dr hab. Małgorzata Duda tel

Transkrypt

1 dr hab. Małgorzata Duda tel OCENA ROZPRAWY DOKTORSKIEJ mgr Justyny Ewy Kołakowskiej wykonanej w Katedrze Fizjologii Zwierząt, Wydziału Biologii i Biotechnologii Uniwersytetu Warmińsko-Mazurskiego w Olsztynie pod opieką naukową Prof. dr hab. Anity Franczak zatytułowanej Analiza proteomu endometrium świni domowej (Sus scrofa domestica) z okresu wczesnej ciąży OGÓLNA CHARAKTERYSTYKA ROZPRAWY DOKTORSKIEJ Przedłożona do oceny rozprawa doktorska Pani mgr Justyny Ewy Kołakowskiej pod tytułem Analiza proteomu endometrium świni domowej (Sus scrofa domestica) z okresu wczesnej ciąży, to manuskrypt obejmujący na 136 stronach: streszczenie w języku polskim i angielskim, wykaz stosowanych skrótów, wstęp zawierający hipotezy badawcze oraz cele pracy, materiały i metody, wyniki, dyskusję, wnioski i bibliografię, na którą składa się 320 pozycji, z czego 104 to prace, które ukazały się w ostatnich 10 latach. Warto nadmienić, że część doświadczalną pracy doktorskiej zrealizowano w oparciu o środki finansowe pochodzące z projektu badawczego PRELUDIUM Narodowego Centrum Nauki: DEC-2012/05/N/NZ4/ MERYTORYCZNA ANALIZA ROZPRAWY DOKTORSKIEJ Wybrany przez Doktorantkę do kompleksowej analizy proteomu endometrium, okres wczesnej ciąży tj. matczynego rozpoznania ciąży oraz okres okołoimplantacyjny, jest kluczowy dla prawidłowego, zakończonego sukcesem przebiegu ciąży. Właściwa aktywność sekrecyjna tkanek macicy i towarzysząca jej gruntowna przebudowa warunkują późniejsze zagnieżdżenie zarodków i dalszy ich rozwój. Najwyższa śmiertelność zarodków świń, stanowiąca nawet do 30% puli całkowitej, występuje w okresie od 10 do 30 dnia ciąży, zatem poznanie proteomu błony śluzowej macicy może przyczynić się do poprawy skuteczności implantacyjnej i sukcesu rozrodczego świń. Dotychczasowe badania przeprowadzone na modelu świni domowej skupiały się raczej na analizie ekspresji lub/i analizie aktywności pojedynczych białek kluczowych dla zapewnienia funkcji rozrodczych, produkowanych w macicy i przez rozwijające się zarodki. Oceniana rozprawa doktorska jest poświęcona próbie kompleksowej analizy profilu proteomicznego macicy świni domowej z okresu wczesnej ciąży tj dzień (matczyne 1

