ANNA BIELAK- MIJEWSKA Instytut Biologii Doœwiadczalnej im. M. Nenckiego Pasteura 3, Warszawa

Transkrypt

1 Tom 52, 2003 Numer 2-3 ( ) Strony ANNA BIELAK- MIJEWSKA Instytut Biologii Doœwiadczalnej im. M. Nenckiego Pasteura 3, Warszawa MECHANIZMY OPORNOŒCI KOMÓREK NOWOTWOROWYCH NA APOPTOZÊ ZNACZENIE APOPTOZY KOMÓREK NOWOTWOROWYCH Znanych jest ponad 100 typów i podtypów nowotworów umiejscowionych w ró nych narz¹dach organizmu cz³owieka. Mimo tej heterogennoœci spowodowanej ró nym genotypem oraz specyficznoœci¹ tkanki, z której pochodzi nowotwór, fenotyp prawie ka dej komórki nowotworowej charakteryzuj¹: uniezale nienie siê od czynników wzrostu (stymulacja autokrynna), niewra liwoœæ na inhibitory wzrostu, nieograniczony potencja³ replikacyjny (podniesiony poziom telomerazy), inwazyjnoœæ tkankowa, zdolnoœæ do metastazy i do podtrzymywania angiogenezy oraz opornoœæ na apoptozê (HANAHAN iweinberg 2000). W walce z nowotworami szczególnie du e nadzieje budzi poznanie mechanizmów zwi¹zanych ze œmierci¹ komórkow¹. Uwa a siê bowiem, e miar¹ skutecznoœci terapii przeciwnowotworowej, oprócz zahamowania proliferacji, jest zdolnoœæ wyindukowania w komórkach rakowych procesu apoptozy (HICKMAN 1996, REED 1999). Leki przeciwnowotworowe mo na podzieliæ na zwi¹zki uszkadzaj¹ce DNA, antymetabolity (blokuj¹ specyficzne szlaki metaboliczne poprzez konkurowanie o miejsce wi¹zania z enzymami), inhibitory mitozy, analogi nukleotydów oraz inhibitory topoizomeraz. Wiêkszoœæ z nich, jak równie radioterapia, wywo³uj¹ stres komórkowy, który w efekcie powinien doprowadziæ do œmierci komórki (HERR idebatin 2001, IGNEY ikrammer 2002). Jednak e transformacja nowotworowa prowadzi do nadekspresji czynników hamuj¹cych apoptozê lub/i zmniejszonej lub wrêcz braku ekspresji czynników aktywuj¹cych apoptozê. SZLAKI PROWADZ CE DO APOPTOZY Apoptoza jest procesem uporz¹dkowanym, zachodz¹cym wed³ug okreœlonego programu prowadz¹cego do obkurczenia komórki, kondensacji chromatyny i fragmentacji DNA na odcinki bêd¹ce wielokrotnoœci¹ nukleosomów. Ostatnim etapem œmierci apoptotycznej jest rozpad komórki na otoczone b³on¹ komórkow¹ tzw. cia³ka apoptotyczne, zawieraj¹ce organelle komórkowe. Cia³ka takie w organizmie s¹ usuwane przez makrofagi lub s¹siaduj¹ce komórki (WYLLIE i wspó³aut. 1980) i dziêki temu nie dochodzi do stanu zapalnego. Wyró - nia siê dwa podstawowe szlaki wiod¹ce do apoptozy. Pierwszy, indukowany sygna³em z zewn¹trz, tzw. extrinsic, zwi¹zany jest z b³onowymi receptorami œmierci. Drugi, przebiega z udzia³em mitochondriów i zwany jest wewnêtrznym, intrinsic. W pewnych przypadkach drogi te mog¹ na siebie zachodziæ i wtedy dochodzi do amplifikacji sygna³u proapoptotycznego (Ryc. 1). Szlak zewnêtrzny extrinsic Aktywacja tego szlaku rozpoczyna siê od pobudzenia receptorów œmierci, nale ¹cych do nadrodziny receptorów TNF (ang. tumour-necrosis factor), np. CD95, TRAIL-R1 i R-2

2 158 ANNA BIELAK- MIJEWSKA nej domen¹ œmierci (ang. death domain, DD) (KRAMMER 1999, SCHMITZ i wspó³aut. 2000). Na skutek zwi¹zania liganda dochodzi do oligomeryzacji receptora, a nastêpnie do tworzenia kompleksu DISC (ang. death-inducing signaling complex). Kompleks ten powstaje poprzez po³¹czenie domen œmierci z bia³kami adaptorowymi FADD (ang. Fas associated death domain protein) oraz z prokaspaz¹ 8 lub 10 (MEDEMA i wspó³aut. 1997, KISCHKEL i wspó³aut. 2001). Konsekwencj¹ tego jest aktywacja przez autoproteolizê prokaspazy 8, która jest bezpoœrednim aktywatorem kaspazy 3 (ENARI i wspó³aut. 1996, SCAFFIDI i wspó³aut. 1998, STENNICKE i wspó³aut. 1998). Rola kaspazy 10 nie do koñca jest jasna i postuluje siê, e mo e byæ istotna w komórkach, w których nie wystêpuje kaspaza 8 (KISCHKEL i wspó³aut. 2001). W niektórych komórkach, tzw. typ I, apoptoza przebiega tylko tym szlakiem, ale w innych, tzw. typ II, dochodzi do wzmocnienia sygna³u za poœrednictwem mitochondriów (SCAFFIDI i wspó³aut. 1998, FULDA i wspó³aut. 2001). Wzmocnienie to jest zwi¹zane ze zdolnoœci¹ kaspazy 8 do proteolizy proapoptotycznego bia³ka z rodziny Bcl-2, a mianowicie bia³ka Bid, które w postaci aktywnej, tzw. tbid (ang. truncated Bid), przemieszcza siê do mitochondriów i tam umo liwia innym bia³kom z tej samej rodziny wbudowanie siê w zewnêtrzn¹ b³onê mitochondrialn¹. To z kolei prowadzi do uwolnienia cytochromu c z przestrzeni miêdzyb³onowej (DESAGHER i wspó³aut. Ryc. 1. Zewnêtrzny i wewnêtrzny szlak prowadz¹cy do apoptozy, z uwzglêdnieniem inhibitorów apoptozy (wyjaœnienie skrótów w tekœcie). (ang. TNF-related apoptosis-inducing ligand-r1, R2). Cech¹ receptorów œmierci jest obecnoœæ wewn¹trzkomórkowej domeny zwa- 1999, KUWANA i wspó³aut. 1998, LUO i wspó³aut. 1998). Szlak wewnêtrzny intrinsic Drugim szlakiem prowadz¹cym do apoptozy jest droga bezpoœrednio zwi¹zana z udzia³em mitichondriów. Sygna³em do apoptozy jest w tym przypadku oddzia³ywanie z b³on¹ mitochondrialn¹ np. reaktywnych form tlenu, aczkolwiek proces ten nie do koñca jest poznany. Do indukcji tego szlaku dochodzi przede wszystkim za poœrednictwem onkogenów, w czasie niedotlenienia oraz na skutek uszkodzenia DNA lub pozbawienia komórek czynników wzrostu (JOHNSTONE i wspó³aut. 2002). Istotnym etapem jest uwolnienie cytochromu c z przestrzeni miêdzyb³onowej poprzez specjalne kana³y. Kana³y te tworzone s¹ przez proapoptotyczne bia³ka z rodziny Bcl-2 samodzielnie lub w po³¹czeniu z bia³kami megakana³u (ang. permability transition pore complex, PTPC). Bia³ka z rodziny Bcl-2 uwa ane s¹ za regulatory apoptozy zwi¹zanej z wyp³ywem cytochromu c (cyt c) (KLUCK i wspó³aut. 1997). Wyp³yw cytochromu c jest sygna³em do tworzenia kompleksu nazywanego apoptosomem, w sk³ad którego wchodzi, oprócz cytochromu c, prokaspaza 9, ATP oraz cytozolowe bia³ko Apaf 1 (ang. apoptotic protease activating factor-1).

