak wykazano na rys., w rozmazach pochodzcych od -dniowych brojlerów kurzych znaczcy wzrost (p<0,0) współczynnika H/L uzyskano bezporednio po transporcie (0,6±0,0) w porównaniu z wartociami uzyskanymi przed transportem (0,06±0,078). Podobn tendencj wykazano take u 0-dniowych ptaków (rys. ). W. dniu po transporcie wartoci H/L w obu badanych grupach ptaków uległy obnieniu w stosunku do wartoci uzyskanych bezporednio po transporcie. Spadek ten był jednak niszy dla ptaków w wieku dni (0,±0,08) ni u brojlerów kurzych w wieku 0 dni (0,88±0,067 rys., 0,8 0,7 heterofile/limfocyty heterophile/lymphocyte ratio 0,6 0, 0, 0, 0, 0, 0 Przed transportem Before transport Bezposrednio po transporcie dni po transporcie days after transport Rys.. Wartoci rednie H/L () u -dniowych brojlerów kurzych Fig.. Mean H/L ratio () obtained from day-old broilers

4 0 S. TOKARZEWSKI, A. WERNICKI, M. KANKOFER, R. URBAN-CHMIEL I IN. rys. ). Podobne wyniki uzyskali Mills i in. [99] u przepiórek japoskich, u których wzrost wartoci H/L nastpił po godzinach od zadziałania czynnika stresowego, zbliajc si nastpnie do wartoci uzyskanych u ptaków z grupy kontrolnej. Take Gross i Siegel [98] stwierdzili znaczny wzrost współczynnika H/L po wywołaniu stresu u brojlerów kurzych w stosunku do wartoci kontrolnych. Podobn tendencj obserwowano równie w odpowiedzi na stres u innych gatunków ptaków. Z kolei u papuek Amazonek poddanych stresowi (łapanie ptaków) stwierdzono jedynie nieznaczny wzrost wartoci współczynnika H/L w stosunku do wartoci kontrolnych [Collette i in. 000]. 0,8 0,7 heterofile/limfocyty heterophile/lymphocyte ratio 0,6 0, 0, 0, 0, 0, 0 Przed transportem Before transport Bezposrednio po transporcie dni po transporcie days after transport Rys.. Wartoci rednie H/L () u 0-dniowych brojlerów kurzych Fig.. Mean H/L ratio () obtained from 0 day-old broilers W obu grupach wiekowych ptaków zaobserwowano bezporednio po transporcie oraz w. dniu po transporcie wzrost stenia białka całkowitego surowicy (rys., ). Uzyskane wartoci dla brojlerów -dniowych kształtowały si nastpujco:,0, 6,8,,8 g/l, natomiast dla 0-dniowych wynosiły odpowiednio: 7,8,,76, 7,6 g/l. Uzyskane rezultaty s zgodne z wynikami przedstawionymi przez Puvadolpiroda i Thaxtona [000]. Białko całkowite Total protein level , 6,8,8 Przed transportem Bezporednio po transporcie dni po transporcie Before transport days after transport Rys.. rednie stenie białka całkowitego w g/l (OD±SD) u -dniowych brojlerów kurzych Fig.. The mean total protein level in g/l (OD±SD) obtained from day-old broilers

5 TRANSPORT JAKO CZYNNIK WZMAGAJ CY REAKCJE STRESOWE Białko całkowite Total protein level ,6,76 7,8 Przed Przed transportem Bezposrednio po transporcie transportem Bezporednio po transporcie dni dni po po transporcie Before Before transport transport days after transport transport Rys.. rednie stenie białka całkowitego w g/l (OD±SD) u 0-dniowych brojlerów kurzych Fig.. The mean total protein level in g/l (OD±SD) obtained from 0 day-old old broilers W surowicach uzyskanych od transportowanych -dniowych brojlerów kurzych obserwowano statystycznie istotne rónice (p<0,0) w poziomie kortyzolu w porównaniu z wartociami uzyskanymi przed transportem. rednie stenie kortyzolu oznaczone przed transportem wynosiło 7,0±,89 nmol/ml, natomiast w surowicach uzyskanych od zwierzt bezporednio po transporcie warto ta była równa 8,068±,8 nmol/ml, a u ptaków w. dniu po transporcie wynosiła 8,98±,007 nmol/ml (tab. ). Tabela. rednie stenie kortyzolu w nmol/l (OD±SD) w surowicach pochodzcych od -dniowych brojlerów kurzych Table. The mean cortisol concentration in nmol/l (OD±SD) in serum obtained from day-old broilers Nr brojlera No of broiler Przed transportem Before transport Bezporednio po transporcie dzie po transporcie days after transport.,86 8, 6,88. 6,0,7,0. 7,668 7,766 8,78. 0,0 9,06 0,0. 0,0 0,088, OD±SD 7,0±,89 8,068 * ±,8 8,98 ** ±,007 * Rónice istotne statystycznie (p<0,0) w porównaniu z grup przed transportem. Significant differences at p<0.0 compared to group before transport. ** Rónice istotne statystycznie (p<0,0) w porównaniu z grup po transporcie. ** Significant differences at p<0.0 compared to group immediately after transport. U 0-dniowych brojlerów kurzych równie obserwowano statystycznie istotne rónice (p<0,0) w poziomie stenia kortyzolu w porównaniu z wartociami uzyskanymi przed transportem. rednie stenie kortyzolu oznaczone przed transportem wynosiło