2 rozpoznanie ciąży) i dzień (okres okołoimplantacyjny) oraz porównanie go z profilem proteomicznym tej tkanki w wybranych okresach cyklu rujowego tj dzień (faza lutealna) i dzień (luteoliza). Ponadto, w oparciu o porównanie otrzymanych profili proteomicznych, wskazano po raz pierwszy unikalne białka występujące w badanych okresach ciąży i cyklu rujowego, a także określono sieci zależności występujące pomiędzy nimi. Badania podjęte w celu całościowej analizy proteomicznej endometrium świni domowej podczas przebiegu naturalnego cyklu rujowego oraz wczesnej ciąży są uzasadnione potrzebą poznania podłoża potencjalnych zaburzeń fizjologicznych funkcji tego kluczowego gruczołu endokrynnego, manifestujących się m.in. zakłóceniami aktywności sekrecyjnej, co w konsekwencji może przyczyniać się do obniżonej płodności. Na 22 stronach WSTĘPU, poprzedzonego wykazem stosowanych w rozprawie skrótów, Doktorantka w sposób niezwykle syntetyczny przedstawiła aktualny stan wiedzy na temat budowy i właściwości wydzielniczych endometrium świni domowej, w tym procesów reorganizacji tej tkanki, zmian w jej aktywności, a także zmian w tzw. profilu molekularnym w okresie wczesnej ciąży. Uzasadniła konieczność zastosowania dwóch modeli badawczych (cykl rujowy, wczesna ciąża) celem wskazania białek specyficznych dla wybranych dni wczesnej ciąży. Rzeczowo wyjaśniła dlaczego eksperymenty prowadzone na zwierzętach, szczególnie zaś na świni, stanowią doskonały model wdrożeniowy do medycyny weterynaryjnej i ludzkiej. Na pochwałę zasługuje część poświęcona proteomice, w tym: strategiom stosowanym w kompleksowych badaniach proteomu, bazom danych i co interesujące w kontekście prezentowanej pracy, poznanym do tej pory profilom proteomicznym tkanek układu rozrodczego świni. Poszczególne zagadnienia poruszane w tej części manuskryptu zostały opisane wyczerpująco, co wskazuje na dobrą znajomość przez Doktorantkę literatury dotyczącej tematyki pracy oraz umiejętność doboru i korzystania z właściwego piśmiennictwa. Moje uwagi do tej części jak i kolejnych rozprawy mają charakter edytorski i dotyczą jedynie pewnych nieścisłości, które przedstawię na zakończenie oceny. Zarówno HIPOTEZY BADAWCZE jak i CEL PRACY zostały jasno sformułowane i przedstawione w postaci kilku punktów. Po pierwsze: określenie profili proteomicznych endometrium macicy w wybranych dniach wczesnej ciąży i cyklu rujowego. Po drugie: w oparciu o porównanie uzyskanych profili proteomicznych wskazanie unikalnych białek występujących w endometrium w badanych dniach wczesnej ciąży i cyklu rujowego. Doktorantka postawiła sobie także za cel określenie sieci zależności pomiędzy zidentyfikowanymi, unikalnymi dla endometrium białkami w badanych dniach wczesnej ciąży i cyklu rujowego. Na podkreślenie zasługuje fakt, że są to pierwsze tego typu badania wykonane równolegle na tkance pochodzącej z różnych faz cyklu rujowego i wczesnej ciąży, co ma istotne znaczenie nie tylko poznawcze ale także praktyczne. 2

3 19 stron rozdziału MATERIAŁ I METODY zawiera oprócz charakterystyki poszczególnych grup zwierząt doświadczalnych wykorzystanych do izolacji tkanek celem przeprowadzenia analiz, także szczegółowy opis zastosowanych metod badawczych. Z przedstawionego materiału wynika, że Doktorantka opanowała konieczne techniki i metody badawcze, w tym analizę bioinformatyczną, które umożliwiły jej przeprowadzenie kompleksowych badań proteomu endometrium świni domowej. W tej części manuskryptu zamieszczony został także spis stosowanych podczas badań odczynników oraz spis stosowanych roztworów i buforów. WYNIKI zamieszczone zostały na 40 stronach manuskryptu. Doktorantka wnikliwie przedstawiła wyniki elektroforezy dwukierunkowej wykonanej dla każdego z badanych dni ciąży i cyklu rujowego, opatrując je dodatkowo zdjęciami przykładowych żeli obrazujących dwuwymiarowy układ spotów białkowych rozdzielonych względem pi oraz masy molekularnej. Na tej podstawie, wyróżniła cztery grupy porównawcze, które poddała ewaluacji w programie Image Master Platinum 5.0 otrzymując łączną liczbę spotów 109 przeznaczonych do dalszej analizy MS. Doktorantka zidentyfikowała 21 unikalnych białek endometrium pochodzących z badanych dni wczesnej ciąży i cyklu rujowego. Zbiorcze zestawienie otrzymanych wyników w postaci Tabeli 3. zdecydowanie ułatwiło podążanie za tokiem rozumowania Doktorantki. W wyniku analizy systemów z użyciem programu Cytoscape zostały określone relacje pomiędzy wskazanymi białkami, przedstawione w postaci sieci. Graficzne zilustrowanie otrzymanych wyników zasługuje na pochwałę, gdyż w sposób niezwykle przejrzysty pozwoliło pokazać interakcje zachodzące pomiędzy poszczególnymi białkami w sieci. Zastosowanie kolejnego programu, GoMiner, dało podstawę do klasyfikacji zidentyfikowanych białek ze względu na uczestnictwo w konkretnym procesie biologicznym lub pełnioną funkcję. Całość została przedstawiona w postaci dwóch tabel zbiorczych (Tabela 8 i 9) oraz na rycinach 26 i 27. Na zakończenie, celem walidacji uzyskanych wyników, Doktorantka przedstawiła wyniki uzyskane metodą Western-blot z analizy dwóch wybranych, jak sądzę losowo, unikalnych białek endometrium macicy okresu okołoimplantacyjnego. DYSKUSJA została przeprowadzona na 17 stronach manuskryptu niezwykle skrupulatnie i dociekliwie. Zarówno interpretacja jak dyskusja wyników jest wszechstronna i prawidłowa. Konkluzje są logicznie powiązane z cytowanym piśmiennictwem dotyczącym tematyki rozprawy doktorskiej. Szkoda, że Doktorantka nie ustrzegła się powtórzeń niektórych fragmentów WSTĘPU, co uczyniło tę część manuskryptu nieco przydługą. Rozprawę kończy PODSUMOWANIE i 4 WNIOSKI, które syntetycznie reasumują uzyskane przez Doktorantkę wyniki. Wnioski te znajdują potwierdzenie w prezentowanych efektach badań. PYTANIA I UWAGI 1. Do doświadczeń użyto po 4 loszki na każdy z badanych dni wczesnej ciąży i cyklu rujowego. 3