3 Mechanizmy opornoœci komórek nowotworowych na apoptozê 159 Utworzenie tego kompleksu jest niezbêdne do oligomeryzacji, a nastêpnie autoproteolizy prokaspazy 9, która jest bezpoœrednim, aktywatorem kaspazy 3 (GREEN ireed 1998). Aktywacja drogi wewnêtrznej uwra liwia komórki na pobudzenie ligandami œmierci, czyli uruchomienie drogi zewnêtrznej (JOHNSTONE i wspó³aut. 2002). Podczas apoptozy z mitochondriów uwalniane s¹ równie bia³ka Smac/Diablo i Omi, które s¹ antagonistami inhibitorów apoptozy, tzn. IAP (WANG 2001) oraz inne bia³ka œciœle zwi¹zane z procesem apoptozy, a mianowicie AIF i endonukleaza G. ROLA BIA EK Z RODZINY Bcl-2 W PROCESIE APOPTOZY Bia³ka z rodziny Bcl-2 odgrywaj¹ wa n¹ rolê regulacyjn¹ w procesie apoptozy (ADAMS i CORY 2001). Wykazuj¹ one du ¹ homologiê w tzw. regionach BH1 (ang. Bcl-2 homology), BH2, BH3 i BH4, ale niektórym z nich brak jest domeny BH4. Podzielono je na dwie podrodziny: bia³ka antyapoptotyczne (Bcl-2, Bcl-XL, Bcl-w i Mcl-1) oraz proapoptotycznym (Bax i Bak, wykazuj¹ce homologiê domen BH1, BH2 i BH3 oraz Bik, Bad, Bid, Bim, NOXA i PUMA, posiadaj¹ce homologiê tylko domeny BH3, tzw. BH3 only ). Domena BH3 wydaje siê byæ niezbêdna do indukcji apoptozy. Poprzez ni¹ wi¹ ¹ siê ze sob¹ bia³ka pro- i antyapoptotyczne, tworz¹c nieaktywne w indukcji apoptozy dimery (HUANG istrasser 2000). Bia³ka proapoptotyczne dzia³aj¹ poprzez tworzenie kana³ów w b³onie mitochondrialnej, przez które uwalniane s¹ z mitochondriów inne czynniki apoptotyczne. Pokazano to przy u yciu syntetycznych b³on lipidowych, w których bia³ka te tworzy³y kana³y jonowe (MINN i wspó³aut. 1997, SCHENDEL i wspó³aut. 1997). Kana³y te mog¹ tworzyæ siê przy udziale bia³ek Bax i Bak (DEGENHARDT i wspó³aut. 2002). Niezbêdnym warunkiem do tworzenia kana³ów jest oligomeryzacja tych bia³ek oraz translokacja z cytoplazmy do b³ony mitochondrialnej, za co w pewnej czêœci odpowiedzialne jest bia³ko Bid (ANTONSSON i wspó³aut. 2000, DESAGHER i wspó³aut. 1999). Bia³ko Bid powoduje zmiany konformacyjne bia³ka Bax (i Bak), czego wynikiem jest wbudowanie siê tych bia³ek do zewnêtrznej b³ony mitochondrialnej. Wykazano, e bia³ko Bax mo e wbudowywaæ siê w zewnêtrzn¹ b³onê mitochondrialn¹ niezale nie od bia³ka Bid (RUFFOLO i wspó³aut. 2000). Uwa a siê, e Bax i Bak mog¹ albo tworzyæ kana³y z³o one z homomultimerów albo wspó³dzia³aæ z megakana³em prawdopodobnie poprzez oddzia³ywanie z jednym z jego elementów, a mianowicie z kana³em anionowym zale nym od napiêcia (ang. voltage-dependent anion channel, VDAC) znajduj¹cym siê w zewnêtrznej b³onie mitochondrialnej (SHIMIZU i wspó³aut. 1999, WEI i wspó³aut. 2001) lub ANT (ang. adenine nucleotide translocator) mieszcz¹cym siê w wewnêtrznej b³onie mitochondrialnej (MARZO i wspó³aut. 1998). Postuluje siê, i megakana³ pe³ni istotn¹ funkcjê w uwalnianiu cytochromu c podczas apoptozy, a bia³ka z rodziny Bcl-2 pe³ni¹ w tym przypadku funkcjê regulacyjn¹ (TSUJIMOTO ishimizu 2000). Proapoptotyczne bia³ko Bid prawdopodobnie nie jest w stanie samodzielnie uwolniæ cytochromu c, poniewa nie tworzy kana³ów w zewnêtrznej b³onie mitochondrialnej, i dzia³a poœrednio poprzez bia³ko Bax lub jego homolog Bad. Aczkolwiek wykazano, e w mitochondriach komórek w¹troby myszy pozbawionych genu bax (bax-/-), bia³ko Bid jest w stanie doprowadziæ do uwolnienia cytochromu c niezale nie od bia³ka Bax (KIM i wspó³aut. 2000). Nie ³¹czy siê ono jednak z VDAC i nie moduluje jego aktywnoœci (SHIMIZU i TSUJIMOTO 2000). Z kolei, bia³ka Bcl-2 i Bcl-XL s¹ inhibitorami uwalniania cytochromu c indukowanego przez bia³ka proapoptotyczne (ADAMS icory 1998, REED 1998, ROSSE i wspó³aut. 1998) (Ryc. 2). Na przyk³ad w komórkach nab³onkowych nowotworu piersi bia³ko Bcl-2 (MURPHY i wspó³aut. 1999) ³¹czy siê poprzez domenê BH3 z VDAC i przez to hamuje apoptozê z udzia³em mitochondriów (SHIMIZU i wspó³aut. 2000). ROLA KASPAZY 3WAPOPTOZIE Obydwa szlaki apoptozy, zarówno wewnêtrzny, jak i zewnêtrzny, prowadz¹ do aktywacji proteaz cysteinowych zwanych kaspazami, których znanych jest dzisiaj 14 (PATEL i wspó³aut. 1996, COHEN 1997, NICHOLSON i THORNBERRY 1997, GRZELAKOWSKA-SZTABERT 1998). Wœród nich wyró niamy kaspazy inicjatorowe i egzekutorowe. Wszystkie kaspazy syntetyzowane s¹ w formie nieaktywnego zymogenu, który ulegaj¹c proteolizie oraz oligomeryzacji tworzy aktywn¹ postaæ kaspazy. Kaspazy aktywowane s¹ hierarchicznie (SLEE i wspó³aut. 1999). Aktywacja kaspaz inicjatorowych ma miejsce w pocz¹tkowej fazie apoptozy. Dochodzi do niej czêsto przez autoproteoli-

4 160 ANNA BIELAK- MIJEWSKA czasami nie obserwuje siê w umieraj¹cych komórkach (SCHULZE-OSTHOFF i wspó³aut. 1994, SAKAHIRA i wspó³aut. 1999). Poniewa poœrednio za fragmentacjê DNA odpowiedzialna jest kaspaza 3, która doprowadza do aktywacji endonukleazy DFF40/CAD, zaanga owanej w hydrolizê DNA, to w przypadku braku fragmentacji DNA jedn¹ z przyczyn mo e byæ brak aktywnej kaspazy 3. Obecnie wyró nia siê apoptozê zale n¹ i niezale n¹ od kaspaz. Jest wiele przyk³adów apoptozy niezale nej od kaspaz. Obserwowano j¹ np. w limfocytach T przy u yciu inhibitorów kaspaz (BIDERE isenik 2001) lub indukto- Ryc. 2. Rola antyapoptotycznych i proapoptotycznych bia³ek z rodziny Bcl-2 w apoptozie (wyjaœnienie skrótów w tekœcie). zê. Nastêpnie aktywowane s¹ kolejne kaspazy a do kaspaz efektorowych, których substratami s¹ ró ne bia³ka komórkowe (SUN i wspó³aut. 1999). Skutkiem tego s¹ charakterystyczne morfologiczne i biochemiczne zmiany w komórkach ulegaj¹cych apoptozie. Centraln¹ rolê w apoptozie odgrywa kaspaza 3 bêd¹ca kaspaz¹ egzekutorow¹. Jej aktywacjê obserwuje siê w przypadku apoptozy wywo³anej brakiem surowicy, aktywacj¹ receptora Fas, promieniowaniem gamma i UV oraz pod wp³ywem ró nych substancji chemicznych (NICHOLSON i wspó³aut. 