6 S. TOKARZEWSKI, A. WERNICKI, M. KANKOFER, R. URBAN-CHMIEL I IN.,9±,879 nmol/ml, natomiast w surowicach uzyskanych od zwierzt bezporednio po transporcie warto ta była równa 9,7±,66 nmol/ml, a u ptaków w. dni po transporcie wynosiła,78±,6 nmol/ml (tab. ). Tabela. rednie stenie kortyzolu w nmol/l () w surowicach pochodzcych od 0-dniowych brojlerów kurzych Table. The mean cortisol concentration in nmol/l () in serum obtained from 0 day-old broilers Nr brojlera No. of broiler Przed transportem Before transport Bezporednio po transporcie dzie po transporcie days after transport. 7,0 9,,7.,80,098 9,.,8 6,9,.,0,6,8.,088,6 7,6 OD±SD,9±,879 9,7 * ±,66,78 ** ±,6 * Rónice istotne statystycznie z (p<0,0) w porównaniu z grup przed transportem Significant differences at p<0.0 compared to group before transport ** Rónice istotne statystycznie z (p<0,0) w porównaniu z grup po transporcie Significant differences at p<0.0 compared to group immediately after transport Uzyskane rezultaty s zgodne z wynikami przedstawionymi przez Mohameda i Hansona [980], którzy potwierdzili, e niedojrzałe kurczta poddane stresowi miały podwyszony poziom kortyzolu w surowicach przez pierwsze godziny po zadziałaniu stresu. W badaniach innych autorów u kurczt po iniekcji ACTH (adrenokortykotropiny) i deksametazonu stwierdzono nawet 6-krotny wzrost stenia kortyzolu w surowicy (wartoci od 9 do 8 ng/ml), a nastpnie spadek po godzinach od stymulacji do wartoci oznaczonych przed dowiadczeniem (,, ng/ml) [Dehnhard i in. 00]. Z kolei u papug Amazonek po stymulacji ACTH stwierdzono wzrost stenia kortyzolu od wartoci 0,60 do 0,66 µg/dl [Zenoble i in. 98]. Otrzymany w badaniach własnych istotny wzrost wartoci kortyzolu w surowicach przewoonych brojlerów kurzych wiadczy o przebiegu reakcji stresowej wywołanej czynnikami zwizanymi z transportem. Hormony sterydowe u ptaków maj wpływ na gospodark lipidow (tj. odkładanie tłuszczu) i cukrow (wzmagaj glukoneogenez). Ponadto wywieraj wpływ na gospodark elektrolitow. Katabolizm sterydów przebiega głównie w wtrobie. Szlak metaboliczny jest odmienny dla rónych hormonów. Kortyzol ulega równoczesnej redukcji i oksydacji, dajc czterohydroksypochodne: kortol i kortolon. Pojawiaj si one w postaci koniugatów z kwasem siarkowym lub glukuronowym we krwi i nie wykazuj aktywnoci biologicznej. Kortyzol w ustroju jest w stanie dynamicznej równowagi ze swoj utlenion form kortyzonem, podobnie jak i kortykosteron ze swoj odwodorowan pochodn dehydrokortykosteronem. Istotny wpływ glikokortykosterydów na podstawowe parametry immunologiczne organizmu obserwowano u wielu gatunków zwierzt [Hawkey 989, Renden i in. 99]. Jednak zrónicowanie wyników bada uzyskiwanych w orodkach naukowych moe by rezultatem zmian czasu trwania i warunków transportu oraz wieku przewoonych zwierzt.