4 Czy, biorąc pod uwagę fakt, że zwierzęta pochodziły z fermy hodowlanej nie należałoby zwiększyć ich liczby aby mieć pewność, że uzyskane wyniki są statystycznie istotne. 2. Zdecydowanie brakuje mi rozbudowanej analizy statystycznej. Zdanie: Uzyskane wyniki poddawano analizie statystycznej wykorzystując narzędzia statystyczne dostępne w programie ImageMaster (strona 36 WYNIKÓW, 16 wers od góry) jest w mojej ocenie niewystarczające. Na jakiej podstawie do analizy statystycznej wybrano test t-studenta? 3. Analiza Western-blot wybranych białek wykonana celem potwierdzenia ich obecności, zamieszczona na końcu WYNIKÓW, została potraktowana z niedostateczną pieczołowitością. Przykładowe bloty są nieczytelne, niewielkich rozmiarów, co utrudnia ich interpretację. 4. Na stronie 106 w DYSKUSJI (5 wers od góry) Doktorantka stwierdza: Podobnie jak inne populacje makrofagów, makrofagi obecne w macicy uczestniczą m.in. w procesie apoptozy, fagocytozy i wzroście trofoblastu. Inne makrofagi raczej nie angażują się we wzrost trofoblastu. Myślę, że sensowniej byłoby oddzielić funkcje ściśle immunologiczne makrofagów macicy. Moja propozycja dla tego zdania brzmi: "Makrofagi obecne w macicy, podobnie jak makrofagi zlokalizowane w innych tkankach/narządach, uczestniczą m.in. w fagocytozie i prezentacji antygenu. Spełniają również ważną rolę w regulacji procesu apoptozy. Makrofagi maciczne ponadto wpływają na wzrost trofoblastu i tolerancję względem antygenów płodowych. 5. Drobne błędy językowe czy redakcyjne m.in. na stronach: 33 (2 wers od góry: powinno być Institute ), 41 (5 wers od góry: zwrot przeźroczysty proponowałabym zastąpić sformułowaniem przezroczysty, jednak częstszym w stosowaniu), 41 (19 wers od góry: powinno być nitrocelulozową ) nie mają wpływu na wartość merytoryczną pracy doktorskiej. PODSUMOWANIE W podsumowaniu Oceny rozprawy należy stwierdzić, że uzyskane przez Doktorantkę wyniki wzbogacają naszą dotychczasową wiedzę w całkiem nowe informacje na temat proteomu endometrium pełniącego kluczową rolę w rozrodzie ssaków. Duża wartość rozprawy wynika z kompleksowego podejścia do rozpatrywanego problemu oraz zastosowania odpowiednio dobranych, nowoczesnych metod. Oceniana rozprawa nie tylko dostarcza danych, które wzbogacają już istniejącą wiedzę w nowe, kluczowe informacje, ale również, prezentowane tu wyniki stanowią podstawę do dalszych badań, zmierzających do pełniejszego poznania niezwykle złożonego okresu wczesnej ciąży. Na podkreślenie zasługuje aplikacyjne wykorzystanie wyników uzyskanych podczas realizacji pracy doktorskiej w hodowli zwierząt gospodarskich. Jestem pewna, że planowana publikacja, wejdzie niebawem do obiegu naukowego nie tylko z uwagi na doniosłość problemów, które stara się wyjaśnić czy też wyjaśnia, ale także dlatego że stawia kilka nowych inspirujących hipotez na temat istnienia wewnątrzkomórkowych szlaków sygnalnych odnoszących się do prawidłowej funkcji endometrium świni domowej podczas wczesnej ciąży. Moją opinię 4

5 5