1995, COHEN 1997). Efektem aktywacji kaspaz efektorowych jest proteoliza lamin j¹drowych, co prowadzi do kondensacji chromatyny i obkurczania j¹dra, proteoliza inhibitora DNA-zy DFF40/CAD (ang. DNA fragmentation factor 40kDa/caspase-activated deoxyribonuclease), mianowicie DFF45/ICAD, czego wynikiem jest aktywacja endonukleazy, przemieszczenie jej do j¹dra i fragmentacja DNA na odcinki bêd¹ce wielokrotnoœci¹ nukleosomów (SAKAHIRA i wspó³aut. 1998, WID AK 2000, NAGATA 2000). Równie fragmentacja komórki i powstawanie cia³ek apoptotycznych jest zale ne od dzia³ania kaspaz i jest skutkiem proteolizy bia³ek cytoszkieletu, takich jak aktyna, plektyna, gelsolina oraz ROCK1 (IGNEY ikrammer 2002). Œmieræ komórek nie zawsze przebiega z ujawnieniem wszystkich typowych cech procesu apoptozy. Do niedawna za jeden z typowych symptomów apoptozy uwa ano fragmentacjê DNA na odcinki oligonukleosomalne i ich wielokrotnoœæ, a w³aœnie tego zjawiska rów omijaj¹cych indukcjê kaspaz (staurosporyna i przeciwcia³a monoklonalne anty-cd2) (DUMONT i wspó³aut. 2000), w spontanicznej regresji komórek nerwiaka z nadekspresj¹ H-Ras (KITANAKA i wspó³aut. 2002) oraz w komórkach prawid³owych (proliferuj¹cych i spoczynkowych) i nowotworowych traktowanych kurkumin¹ (BIELAK- MIJEWSKA i wspó³aut. 2000). Jednak rodzaj apoptozy nie zale y tylko od induktora apoptozy, ale równie istotn¹ rolê odgrywa rodzaj komórek. Pewne substancje, np. kurkumina lub staurosporyna, w ró nych typach komórek indukuj¹ apoptozê zale n¹ lub niezale n¹ od kaspaz (BIELAK- MIJEWSKA i wspó³aut. 2000, BELMOKHTAR i wspó³aut. 2001). Czynnikiem, który mo e byæ odpowiedzialny za zmiany w j¹drze komórkowym niezale- nie od kaspaz, jest flawoproteina AIF (ang. apoptosis-inducing factor) (CANDE i wspó³aut. 2002, JOZA i wspó³aut. 2001). Bia³ko to znajdu-

5 Mechanizmy opornoœci komórek nowotworowych na apoptozê 161 je siê w przestrzeni miêdzyb³onowej mitochondriów, a po indukcji apoptozy wydostaje siê z mitochondriów i przedostaje do j¹dra i tam mo e wywo³aæ kondensacjê chromatyny i wielkocz¹steczkow¹ ( kbp) fragmentacjê DNA. Wykazano, e inhibitory kaspaz nie by³y w stanie zahamowaæ dzia³ania czynnika AIF, co przemawia za jego niezale n¹ od kaspaz drog¹ dzia³ania. Mo na znaleÿæ te dane na temat innych bia³ek, które mog¹ odgrywaæ istotn¹ rolê w apoptozie niezale nej od kaspaz. S¹ to np. (i) kalpainy, bêd¹ce proteazami cysteinowymi zale nymi od wapnia, których aktywacjê obserwowano np. w komórkach nowotworu piersi, MCF-7, na skutek dzia³ania zwi¹zków podwy szaj¹cych poziom wapnia w komórce (WOLF i wspó³aut. 1999), (ii) katepsyny (DEISS i wspó³aut. 1996) oraz (iii) proteazy serynowe np. Omi. Bia³ko Omi uwalniane jest z mitochondriów podczas apoptozy, której towarzyszy proteoliza bia³ka Bid. Oddzia³uje ono z inhibitorem kaspaz XIAP, w wyniku czego dochodzi do aktywacji kaspaz (VAN LOO i wspó³aut. 2002). Równie endonukleaza G, bia³ko mitochondrialne uwalniane podczas apoptozy i ulegaj¹ce translokacji do j¹dra, jest zaanga owana w niezale n¹ od kaspaz degradacjê DNA (VAN LOO i wspó³aut. 2001, LI i wspó³aut. 2001). MECHANIZMY OPORNOŒCI KOMÓREK Komórki nowotworowe posiadaj¹ wiele mechanizmów, które zabezpieczaj¹ je przed apoptoz¹, czego skutkiem jest opornoœæ na czynniki indukuj¹ce œmieræ. Ma to prze³o enie na niedostateczn¹ skutecznoœæ terapii przeciwnowotworowej (Tabela 1). NADEKSPRESJA BIA EK ANTYAPOPTOTYCZNYCH I INAKTYWACJA PROAPOPTOTYCZNYCH Czêst¹ przyczyn¹ braku wra liwoœci na chemio- lub radioterapiê jest nadekspresja bia³ek o w³aœciwoœciach antyapoptotycznych, takich jak bia³ka z rodziny Bcl-2, czy te inhibitorów apoptozy lub/i obni enie ekspresji bia³ek proapoptotycznych nale ¹cych do rodziny Bcl-2. Bia³ka z rodziny Bcl-2 W komórkach nowotworowych czêsto dochodzi do zwiêkszenia poziomu antyapoptotycznych bia³ek z rodziny Bcl-2, mianowicie Bcl-2 i Bcl-XL (LIU i wspó³aut. 1999). Nadekspresja Bcl-2 hamuje apoptozê zwi¹zan¹ z pobudzeniem receptora TRAIL w komórkach nerwiaków i glejaków (FULDA i wspó³aut. 2002). W wielu typach nowotworów obserwuje siê równie inaktywacjê bia³ek proapoptotycznych z rodziny Bcl-2. Czêsto jest to zwi¹zane z mutacjami w genie bia³ka BAX (MEIJERINK i wspó³aut. 1998), w szczególnoœci dotyczy to mutacji w obrêbie domeny BH3. Ekspresjê bia³ka BAX reguluje produkt genu p53, którego mutacje wystêpuj¹ w wielu nowotworach. Zaobserwowano równie, e mutacja w genie koduj¹cym bia³ko Bak ma miejsce w nowotworach okrê nicy (KONDO i wspó³aut. 2000), a mysie komórki w¹troby pozbawione ekspresji bia³ka Bid (bid-/-) s¹ oporne na apoptozê indukowan¹ przez receptor Fas (YIN i wspó³aut. 1999). Inhibitory apoptozy Kolejnym wa nym elementem obrony komórki nowotworowej przed œmierci¹ jest wzrost ekspresji inhibitorów apoptozy, tj. IAP (ang. inhibitor of apoptosis protein) i FLIP [ang. FADD-like interleukin-1 -converting enzyme-like protease (FLICE/caspase-8)-inhibitory protein] (patrz Ryc. 1). Bia³ka IAP (znanych jest 8 ludzkich), do których nale ¹ np. NAIP (ang. neuronal apoptosis inhibitory protein), XIAP (ang. X-linked IAP), surwiwina (w komórkach nowotworowych obserwuje siê bardzo wysoki poziom tego bia³ka w porównaniu z komórkami pierwotnymi) oraz c-iap-1 i c-iap-2, pe³ni¹ ró ne funkcje w komórce, zarówno w czasie podzia³u, jak równie w apoptozie indukowanej wieloma zwi¹zkami, równie czynnikami przeciwnowotworowymi (DEVERAUX i REED 1999, DEVERAUX i wspó³aut. 1999, GRZELAKOWSKA-SZTABERT 1999). Wiêkszoœæ z nich posiada zdolnoœæ bezpoœredniego wi¹zania i hamowania aktywacji kaspazy 3 i 7, zapobiegaj¹c ich proteolizie. Zapobiegaj¹ równie aktywacji inicjatorowej kaspazy 9 (ROY i wspó³aut. 1997). Bia³ka IAP mog¹ równie dzia³aæ jako ligazy ubikwitynowe przyczyniaj¹c siê w ten sposób do degradacji kaspaz (SUZUKI i wspó³aut. 2001). Sugerowany jest jeszcze inny mechanizm hamowania apoptozy, niezale ny bezpoœred-