7 TRANSPORT JAKO CZYNNIK WZMAGAJ CY REAKCJE STRESOWE... Brak kompleksowych bada na temat wpływu stresu na poszczególne etapy odpowiedzi immunologicznej oraz układ hormonalny nie pozwalaj jednoznacznie stwierdzi, e uzyskane w badaniach własnych zmiany parametrów mog wynika z jej supresji. Zrónicowanie wyników bada własnych w porównaniu z rezultatami innych autorów wiadczy o złoonym mechanizmie oddziaływania stresu transportowego na organizm ptaków. PIMIENNICTWO al-murrani W.K., Kassab A., al-sam H.Z., al-athari A.M Heterophil/lymphocyte ratio as a selection criterion for heat resistance in domestic fowls. Br. Poult. Sci. 8, 9. Collette J.C., Millam J.R., Klasing K.C. Wakenell P.C Neonatal handling of Amazon parrots alters the stress response and immune function. Appl. Anim. Behav. Sci. 66,. De Jong I. C., Sander van Voorst A., Erkens Jo, H. F., Ehlhardt D.A., Blokhuis H. J. 00. Determination of the circadian rhythm in plasma corticosterone and catecholamine concentrations in growing broiler breeders using intravenous cannulation. Physiol. Behav. 7, 99. Dehnhard M., Schreer A., Krone O., Jewgenow K., Krause M., Grossmann R. 00. Measurement of plasma corticosterone and fecal glucocorticoid metabolites in the chicken (Gallus domesticus), the great cormorant (Phalacrocorax carbo), and the goshawk (Accipiter gentilis). Gen. Comp. Endocrinol.,. El-lethey H., Jungi T. W., Huber-Eicher B. 00. Effects of feeding corticosterone and housing conditions on feather pecking in laying hens (Gallus gallus domesticus). Physiol. Behav. 7,. Graczyk S., Pliszczak-Król A., Kotoski B., Wilczek J., Chmielak Z. 00. Examinations of hematological and metabolic changes mechanisms of acute stress in turkeys. EJPAU, Vet. Med. 6,. Gross W.B., Siegel H.S. 98. Evaluation of the heterophil/lymphocyte ratio as a measure of stress in chickens. Avian Dis. 7, 97. Hawkey C.M Color atlas of comparative veterinary hematology: normal and abnormal blood cells in mammals, birds and reptilels, st ed., Iowa State University Press, Ames. McFarlane J.M., Curtis S.E Multiple concurrent stressors in chicks.. Effects on plasma corticosterone and the heterophil: lymphocyte ratio. Poult. Sci. 6,. Mills A.D., Jones R.B., Williams J.B. 99. Responses to isolation in Japanese quail genetically selected for high or low sociality. Physiol. Behav., 8. Mohamed M. A., Hanson R. P Effect of social stress on Newcastle Disease virus (LaSota) infection. Avian Dis., 908. Möstl E., Messmann S., Bagu E., Robia C., Palme R Measurement of glucocorticoid metabolite concentrations in faeces of domestic livestock. J. Vet. Med. A 6, 6. Palme R., Robia Ch., Messmann S., Hofer J., Möstl E Measurement faecal cortisol metabolites in ruminants: a non-invasive parameter of adrenocortical function. Wien. Tierarztl. Mschr. 86, 7. Puvadolpirod S., Thaxton J. P Model of physiological stress in chickens. Response parameters. Poult. Sci. 79, 6. Renden J.A., Lien R.J., Oates S.S., Bilgili S.F. 99. Plasma concentrations of corticosterone and thyroid hormones in broilers provided various lighting schedules. Poult. Sci. 7, 86. Zenobe R.D., Kemppainen R.J., Young D.W., Clubb S.L. 98: Endocrine responses of healthy parrots to ACTH and thyroid stimulating hormone. J. Am. Vet. Med. Assoc. 87, 6.

8 S. TOKARZEWSKI, A. WERNICKI, M. KANKOFER, R. URBAN-CHMIEL I IN. SUMMARY In intensive breeding of animals, especially poultry is significantly conductive to stressful situations. The fact is commonly known of unfavorable influence of stress factor on the bird organism, which leads to the increase of illnesses, as a result of immunological response dysfunction. Consequently even weak pathogenic microorganisms may add to the appearance of an infection and clinical disease development. The aim of the conducted research was defining the transport stress impact on chicken broilers. The research was conducted on two groups of birds Ross 08 breed, aged and 0 days old composed of heads each, which were transported at 80 km distance during two hours. The birds were clinically healthy, free of parasites and free of Salmonella spp. infection at the beginning of the experiment. They were housed in separate cages during the transportation. The blood smears and samples from the wing vein had been taken before the transportation, directly after and two days later. In order to specify the stress intensity the proportion of heterophils to lymphocytes (H/L) was counted according to Collette at al. [000] method, which is the basic indicator of bird stress. In the serum samples the total protein level was noted with the use of biuret reaction with the wavelength of 6 nm. Additionally, in the examined samples the cortisol levels (ELISA) were estimated. The analysis of the t-student results showed a statistically significant increase at both: birds aged as well as 0 days old (p<0.0) in proportion of heterophils to lymphocytes immediately after transport and decreased days after transport. What is more, the increase of total protein level in both broiler groups was revealed. It was particularly observed days after the transport. In both examined groups of birds the transport stress significantly influenced the cortisol level, which increased directly immediately after transport and decreased days after transport. Key words: transport stress, chicken, H/L ratio, cortisol concentration, total protein level