6 162 ANNA BIELAK- MIJEWSKA nio od kaspaz. Wykazano mianowicie, e c-iap-1 i c-iap-2 mog¹ wi¹zaæ siê z TRAF1 i TRAF2 (ang. TNF receptor associated factor 1, 2) i w ten sposób hamowaæ apoptozê na poziomie receptorów b³onowych, czego wynikiem jest brak proteolizy prokaspazy 8 (WANG i wspó³aut. 1998). Najlepiej poznanym bia³kiem inhibitorowym jest XIAP, który posiada zdolnoœæ do bezpoœredniego blokowania kaspaz (DEVERAUX i wspó³aut. 1997). Bardzo czêsto nowotworu (FONG i wspó³aut. 2000). Ekspresjê c-iap2 i XIAP reguluje czynnik transkrypcyjny NF B, który w odpowiedzi na stres komórkowy indukuje ekspresjê licznych genów antyapoptotycznych (CHU i wspó³aut. 1997). Poznano równie inhibitory, które podczas apoptozy s¹ uwalniane z mitochondriów i mog¹ bezpoœrednio oddzia³ywaæ z bia³kami IAP. Nale ¹ do nich Smac/Diablo (LIU i wspó³aut. 2000, WU i wspó³aut. 2000), zapobiegaj¹cy hamowaniu Tabela 1. Rola inicjatorów, regulatorów i egzekutorów apoptozy w opornoœci komórek na apoptozê (IGNEY ikrammer 2002, JOHNSTONE i wspó³aut. 2002) obserwuje siê jego wysok¹ ekspresjê w ostrych bia³aczkach szpiczakowych (TAMM i wspó³aut. 2000). W komórkach wielu typów ludzkich nowotworów obserwuje siê obni enie poziomu negatywnego regulatora XIAP, a mianowicie XAF1, uwa nego za produkt genu supresora aktywacji kaspazy 3 i 9, oraz Omi, proteaza odzia³ywuj¹ca z XIAP, zwi¹zana z indukcj¹ apoptozy (VAN LOO i wspó³aut. 2002, VERHAGEN i wspó³aut. 2002). Bia³ka IAP, a w szczególnoœci XIAP, mog¹ hamowaæ wzrost nowotworu na drodze innej ni inaktywacja kaspaz, np. po-

7 Mechanizmy opornoœci komórek nowotworowych na apoptozê 163 przez zahamowanie cyklu komórkowego (SILKE i wspó³aut. 2002). Bia³ka FLIP bior¹ udzia³ w hamowaniu inicjacji apoptozy na poziomie receptorów œmierci (KRUEGER i wspó³aut. 2001). Wykazuj¹ one du ¹ homologiê do prokaspazy 8 i posiadaj¹ zdolnoœæ ³¹czenia siê z kompleksem DISC, a konkretnie z bia³kiem adaptorowym FADD, nie dopuszczaj¹c tym samym do proteolizy prokaspazy 8. Zwiêkszona iloœæ bia³ek inhibitorowych powoduje zmniejszon¹ wra liwoœæ komórek na apoptozê (IRMLER i wspó³aut. 1997). ROLA BIA KA p53 W APOPTOZIE Wa n¹ rolê w niekontrolowanej proliferacji, jak i opornoœci na apoptozê w komórkach nowotworowych odgrywaj¹ mutacje genu p53, zaliczanego do genów supresorów nowotworu, prowadz¹ce do zmian funkcjonalnych bia³ka (ATTARDI i JACKS 1999). Produkt bia³kowy tego genu uwa any jest za stra nika genomu. Decyduje on o tym, czy komórka zatrzyma podzia³y, aby naprawiæ uszkodzenia, czy te uruchamia program apoptozy. Bia³ko p53 dzia³a jako nadrzêdny regulator programu apoptotycznego i koordynuje ten proces na ró nych poziomach. Podczas apoptozy dochodzi, poprzez oligomeryzacjê i fosforylacjê, do aktywacji p53, który jako czynnik transkrypcyjny jest odpowiedzialny za ekspresjê bia³ek proapoptotycznych (GOTLIEB i OREN 1998, VOUSDEN 2000, MOLL izaika 2001) zwi¹zanych z drog¹ mitochondrialn¹, np. Bax, Bak, NOXA, PUMA (ODA i wspó³aut. 2000, MIYASHITA ireed 1995, NAKANO ivousden 2001), oraz zwi¹zanych z drog¹ od receptorów œmierci, tj. CD95, TRAIL-R1 i TRAIL-R2 (MULLER i wspó³aut. 1998, HERR i DEBATIN 2001, RYAN i wspó³aut. 2001). Skutkiem fosforylacji p53 jest przy³¹czenie izomerazy Pin1, która zmieniaj¹c konformacjê bia³ka odpowiada za od³¹czenie ligazy MDM2 i co za tym idzie brak ubikwitynacji i stabilizacjê p53. Pin1 jest niezbêdny do zatrzymania cyklu komórkowego, czyli do funkcjonowania p53 jako czynnika transkrypcyjnego (ZACCHI i wspó³aut. 2002, ZHENG i wspó³aut. 2002). Aktywacja p53 ma miejsce w odpowiedzi na uszkodzenie DNA, aktywacjê onkogenów, niedotlenienie, skracanie telomerów, brak czynników wzrostu i sygna³ów do prze ycia. Mutacje w tym genie obserwuje siê w 50% ró nych nowotworów, a u osób zdrowych mog¹ one s³u yæ jako marker zwiêkszonego ryzyka wyst¹pienia choroby nowotworowej. Brak funkcjonalnego p53 powoduje utratê zdolnoœci komórki do apoptozy z jego udzia³em oraz rozwój nowotworu, jak to wykazano np. u myszy transgenicznych (ATTARDI ijacks 1999). Bia³ko p53 hamuje ekspresjê Bcl-2, Bcl-XL oraz IAP (surwiwina), cflip (BARTKE i wspó³aut. 2001, RYAN i wspó³aut. 2001, HOFFMAN i wspó³aut. 2002) i aktywuje geny bia³ek PTEN i Apaf 1 (STAMBOLIC i wspó³aut. 2001, MORONI i wspó³aut. 2001). p53 mo e równie dzia³aæ niezale nie od aktywacji transkrypcji (RYAN i wspó³aut. 2001). Bia³ko to bierze udzia³ w przemieszczaniu receptorów œmierci na powierzchniê komórki, bezpoœrednio dzia³a w mitochondriach oraz reguluje translacjê. Nieprawid³owe funkcjonowanie p53 nie musi byæ zawsze zwi¹zane z mutacj¹ w genie. Czêsto wynika z amplifikacji ligazy ubikwitynowej MDM2 odpowiedzialnej za degradacjê p53 w proteasomie. W przypadku braku inhibitora MDM2, jakim jest czynnik ARF, dochodzi do nadmiernej degradacji p53 i w zwi¹zku z tym nie mo e on pe³niæ swojej funkcji regulatorowej (SHERR i WEBER 2000, LOWE i LIN 2000). Zaobserwowano równie, e w przypadku nadekspresji inhibitorów bia³ka ARF, jakimi s¹ Twist i Dermo1 (MAESTRO i wspó³aut. 1999) lub TBX2 (JACOBS i wspó³aut. 2000), dochodzi³o do transformacji nowotworowej i rozwoju nowotworu. Amplifikacjê inhibitora ARF obserwowano np. w ludzkich komórkach nowotworowych piersi (JACOBS i wspó³aut. 2000). p53 wp³ywa na wzrost ekspresji MDM2. Gdy wzrasta poziom p53, wzrasta MDM2, co przyczynia siê do zwiêkszonej degradacji p53 (sprzê enie zwrotne ujemne) (Ryc. 3). Istotn¹ rolê w funkcji transaktywacyjnej p53 odgrywa transport do i z j¹dra (VOUSDEN i WOUDE 2000), zale ny od oddzia³ywañ sieci mikrotubul i dyneiny (do j¹dra) oraz MDM2 (z j¹dra) (GEYER i wspó³aut. 2000). SZLAKI PRO YCIOWE W wielu komórkach nowotworowych dochodzi do nadekspresji bia³ek zwi¹zanych z tzw. szlakami pro yciowymi. W zwi¹zku z tym, pod wp³ywem czynników apoptogennych, sygna³ odpowiedzialny za prze ycie komórki jest silniejszy od sygna³u do œmierci. Kaskada sygna³owa zdolna wzmocniæ prze ycie komórek (wspieraj¹ca drogê przy yciow¹) mo e potencjalnie podnosiæ opornoœæ na apoptozê indukowan¹ lekami.

8 164 ANNA BIELAK- MIJEWSKA aktywacja mo e decydowaæ o prze yciu lub apoptozie. Mutacje w genie bia³ka Ras s¹ najczêstszymi zmianami w przypadku bia³aczek. W oko³o 30% przypadków wystêpuje zmutowana postaæ bia³ka Ras. Ale nie tylko bezpoœrednia mutacja genu ras prowadzi do zaburzenia przekazywania sygna³u na tej drodze. Równie elementy regulatorowe podlegaj¹ zmianom, w wyniku czego mo e dojœæ do nadekspresji receptorów czynników wzrostu, czy nadmiernej produkcji cytokin, np. interleukiny 1. Wszystko to prowadzi do zmian w szlaku zwi¹zanym z Ras. Bia³ko Ras jest równie regulatorem bia³ek: Bcl-2 i Bcl-XL. Zwiêksza ich poziom w komórkach, a nadekspresja Bcl-2 jest prawdopodobnie jednym z g³ównych mechanizmów wynikaj¹cych z dzia³ania bia³ka Ras (O GORMAN icootter 2001). Ryc. 3. Regulacja aktywnoœci transkrypcyjnej bia³ka p53 (wyjaœnienie skrótów w tekœcie). Degradacja p53 odbywa siê w proteasomie 26S, a kluczow¹ role odgrywa ubikwitynacja przez bia³ko MDM2. Czynnik ARF zapobiega wi¹zaniu MDM2 do p53, a tym samym zapobiega jego degradacji. Zwiêkszona ekspresja MDM2 lub brak inhibitora, jakim jest ARF, prowadzi do nadmiernej degradacji p53, co uniemo liwia jego dzia³anie jako czynnika transkrypcyjnego i stra nika genomu. Przyk³adem mo e tu byæ szlak pro yciowy zwi¹zany z kinaz¹ Akt/PKB. Jest to kinaza bia³kowa, której efektem dzia³ania jest zahamowanie apoptozy, zwiêkszenie proliferacji np. poprzez indukcjê czynnika transkrypcyjnego NF B (uznawanego za czynnik zwiêkszaj¹cy prze ycie komórek), co prowadzi do ekspresji genów antyapoptotycznych. Kinaza ta do swojej aktywacji wymaga fosforylacji przez kinazê PI3. W komórkach nowotworowych czêsto obserwuje siê zwiêkszon¹ aktywnoœæ kinazy PI3 lub kinazy Akt (SHAYESTEH i wspó³aut. 1999, ROYMANS islegers 2001). Z kolei dzia³anie kinazy PI3 mo e byæ antagonizowane przez fosfatazê lipidow¹ PTEN (bêd¹c¹ produktem genu supresora nowotworu), która defosforyluje fosfolipidy inozytolu (DI CRISTOFANO i PANDOLFI 2000). Mutacje w genie, którego produktem jest bia³ko PTEN, mog¹ wiêc doprowadziæ do tego, i ten szlak pro yciowy jest ca³y czas aktywny. Wykazano tak e, e kinaza Akt hamuje, na drodze fosforylacji, bia³ko Bad i aktywacjê kaspazy 9 (CARDONE i wspó³aut. 1998) oraz jest negatywnym regulatorem czynników transkrypcyjnych z rodziny Forkhead (AFX i FKHRL1), które mog¹ indukowaæ ekspresjê genów proapoptotycznych bia³ek takich jak CD95L. Kinaza Akt hamuje równie wyp³yw cytochromu c w sposób niezale ny od fosforylacji Bad (KENNEDY i wspó³aut. 1999) (Ryc. 4). Inn¹ drog¹ pro yciow¹ jest szlak z udzia³em bia³ka Ras nale ¹cego do rodziny bia³ek G. Jego Ryc. 4. Szlak pro yciowy z udzia³em kinazy Akt (wyjaœnienie skrótów w tekœcie). Niezbêdnym warunkiem aktywacji kinazy Akt jest fosforylacja przez kinazê PI3 fosfolipidów inozytolu (PIP 3 ). Z kolei kinaza PI3 mo e byæ antagonizowana przez bia³ko PTEN, które defosforyluje fosfolipidy inozytolu. Gdy w komórce dochodzi do nadekspresji kinazy PI3 lub Akt albo ekspresja inhibitora PTEN jest obni ona komórka otrzymuje ci¹g³y sygna³ do prze ycia. Kinaza Akt jest nie tylko induktorem proliferacji, ale jest równie inhibitorem bia³ek o funkcji proapoptotycznej. INNE MECHANIZMY WARUNKUJ CE OPORNOŒÆ KOMÓREK NOWOTWOROWYCH NA APOPTOZÊ Wa n¹ rolê w przeciwdzia³aniu apoptozie przypisuje siê tak e bia³kom szoku cieplnego Hsp (ang. heat shock protein). Ich podwy szony poziom wystêpuje czêsto w komórkach lekoopornych. S¹ to bia³ka wysoce konserwatywne. Najbardziej istotne w procesie hamowania apoptozy wydaj¹ siê byæ Hsp70 i Hsp27. S¹ one uwa ane za negatywne regulatory apoptozy. Wykazano, e komórki poddane stresowi termicznemu, pod wp³ywem którego docho-

9 Mechanizmy opornoœci komórek nowotworowych na apoptozê 165 dzi³o do indukcji bia³ek Hsp27 i Hsp70, lub komórki transfekowane genem Hsp70, by³y oporne na apoptozê indukowan¹ aktynomycyn¹, etopozydem, doksorubicyn¹, cisplatyn¹ czy promieniowaniem UVC (SAMALI i COOTTER 1996, BEERE i GREEN 2001). Wykazano, e bia³ko Hsp 70 w mitochondriach wystêpuje w kompleksie z prokaspaz¹ 3, uniemo liwiaj¹c tym samym jej aktywacjê. Bia³ka te mog¹ dzia³aæ w wielu ró nych miejscach szlaków sygna³owych. Wykazano, e hamuj¹ kinazy JNK, zapobiegaj¹ tworzeniu siê apoptosomu uniemo liwiaj¹c po³¹czenie siê cytochromu czpozosta³ymi sk³adnikami apoptosomu, nie dopuszczaj¹ równie do proteolizy prokaspazy 9. Wykazano równie, e Hsp 70 neutralizuje dzia³anie czynnika AIF, który jest odpowiedzialny za apoptozê niezale n¹ od kaspaz (RAVAGNAN i wspó³aut. 2001). Opornoœæ wielolekowa jest kolejnym mechanizmem odpowiedzialnym za opornoœæ komórek nowotworowych na apoptozê. Jest ona zwi¹zana z obecnoœci¹ transporterów b³onowych nale ¹cych do rodziny bia³ek ABC (ang. ATP-binding cassette), bêd¹cych pompami zale nymi od ATP. Transportery te s¹ odpowiedzialne za usuwanie z komórki ró nego rodzaju toksyn i co za tym idzie, za fenotyp opornoœci wielolekowej. Problem lekoopornoœci pojawia siê podczas radio- i chemioterapii stosowanej w leczeniu nowotworów. Komórki pod wp³ywem naœwietlania lub leków mog¹ nabywaæ fenotyp opornoœci wielolekowej, tzn. mo e w nich dochodziæ do wzrostu ekspresji bia³ek transporterowych lub do selekcji komórek z nadekspresj¹ spontaniczn¹. Komórki takie bardzo trudno jest wyeliminowaæ z organizmu. Pompy zale ne od ATP wystêpuj¹ nie tylko w komórkach nowotworowych. Bardzo czêsto obserwuje siê je w komórkach prawid³owych. Funkcj¹ ich jest obrona przed cytotoksycznym dzia³aniem zwi¹zków oraz dostosowanie komórek do zmian œrodowiska. Wystêpuj¹ licznie w komórkach nerki, w¹troby, nadnercza oraz w komórkach linii hematopoetycznej (JOHNSTONE i wspó³aut. 1999). mrna bia³ek transporterów b³onowych mo na znale- Ÿæ prawie we wszystkich tkankach. Wykazano, e podniesienie poziomu bia³ka P-gp chroni komórki proksymalnych kanalików nerkowych przed apoptoz¹ indukowan¹ przez kadm oraz reaktywne formy tlenu (THEVENOD i wspó³aut. 2000). Funkcje transporterów pe³ni¹ bia³ka: glikoproteina P (P-gp), produkt genu MDR1, oraz MRP, produkt genu MRP. Bia³ka te ró ni¹ siê sposobem usuwania leków z komórki oraz specyficznoœci¹ substratów. Bia³ko P-gp usuwa z komórki cytotoksyny w postaci niezwi¹zanej, natomiast MRP - w postaci koniugatów z glutationem. Wiele danych przemawia za tym, i transportery b³onowe s¹ zaanga owane nie tylko w usuwanie leków z komórki, ale zabezpieczaj¹ j¹ równie przed œmierci¹ z udzia³em kaspazy 3 i 8 pod wp³ywem czynników niebêd¹cych substratami pompy (JOHNSTONE i wspó³aut. 1999, 2000). Wykazano, e promieniowanie UV i gamma, brak w po ywce surowicy, jak równie aktywacja receptora Fas przez FasL nie s¹ w stanie wyindukowaæ apoptozy z udzia³em kaspaz (Ryc. 5). Komórki takie umieraj¹, ale na drodze niezale nej od kaspaz. Wykazano, e obecnoœæ P-gp w b³onie komórkowej zapobiega apoptozie w komórkach HeLa i NIH 3T3, indukowanej promieniowaniem jonizuj¹cym (RUTH ironinson 2000). Postuluje siê jednak, e P-gp nie odgrywa g³ównej roli w ochronie przed apoptoz¹, gdy inhibitor P-gp, jakim jest werapamil, tylko czêœciowo odwraca opornoœæ na doksorubicynê w komórkach HL-60 (NOTARBARTOLO i wspó³aut. 2002). W komórkach HL-60 opornych na doksorubicynê obserwowano wzrost poziomu mrna bia³ek IAP. Mo liwe, e podniesiony poziom bia³ek IAP, bêd¹cych inhibitorami apoptozy, równie wp³ywa na brak aktywnej kaspazy 3. Zaobserwowano, e w komórkach, w których wyindukowano lekoopornoœæ, dochodzi do spadku ekspresji receptora Fas (NOTAR- BARTOLO i wspó³aut. 2002), czego skutkiem mo e byæ brak aktywacji kaspaz (Ryc. 5). Nie wiadomo, jaki jest mechanizm obrony komórek posiadaj¹cych transportery b³onowe przed apoptoz¹ wywo³ywan¹ zwi¹zkami niebêd¹cymi substratami pompy. Sugeruje siê, i mo e to byæ zwi¹zane z wypompowywaniem jakiegoœ wa nego poœrednika apoptozy lub wp³ywu P-gp na wewn¹trzkomórkowe ph (SMYTH i wspó³aut. 1998, JOHNSTONE i wspó³aut. 1999). Poznano równie wiele innych mechanizmów opornoœci komórek na apoptozê, choæ wystêpuj¹cych z mniejsz¹ czêstotliwoœci¹ ni wymienione powy ej, ale o których warto tutaj wspomnieæ. W czerniakach obserwowano np. brak ekspresji sk³adnika apoptosomu, a mianowicie Apaf1 (SOENGAS i wspó³aut. 2001), a w komórkach nerwiaka, w wyniku amplifikacji onkogenu N-Myc, dochodzi³o do inaktywacji kaspazy 8 (TAKITA i wspó³aut. 2000, TEITZ i

10 166 ANNA BIELAK- MIJEWSKA Ryc. 5. Blokada szlaku apoptozy zale nej od kaspaz w komórkach z nadekspresj¹ P-gp (wyjaœnienie skrótów w tekœcie) (wg JOHNSTONE i wspó³aut. 2000, zmodyfikowana). wspó³aut. 2000). Opornoœæ na chemoterapiê zwi¹zana z kaspaz¹ 8 mo e wynikaæ z obni - onej ekspresji samej kaspazy lub podwy szonej ekspresji inhibitora FLIP (KIM i wspó³aut. 2001). Czêst¹ przyczyn¹ opornoœci komórek na apoptozê jest inaktywacja lub spadek ekspresji receptorów œmierci, np. CD95 (STRAND i wspó³aut. 1996) lub TRAIL-R1 i TRAIL-R2 (LEE i wspó³aut. 1999, SHIN i wspó³aut. 2001). Wymienione wy ej mechanizmy obrony komórek nowotworowych przed œmierci¹ mog¹ wspó³wystêpowaæ. Efekt ich mo e siê sumowaæ lub uzupe³niaæ. Wykazano, e w komórkach HL-60, w których wyindukowano lekoopornoœæ, wzrasta równie poziom bia³ek antyapoptotycznych Bcl-2 i Bcl-XL przy niezmienionym poziomie bia³ka BAX (HUANG i wspó³aut. 1997), a w komórkach HL-60 opornych na doksorubicynê dodatkowo obserwuje siê podwy - szony poziom bia³ek z rodziny IAP (NOTAR- BARTOLO i wspó³aut. 2002). Poznanie mechanizmów opornoœci komórek na apoptozê stanowi klucz do doboru odpowiedniej terapii. W celu uzyskania najlepszego efektu nale a³oby dobrze scharakteryzowaæ rodzaj zmian w poszczególnych przypadkach chorób nowotworowych i u yæ zwi¹zków, które uruchamiaj¹ apoptozê omijaj¹c szlaki z uszkodzonymi elementami maszynerii apoptotycznej. Wiedz¹c na przyk³ad, e komórki nowotworowe posiadaj¹ zmutowany gen bia³ka p53, nale a³oby wykluczyæ leki wywo³uj¹ce apoptozê poprzez uszkodzenia DNA. Wiele nadziei pok³ada siê w zwi¹zkach pochodzenia naturalnego. Mog¹ one stanowiæ cenne uzupe³nienie konwencjonalnej terapii lub same w sobie posiadaæ w³aœciwoœci przeciwnowotworowe. Jednym z takich naturalnych zwi¹zków ciesz¹cym siê du ym zainteresowaniem jest kurkumina, barwnik izolowany z k³¹czy ostry u d³ugiego (Curcuma longa), o w³aœciwoœciach przeciwzapalnych, antyoksydacyjnych i przeciwnowotworowych. Wiêcej informacji na temat kurkuminy postaram siê przedstawiæ Pañstwu w jednym z najbli szych numerów KOSMOSU. THE MECHANISM OF RESISTANCE TO APOPTOSIS IN TUMOR CELLS A most normal cell can die by apoptosis but tumor cells very often have some defects in the apoptotic pathway, leading not only to the increase of tumor mass but also to tumor resistance to chemotherapy. Since chemotherapy and irradiation act primarily by inducing apoptosis, defects in the apoptotic pathway make the therapy less efficient. Summary Generally, there are two pathways of apoptosis. One mediated by the cell surface death receptors the extrinsic pathway, the other mediated by the mitochondria intrinsic pathway. The common element in those two ways is activation of caspase 3. However, in some cases we can observe cell death without activation of this enzyme. One of the often occurring

11 Mechanizmy opornoœci komórek nowotworowych na apoptozê 167 mechanism of resistance to apoptosis is overexpression of the Bcl-2 family antyapoptotic proteins like Bcl-2 and Bcl-XL, or lower expression of proapoptotic proteins like Bax, Bid, Bad. Another mechanism observed in tumor cells is overexpression of apoptosis inhibitors namely IAPs and FLIP. They play an important role in degradation or inactivation of executor caspases and protect cells from apoptosis. A key element in stress-induced apoptosis is p53 protein which can induce the expression of proteins involved in the mitochondrial apoptotic pathway. Mutations in p53 are common in many tumors and affect their ability to undergo cell death. In many tumor cells also the survival signal is stronger than usually and induction of apoptosis is more difficult. One of survival pathways is connected with the PI3K/Akt signalling pathway. Also cells with high expression of Hsp70 protein are protected from apoptosis, especially that leading through mitochondria. Cells with MDR (multidrug resistance) phenotype, expressing proteins from the ABC superfamily on cell surface, are able to exclude many of the drugs (including anticancer drugs) from cytoplasm. There are some evidences that cell possessing membrane transporters are resistant to that form of apoptosis connected with activation of caspase 3. The knowledge of the molecular mechanisms of tumor resistance to apoptosis can improve cancer therapy through resensitization of tumor cells. LITERATURA ADAMS J. M., CORY S., The Bcl-2 protein family: arbiters of cell survival. Science 281, ADAMS J. M., CORY S., Life-or-death decisions by the Bcl-2 protein family. Trends Biochem. Sci. 26, ANTONSSON B., MONTESSIUT S., LAUPER S., ESKES R., MATRINOU J. C., Bax oligomerization is required for channel-forming activity in liposomes and to trigger cytochrome c release from mitochondria. Biochem. J. 345, ATTARDI L. D., JACKS T., The role of p53 in tumour suppression: lessons from mouse models. Cell. Mol. Life Sci. 55, BARTKE T., SIEGMUND D., PETERS N., REICHWEIN M., HEINKLER F., SCHEURICH P., WAJANT H., p53 upregulates cflip, inhibits transcription of NF-kappaB-regulated genes and induces caspase-8-independent cell death in DLD-1 cells. Oncogene 20, BEERE H. M., GREEN D.R., Stress management - heat shock protein-70 and the regulation of apoptosis. Trends Cell. Biol. 11, BELMOKHTAR C. A., HILLION J., SEGAL-BENDIRDJIAN E., Staurosporine induces apoptosis through both caspase-dependent and caspase-independent mechanisms. Oncogene 20, BIDERE N., SENIK A., Caspase-independent apoptotic pathways in T lymphocytes: a minireview. Apoptosis 6, BIELAK- MIJEWSKA A., KORONKIEWICZ M., SKIERSKI J., PIWOCKA K., RADZISZEWSKA E., SIKORA E., Effect of curcumin on the apoptosis of rodent and human nonproliferating and proliferating lymphoid cells. Nutr. Cancer 38, CANDE C., COHEN I., DAUGAS E., RAVAGNAN L., LAROCHETTE N., ZAMZAMI N., KROEMER G., Apoptosis-inducing factor (AIF): a novel caspase-independent death effector released from mitochondria. Biochimie 84, CARDONE M. H., ROY N., STENNICKE H. R., SALVESEN G. S., FRANKE T. F., STANBRIDGE E., FRISCH S. i wspó³aut., Regulation of cell death protease caspase-9 by phosphorylation. Science 282, CHU Z. L., MCKINSEY T. A., LIU L., GENTRY J.J., MALIM M. H., BALLARD D. W., Suppression of tumor necrosis factor-induced cell death by inhibitor of apoptosis c-iap2 is under NF-kappaB control. Proc. Natl. Acad. Sci. USA94, COHEN G M., Caspases: the executioners of apoptosis. Biochem. J. 326, DEGENHARDT K., SUNDARARAJAN R., LINDSTEN T., THOMPSON C., WHITE E., Bax and Bak independently promote cytochrome C release from mitochondria. J. Biol. Chem. 277, DEISS L. P., GALINKA H., BERISSI H., COHEN O., KIMCHI A., Cathepsin D protease mediates programmed cell death induced by interferon-gamma, Fas/APO-1 and TNF-alpha. EMBO J. 15, DESAGHER S., OSEN-SAND A., NICHOLS A., ESKES R., MONTESSIUT S., LAUPER S., MAUNDREL K., i wspó³aut., Bid-induced conformational change of Bax is responsible for mitochondrial cytochrome c release during apoptosis. J. Cell. Biol. 144, DEVERAUX Q.L.,REED J. C., IAP family proteins-suppressors of apoptosis. Genes Dev. 13, DEVERAUX Q. L., STENNICKE H. R., SALVESEN G. S., REED J. C., Endogenous inhibitors of caspases. J. Clin. Immunol. 19, DEVERAUX Q. L., TAKAHASHI R., SALVESEN G. S., REED J. C., X-linked IAP is a direct inhibitor of cell-death proteases. Nature 388, DI CRISTOFANO A., PANDOLFI P. P., The multiple roles of PTEN in tumor suppression. Cell 100, DUMONT C., DURRBACH A., BIDERE N., ROULEAU M., KROEMER G., BERNARD G., HIRSCH F. i wspó³aut., Caspase-independent commitment phase to apoptosis in activated blood T lymphocytes: reversibility at low apoptotic insult. Blood 96, ENARI M., TALANIAN R. V., WONG W. W., NAGATA S., Sequential activation of ICE-like and CPP32-like proteases during Fas- mediated apoptosis. Nature 380,

12 168 ANNA BIELAK- MIJEWSKA FONG W. G., LISTON P., RAJCAN-SEPAROVIC E., ST JEAN M., CRAIG C., KORNELUK R. G., Expression and genetic analysis of XIAP-associated factor 1 (XAF1) in cancer cell lines. Genomics 70, FULDA S., MEYER E., DEBATIN K. M., Inhibition of TRAIL-induced apoptosis by Bcl-2 overexpression. Oncogene 21, FULDA S., MEYER E., FRIESEN C., SUSIN S. A., KROEMER G., DEBATIN K. M., Cell type specific involvement of death receptor and mitochondrial pathways in drug-induced apoptosis. Oncogene 20, GEYER R. K., YU Z. K., MAKI C. G., The MDM2 RING-finger domain is required to promote p53 nuclear export. Nat. Cell. Biol. 2, GOTTLIEB T. M., OREN M., p53 and apoptosis. Semin. Cancer Biol. 8, GREEN D. R., REED J.C., Mitochondria and apoptosis. Science 281, GRZELAKOWSKA-SZTABERT B., Molecular mechanisms of apoptosis induced by activation of membrane receptors from the TNF-R superfamily. Postepy Biochem. 44, GRZELAKOWSKA-SZTABERT B., Participation of viral and cellular IAP proteins in regulation of apoptosis and cell survival. Postepy Biochem. 45, HANAHAN D., WEINBERG R. A., The hallmarks of cancer. Cell 100, HERR I., DEBATIN D. K. M., Cellular stress response and apoptosis in cancer therapy. Blood 98, HICKMAN J. A., Apoptosis and chemotherapy resistance. Eur. J. Cancer 32A, HOFFMAN W. H., BIADE S., ZILFOU J. T., CHEN J., MURPHY M., Transcriptional repression of the anti-apoptotic survivin gene by wild type p53. J. Biol. Chem. 277, HUANG D. C., STRASSER A., BH3-Only proteins-essential initiators of apoptotic cell death. Cell 103, HUANG Y., IBRADO A. M., REED J. C., BULLOCK G., RAY S., TANG C., BHALLA K., Co-expression of several molecular mechanisms of multidrug resistance and their significance for paclitaxel cytotoxicity in human AML HL-60 cells. Leukemia 11, IGNEY F. H., KRAMMER P. H., Death and anti-death: tumour resistance to apoptosis. Nat. Rev. Cancer 2, IRMLER M., THOME M., HAHNE M., SCHNEIDER P., HOFMANN K., STEINER V., BODMER J. L. i wspó³aut., Inhibition of death receptor signals by cellular FLIP. Nature 388, JACOBS J. J., KEBLUSEK P., ROBANUS-MAANDAG E., KRISTEL P., LINGBEEK M., NEDERLOF P. M., VAN WELSEM T. i wspó³aut., Senescence bypass screen identifies TBX2, which represses Cdkn2a (p19(arf)) and is amplified in a subset of human breast cancers. Nat. Genet. 26, JOHNSTONE R. W., CRETNEY E., SMYTH M. J., P-glycoprotein protects leukemia cells against caspase-dependent, but not caspase-independent, cell death. Blood 93, JOHNSTONE R. W., RUEFLI A. A., LOWE S. W., Apoptosis: a link between cancer genetics and chemotherapy. Cell 108, JOHNSTONE R. W., RUEFLI A. A., TAINTON K. M., SMYTH M. J., A role for P-glycoprotein in regulating cell death. Leuk. Lymphoma 38, JOZA N., SUSIN S. A., DAUGAS E., STANFORD W. L., CHO S. K., LI C. Y., SASAKI T. i wspó³aut., Essential role of the mitochondrial apoptosis-inducing factor in programmed cell death. Nature 410, KENNEDY S. G., KANDEL E. S., CROSS T. K., HAY N., Akt/Protein kinase B inhibits cell death by preventing the release of cytochrome c from mitochondria. Mol. Cell. Biol. 19, KIM M. S., KANG H. J., MOON A., Inhibition of invasion and induction of apoptosis by curcumin in H-ras- transformed MCF10A human breast epithelial cells. Arch. Pharm. Res. 24, KIM T. H., ZHAO Y., BARBER M. J., KUHARSKY D. K., YIN X. M., Bid-induced cytochrome c release is mediated by a pathway independent of mitochondrial permeability transition pore and Bax. J. Biol. Chem. 275, KISCHKEL F. C., LAWRENCE D. A., TINEL A., LEBLANC H., VIRMANI A., SCHOW P., GAZDAR A. i wspó³aut., Death receptor recruitment of endogenous caspase-10 and apoptosis initiation in the absence of caspase-8. J. Biol. Chem. 276, KITANAKA C., KATO K., IJIRI R., SAKURADA K., TOMIYAMA A., NOGUCHI K., NAGASHIMA Y. i wspó³aut., Increased Ras expression and caspase-independent neuroblastoma cell death: possible mechanism of spontaneous neuroblastoma regression. J. Natl. Cancer Inst. 94, KLUCK R. M., BOSSY-WETZEL E., GREEN D. R., NEWMEYER D. D., The release of cytochrome c from mitochondria: a primary site for Bcl-2 regulation of apoptosis. Science 275, KONDO S., SHINOMURA Y., MIYAZAKI Y., KIYOHARA T., TSUTSUI S., KITAMURA S., NAGASAWA Y. i wspó³aut., Mutations of the bak gene in human gastric and colorectal cancers. Cancer Res. 60, KRAMMER P. H., CD95(APO-1/Fas)-mediated apoptosis: live and let die. Adv. Immunol. 71, KRUEGER A., BAUMANN S., KRAMMER P. H., KIRCHHOFF S., FLICE-inhibitory proteins: regulators of death receptor-mediated apoptosis. Mol. Cell. Biol. 21, KUWANA T., SMITH J. J., MUZIO M., DIXIT V., NEWMEYER D. D., KORNBLUTH S., Apoptosis induction by caspase-8 is amplified through the mitochondrial release of cytochrome c. J. Biol. Chem. 273, LEE S. H., SHIN M. S., KIM H. S., LEE H. K., PARK W. S., KIM S. Y., LEE J. H. i wspó³aut., Alterations of the DR5/TRAIL receptor 2 gene in non-small cell lung cancers. Cancer Res. 59, LI L. Y., LUO X., WANG X., Endonuclease G is an apoptotic DNase when released from mitochondria. Nature 412, LIU R., PAGE C., BEIDLER D. R., WICHA M. S., NUNEZ G., Overexpression of Bcl-x(L) promotes che-

13 Mechanizmy opornoœci komórek nowotworowych na apoptozê 169 motherapy resistance of mammary tumors in a syngeneic mouse model. Am. J. Pathol. 155, LIU Z., SUN C., OLEJNICZAK E. T., MEADOWS R. P., BETZ S. F., OOST T., HERRMANN J. i wspó³aut., Structural basis for binding of Smac/DIABLO to the XIAP BIR3 domain. Nature 408, LOWE S. W., LIN A. W., Apoptosis in cancer. Carcinogenesis 21, LUO X., BUDIHARDJO I., ZOU H., SLAUGHTER C., WANG X., Bid, a Bcl2 interacting protein, mediates cytochrome c release from mitochondria in response to activation of cell surface death receptors. Cell 94, MAESTRO R., DEI TOS A. P., HAMAMORI Y., KRASNOKUTSKY S., SARTORELLI V., KEDES L., DOGLIONI C. i wspó³aut., Twist is a potential oncogene that inhibits apoptosis. Genes. Dev. 13, MARZO I., BRENNER C., ZAMZAMI N., JURGENSMEIER J. M., SUSIN S. A., VIEIRA H., PREVOST M. C. i wspó³aut., Bax and adenine nucleotide translocator cooperate in the mitochondrial control of apoptosis. Science 281, MEDEMA J. P., SCAFFIDI C., KISCHKEL F. C., SHEVCZENKO A., MANN M., KRAMMER P. H., PETER M. E., FLICE is activated by association with the CD95 death-inducing signaling complex (DISC). EMBO J. 16, MEIJERINK J. P., MENSINK E. J., WANG K., SEDLAK T. W., SLOETJES A. W., DE WITTE T., WAKSMAN G., i wspó³aut., Hematopoietic malignancies demonstrate loss-of-function mutations of BAX. Blood 91, MINN A. J., VELEZ P., SCHENDEL S. L., LIANG H., MUCHMORE S. W., FESIK S. W., FILL M., i wspó³aut., Bcl-x(L) forms an ion channel in synthetic lipid membranes. Nature 385, MIYASHITA T., REED J. C., Tumor suppressor p53 is a direct transcriptional activator of the human bax gene. Cell 80, MOLL U. M., ZAIKA A., Nuclear and mitochondrial apoptotic pathways of p53. FEBS Lett. 493, MORONI M. C., HICKMAN E. S., DENCHI E. L., CAPRARA G., COLLI E., CECCONI F., MULLER H. i wspó³aut., Apaf-1 is a transcriptional target for E2F and p53. Nat. Cell. Biol. 3, MULLER M., WILDER S., BANNASCH D., ISRAELI D., LEHLBACH K., LI-WEBER M., FRIEDMAN S. L. i wspó³aut., p53 activates the CD95 (APO-1/Fas) gene in response to DNA damage by anticancer drugs. J. Exp. Med. 188, MURPHY K. L., KITTRELL F. S., GAY J. P., JAGER R., MEDINA D., ROSEN J.M., Bcl-2 expression delays mammary tumor development in dimethylbenz(a)anthracene-treated transgenic mice. Oncogene 18, NAGATA S., Apoptotic DNA fragmentation. Exp. Cell Res. 256, NAKANO K., VOUSDEN K. H., PUMA, a novel proapoptotic gene, is induced by p53. Mol. Cell. 7, NICHOLSON D. W., ALI A., THORNBERRY N. A., VAILLANCOURT J. P., DING C. K., GALLANT M., GAREAU Y. i wspó³aut., Identification and inhibition of the ICE/CED-3 protease necessary for mammalian apoptosis. Nature 376, NICHOLSON D. W., THORNBERRY N. A., Caspases: killer proteases. Trends Biochem. Sci. 22, NOTARBARTOLO M., CERVELLO M., DUSONCHET L., CUSIMANO A., D ALESSANDRO N., Resistance to diverse apoptotic triggers in multidrug resistant HL60 cells and its possible relationship to the expression of P- glycoprotein, Fas and of the novel anti-apoptosis factors IAP (inhibitory of apoptosis proteins). Cancer Lett. 180, ODA E., OHKI R., MURASAWA H., NEMOTO J., SHIBUE T., YAMASHITA T., TOKINO T. i wspó³aut., Noxa, a BH3-only member of the Bcl-2 family and candidate mediator of p53-induced apoptosis. Science 288, O GORMAN D. M., COTTER T. G., Molecular signals in anti-apoptotic survival pathways. Leukemia 1, PATEL T., GORES G.,J.KAUFMAN S. H., The role of proteases during apoptosis. Faseb J. 10, RAVAGNAN L., GURBUXANI S., SUSIN S. A., MAISSE C., DAUGAS E., ZAMZAMI N., MAK T. i wspó³aut., Heat-shock protein 70 antagonizes apoptosis-inducing factor. Nat. Cell Biol. 3, REED J. C., Bcl-2 family proteins. Oncogene 17, REED J. C., Dysregulation of apoptosis in cancer. J. Clin. Oncol. 17, ROSSE T., OLIVIER R., MONNEY L., RAGER M., CONUS S., FELLAY I.., JANSEN B., i wspó³aut., Bcl-2 prolongs cell survival after Bax-induced release of cytochrome c. Nature 391, ROY N., DEVERAUX Q. L., TAKAHASHI R., SALVESEN G. S., REED J. C., The c-iap-1 and c-iap-2 proteins are direct inhibitors of specific caspases. Embo J. 16, ROYMANS D., SLEGERS H., Phosphatidylinositol 3-kinases in tumor progression. Eur. J. Biochem. 268, RUFFOLO S. C., BRECKENRIDGE D. G., NGUYEN M., GOPING I. S., GROSS A., KORSMEYER S. J., LI H. i wspó³aut., BID-dependent and BID-independent pathways for BAX insertion into mitochondria. Cell Death Differ. 7, RUTH A. C., RONINSON I. B., Effects of the multidrug transporter P-glycoprotein on cellular responses to ionizing radiation. Cancer Res. 60, RYAN K. M., PHILLIPS A. C., VOUSDEN K. H., Regulation and function of the p53 tumor suppressor protein. Curr. Opin. Cell. Biol. 13, SAKAHIRA H., ENARI M., NAGATA S., Cleavage of CAD inhibitor in CAD activation and DNA degradation during apoptosis. Nature 391, SAKAHIRA H., ENARI M., OHSAWA Y., UCHIYAMA Y., NAGATA S., Apoptotic nuclear morphological change without DNA fragmentation. Curr. Biol. 9, SAMALI A., COTTER T. G., Heat shock proteins increase resistance to apoptosis. Exp. Cell Res. 223,